1 PCR en tiempo real PCR en tiempo real Monitorización de la amplificación Evaluación de los productos de amplificación ¿Qué se hace en la Real time PCR? PCR en tiempo real PCR en tiempo real ¿Qué se hace en la Real time PCR? OBJETIVO: estimar la cantidad inicial de un DNA diana La PCR en tiempo real detecta la fluorescencia emitida en cada ciclo con un mecanismo que genera un señal fluorescente proporcional a la cantidad de diana amplificada. Principios: • Se basa en un agente fluorescente ( reporter ) • El primer incremento significativo de la candidad de producto de PCR ( ciclo Ct) correlaciona con la cantidad inicial de diana. PCR en tiempo real 2 1 3 2 Curvas de fusión Aplicaciones
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
PCR en tiempo realPCR en tiempo real
Monitorización de la amplificación
Evaluación de los productos de amplificación
¿Qué se hace en la Real time PCR?
PCR en tiempo realPCR en tiempo real
¿Qué se hace en la Real time PCR?
OBJETIVO: estimar la cantidad inicial de un DNA diana
La PCR en tiempo real detecta la fluorescencia emitida en cada ciclo con un mecanismo que genera un señal fluorescente proporcional a la cantidad de diana amplificada.
Principios:
• Se basa en un agente fluorescente ( reporter )
• El primer incremento significativo de la candidad de producto de PCR ( ciclo Ct) correlaciona con la cantidad inicial de diana.
PCR en tiempo real
21 32
Curvas de fusión
Aplicaciones
2
PCR en tiempo real
450 500 550 600 650 700 750 800 850
Wavelength nm
Fluorescein
Hex
Red 610
Red 640
Cy5
Red 705
Ch 1530 nm
Ch 2555 nