LAPORAN RESMI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGIPRAKTIKUM VIIUji Aktivitas
Antimikroba : Metode Dilusi Padat
Disusun Oleh :Nama / NIM: 1. Nimas Ayu / 10129 2. Almira
Rahmayani / 10132 3. Bambang Hidayat / 10135 4. Siti Muntadliroh /
10138 5. Retika Gien Syaputri / 10141Kelas / Golongan: B /
IVTanggal Praktikum: 4 Mei 2015Dosen Jaga: Asisten :
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASIBAGIAN BIOLOGI FARMASIFAKULTAS
FARMASIUNIVERSITAS GADJAH MADAYOGYAKARTA2015A. TujuanSetelah
melakukan praktikum ini mahasiswa diharapkan dapat menentukan kadar
hambat minimum dan kadar bunuh minimum dari suatu sampel terhadap
mikroba uji.
B. Dasar TeoriAntibiotika adalah senyawa kimia khas yang
dihasilkan oleh organisme hidup, termasuk turunan senyawa dan
struktur analognya yang dibuat secara sintetik, dan dalam kadar
rendah mampu menghambat proses penting dalam kehidupan satu spesies
atau lebih mikroorganisme. (Soekardjo dkk, 200)Hal yang paling
penting mengenai konsep antimikrobia adalah selective toxicity
yaitu selektif dalam menghambat pertumbuhan organisme tanpa merusak
inang. Toksisitas selektif tergantung kepada struktur yang dimiliki
sel bakteri dan manusia misalnya dinding sel bakteri yang tidak
dimiliki oleh sel manusia, sehingga antibiotik dengan mekanisme
kegiatan pada dinding sel bakteri mempunyai toksisitas selektif
relatif tinggi. (Ganiswarna, 1995)Berdasarkan toksisitas selektif
ada antibakteri yang bersifat bakteriostatik dan bakterisid.
Kelompok yang pertama menghambat pertumbuhan atau perkembangan
bakteri, kelompok yang kedua bekerja mematikan bakteri. Bakterisid
merupakan antibiotik yang mempengaruhi pembentukan dinding sel atau
permeabilitas membran, sedang bakteriostatik adalah antibiotik yang
bekerja pada sintesa protein. Antibakteri tertentu aktivitasnya
dapat meningkat dan bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar
antibakterinya ditingkatkan melebihi KHM. (Setiabudi, 1995)Kadar
Hambat Minimal (KHM) atau Minimum Concentration (MIC) adalah kadar
minimal yang digunakan untuk menghambat pertumbuhan bakteri
sedangkan konsentrasi terendah dari antibiotik yang membunuh 99,9%
inokulum bakteri disebut Kadar Bunuh Minimal (KBM) atau Minimum
Killing Concentration (MCK). (Brander, 1991)Mekanisme kerja
sebagian besar antibiotik dapat dibagi menjadi 5 cara :1.
Menghambat pembentukan dinding sel, contoh: penisilin, ampisilin,
metsilin, sefalosforin.2. Mengganggu pembentukan membran sel,
contoh : polimiksin B.3. Menghambat sintesis protein, contoh:
streptomisin, gentamisin, kloramfenikol.4. Menghambat sintesis asam
nukleat, contoh : siprofloksazin, nifampin.5. Antagonis metabolit,
contoh : isoniazid.6. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas
antimikroba yaitu pH lingkungan, komponen-komponen perbenihan,
stabilitas obat, besarnya inokulum bakteri, masa pengeraman, dan
aktivitas metabolik mikroorganisme. (Jawetz et al., 1995)Metode
dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution) dan
dilusi padat (solid dilution). Metode dilusi cair (broth dilution)
mengukur MIC (Minimum Inhibitory Concentration) atau KHM (Kadar
Hambat Minimum) dan MBC (Minimum Bactericidal Concentration atau
Kadar Bunuh Minimum, KBM). Metode dilusi padat (solid dilution)
serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan metode padat.
Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang
di uji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji (Pratiwi,
2008).Pada metode dilusi cair, masing-masing konsentrasi
antimikroba obat antibiotik ditambah suspensi bakteri, sedang dalam
dilusi padat pada tiap konsentrasi dicampur dengan media agar lalu
ditanam bakteri, diinkubasi 24 jam.Pada dilusi padat, prinsipnya
adalah sejumlah antimikroba diencerkan hingga diperoleh beberapa
konsentrasi. Pada dilusi padat tiap konsentrasi obat dicampur dalam
media agar, lalu ditanami bakteri dan diinkubasi. Setelah masa
inkubasi selesai, diperiksa konsentrasi berapa obat dapat
menghambat pertumbuhan atau mematikan mikroba. (Pelczar,
1988).Keuntungan dari metode dilusi padat adalah bisa menguji lebih
dari satu mikroba uji dalam setiap cawan petri, sedang kelemahannya
adalah sulit membedakan antara aktivitas penghambat (KHM) atau
mematikan mikroba uji (KBM). Sedangkan pada dilusi cair memiliki
keuntungan dapat ditentukan KHM dan KBM secara jelas, sedangkan
kerugiannya adalah hanya dapat menguji satu mikroba uji dalam
setiap cawan petri.Bakteri yang diamati praktikan pada praktikum
ini adalah sebagai berikut.1. Staphylococcus aureusStaphylococcus
aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulatberdiameter
0,7-1,2 m, tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak
teraturseperti buah anggur, fakultatif anaerob, tidak membentuk
spora, dan tidakbergerak. Bakteri ini tumbuh pada suhu optimum 37
C, tetapimembentuk pigmen paling baik pada suhu kamar (20-25 C).
Koloni padaperbenihan padat berwarna abu-abu sampai kuning
keemasan, berbentuk bundar,halus, menonjol, dan berkilau. Lebih
dari 90% isolat klinik menghasilkan S.aureus yang mempunyai kapsul
polisakarida atau selaput tipis yang berperandalam virulensi
bakteri (Jawetz et al., 1995 ; Novick et al., 2000)
Ilustrasi Bakteri Staphylococcus aureus
2. Eschericia ColiE. coli adalah adalah salah satu jenis spesies
utama bakteri gram negatif. berbentuk batang pendek yang memiliki
panjang sekitar 2 m, diameter 0,7 m, lebar 0,4-0,7m dan bersifat
anaerob fakultatif. E. coli membentuk koloni yang bundar, cembung,
dan halus dengan tepi yang nyata. (Smith-Keary, 1988 ; Jawetz et
al., 1995). Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor
Escherich ini dapat ditemukan dalam usus besar manusia. Kebanyakan
E. Coli tidak berbahaya, tetapi beberapa, seperti E. Coli tipe
O157:H7, dapat mengakibatkan keracunan makanan yang serius pada
manusia. E. Coli yang tidak berbahaya dapat menguntungkan manusia
dengan memproduksi vitamin K2, atau dengan mencegah bakteri lain di
dalam usus (Anonim, 2011).Ilustrasi bakteri E.coliMinyak atsiri
adalah suatu substansi alami yang telah dikenal memilikiaktivitas
sebagai antibakteri. Bahkan minyak atsiri cengkeh telah digunakan
sejaklama di berbagai rumah sakit Eropa untuk mengatasi infeksi
Mycobacteriumtuberculosis (Yulliasri dkk., 2000). Minyak atsiri
dapat menghambat beberapa jenis bakteri merugikan seperti
Escherichia coli, Salmonella sp, Staphylococcus aureus,Klebsiella,
dan Pasteurella (Agusta, 2000). Dilaporkan dalam berbagai
penelitian bahwa minyak cengkeh adalah mengandung eugenol, ketika
diuji pada beberapa jenis bakteri memiliki sifat antibakteri dan
memperlihatkan penghambatan pada L. monocytogenes, Campylobacter
jejuni, S.enteridis, E.coli dan S.aureus (Beuchat, 2000; Cressy et
al., 2003; Smith-Palmer et al., 1998). Selanjutnya ditambahkan oleh
Frosch et al., (2002) bahwa penelitian terbaru menunjukkan
aktivitas antibakteri minyak cengkeh dapat menghambat pertumbuhan
bakteri patogen : A. actinomycetemcomitans, P. intermedia,
P.melaninogenica, P. gingivalis, C. gingivaiis and F. nucleatum.
Juga mampu menghambat pertumbuhan Candida albicans, Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, dan Staphylococcus aureus. Dilaporkan
oleh Smith et al.,(1998 dan 2001) bahwa minyak cengkeh efektif
menghambat L. monocytogenes dan S. enteridis dalam TSB dan
keju.
C. Alat dan BahanAlat: Cawan petri Tabung reaksi Mikropipet dan
yellow tip Glass spreader Mikropipet dan tips Eppendorf Lampu
spiritus Korek api
Bahan: Minyak atsiri : adas dan cengkeh Pelarut DMSO Media NA
atau Mueller Hilton Mikroba (Staphlococcus aureus dan Eschericia
coli)
D. Cara KerjaSampel uji (minyak atsiri kadar 205 v/v dalam DMSO)
dibuat 6 kadar seri pengenceran kadar kelipatan secara aseptis
Disiapkan kontrol uji
Pembuatan kontrol uji dan pembuatan seri kadar dilakukan seperti
pada P-6
Dari setiap seri pengenceran diambil 1 ml untuk kemudian
ditambahkan 9 ml media agar Mueler Hinton di dalam petri, kemudia
digoyang dan dibiarkan memadat. 1 cawan petri untuk 1 kadar
Didapat 1 seri 6 petri media yang sudah padat, kemudian dibagi
media menjadi 2 bagian dengan cara menggaris bagian bawah cawan
dengan spidol
Digoreskan 1 ose suspensi bakteri yang berbeda pada setiap
bagian. Bakteri uji yang digunakan adalah E. Coli dan S. Aureus
Diinkubasi selama 24 jam
Diamati koloni bakterinya
E. Hasil PengamatanSeri kadar 1% SA: terbentuk koloni,
keruhE.coli : terbentuk koloni, keruhKoloni terbentuk paling
sedikit pada seri kadar ini.
Seri kadar 0,5% SA: terbentuk koloni, keruhE.coli : terbentuk
koloni, keruh
Seri kadar 0,25% SA: terbentuk koloni, keruhE.coli : terbentuk
koloni, keruh
Seri kadar 0,125% SA: terbentuk koloni, keruhE.coli : terbentuk
koloni, keruh
Seri kadar 0,0625% SA: terbentuk koloni, keruhE.coli : terbentuk
koloni, keruh
F. PembahasanTujuan praktikum ini adalah menentukan kadar hambat
minimum dan kadar bunuh minimum dari suatu sampel terhadap mikroba
uji. Dalam praktikum ini, digunakan 1 macam ekstrak tumbuhan, yaitu
minyak atsiri Langkah pertama adalah membuat larutan stok dari
minyak atsiri sebanyak 50 l dalam metanol 500 l dan dimasukkan ke
dalam eppendorf menggunakan mikropipet dan yellow tip. Minyak
atsiri inilah yang memiliki aktivitas antimikroba atau fungistatik.
Setelah itu diambil 30 l larutan stok tersebut dan diencerkan 1470
l akuades di dalam eppendorf kedua sehingga diperoleh sampel uji
yang mengandung 1% v/v minyak atsiri. Lalu diambil 750 dari sampel
uji 1% v/v minyak atsiri tersebut dan dimasukkan ke eppendorf
ketiga sehingga diperoleh sampel uji yang mengandung 0,5% v/v
minyak atsiri Dengan cara yang sama dibuat sampel uji yang
mengandung; 0,25% ; 0,125% ; 0,0625% v/v minyak atsiri. Pada seri
0,0625% dibuang 750 l juga, sehingga menghasilkan suatu buangan,
agar semua seri pengenceran memiliki volume yang sama yaitu 750 l.
Setelah itu, atau bisa dilakukan sembari melakukan seri untuk
menghemat waktu, dicairkan media agar NA dengan cara memanaskannya
di atas kompor listrik. Setelah mencair, lalu ditunggu hingga
suhunya sudah tidak terlalu tinggi dan cukup dingin. Setelah
semuanya siap langkah berikutnya dilakukan di dalam LAF (Laminair
Air Flow) secara aseptik. Lalu dibagi permukaan petri menjadi 2
bagian dengan menggaris bagian bawah petri dengan spidol untuk
menguji 2 bakteri, yaitu Staphylococcus aureus dan Escherichia
coli. Setelah itu, masing-masing eppendorf yang berisi hasil
pengenceran minyak atsiri dituangkan seluruh volumenya ke masing-
masing cawan petri yang totalnya berjumlah 5 cawan petri. Sebelum
diisi seri pengenceran, masing-masing cawan petri diberi dulu media
agar NA sebanyak 9 ml. Setelah semua media dalam cawan petri
memadat, kemudian digoreskan suspensi bakteri uji yang berbeda
untuk setiap bagian bakteri uji yang digunakan dalam larutan salin
menggunakan ose yang dipanaskan dahulu mengguakan bunsen sampai
merah membara untuk menghindari kontaminasi. Menggoreskan suspensi
bakteri dilakukan dengan arah zig-zag agar mempermudah dalam
mengetahui koloni bakteri yang akan diamati. Kemudian diinkubasi
selama 24 jam pada suhu 37C yang merupakan suhu yang optimum untuk
pertumbuhan bakteri.Setelah diinkubasi dalam inkubator selama 24
jam pada suhu 37C, cawan petri dikeluarkan dan diamati. Pada
pengamatan, terlihat adanya permukan jernih dan keruh. Jika
terdapat koloni bakteri (keruh) pada bagian yang digoreskan maka
bakteri tersebut resisten terhadap sampel uji yaitu minyak atsiri
dari cengkeh. Dan jika tidak terdapat koloni bakteri pada bagian
yang digoreskan suspensi bakteri maka bakteri tersebut tepengaruh
oleh adanya antibiotik pada sampel uji dan media.Hasil yang
diperoleh adalah adanya koloni bakteri di masing-masing cawan
petri. Dengan hasil kadar pengenceran 1% mempunyai koloni bakteri
yang paling sedikit. Hal ini dapat menunjukkan minyak atsiri yang
digunakan memberikan hasil negatif terhadap uji aktivitas
antimikroba. Hal ini tidak sesuai dengan teori karena minyak atsiri
telah sudah lama dikenal memiliki aktivitas sebagai antibakteri.
Ketidaksesuain praktikum dengan teori dapat dikarenakan adanya
ketidaktelitian dan ketidakcermatan praktikan dalam percobaan,
seperti kesalahan jumlah pengambilan sampel dengan mikropipet,
proporsi media NA yang lebih banyak sehingga kadar minyak atsiri
menjadi sangat kecil dan sulit menunjukkan aktivitas antimikroba
yang dimiliki, ataupun hal lain yang praktikan tidak sadari.G.
Kesimpulan1. Uji aktivitas antimikroba pada praktikum ini
menggunakan metode dilusi padat2. Metode dilusi padat memiliki
keuntungan dapat menguji lebih dari satu mikroba uji dalam setiap
cawan petri dan kelemahannya adalah sulit membedakan antara
aktivitas penghambatan dan mematikan mikroba uji.3. Sampel
antimiroba yang dipakai adalah minyak atsiri dan mikroba uji yang
digunakan adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.4.
Hasil menunjukkan minyak atsiri yang digunakan memberikan hasil
negatif terhadap uji aktivitas antimikroba karena masih adanya
koloni bakteri di masing-masing cawan petri.
H. Daftar PustakaBrander, G.C., Pugh, D.M., Baywater, R.J., and
Jenkins, W.C., 1991. Veterinary Applied Pharmacology and
Therapeutics 5th ed, The English Book Society and Baillere Tindal,
London.Beuchat, L. R. 2000, Control of Foodborne Pathogens and
Spoilage Microorganisms by Naturally Occurring Antimicrobials. In
C. L.Wilson & S. Droby (Eds.), Microbial Food Contamination.
Boca Raton, FL: CRC Press. pp. 149169Cressy, H. K., Jerrett, A. R.,
Osborne, C. M., & Bremer, P. J, 2003, A Novel Method for the
Reduction of Numbers of Listeria Monocytogenes Cells by Freezing in
Combination with an Essential Oil in Bacteriological Media, J. of
Food Protection, 66, 390395.Frosch, P. J. , J.D. Johansen, T. Menn,
C. Pirker, S.C. Rastogi, K.E, 2002, Essesnsial oil and antimicrobia
review, Vol. 47(5): 279-287, Nov 2002.Ganiswara, 1995, Farmakologi
dan Terapan Edisi IV, Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran,
Universitas Indonesia, Jakarta.Jamal, Yuliasri dan Agusta, 2000,
Komposisi Kimia Minyak Atsiri Neolitsea cassia dan Nectandra
angustifolia (Lauraceae), Prosiding Seminar PERHIPBA Pemanfaatan
Obat Alami IIIJawetz, E., J.L. Melnick., E.A. Adelberg., G.F.
Brooks., J.S. Butel., dan L.N. Ornston. 1995. Mikrobiologi
Kedokteran. Edisi ke-20 (Alih bahasa : Nugroho & R.F.Maulany),
Penerbit Buku Kedokteran EGC, JakartaPratiwi, 2008, Uji Aktivitas
Anti Mikroba, http://etd.ugm.ac.id/index.php?, diakses pada tanggal
10 Mei 2015, pukul 8.15Setiabudy, R dan Gan, V.H.S. 1995,
Farmakologi dan Terapi, Edisi Keempat, Bagian Farmakologi Fakultas
Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta.Smith-Palmer, A.,
Steward, J., & Fyfe, L, 1998, Antimicrobial Properties of Plant
Essential Oil and Essences Against Five Important Food-borne
Pathogen, Letters in Applied Microbiology (26) : 118122.Soekardjo,
B., Hardjono, S., Sondakh, R., 2000, Kimia Medisinal, Edisi Kedua,
Airlangga University Press, Surabaya.
Mengetahui,Yogyakarta, 16 Maret 2015Asisten Koreksi
Praktikan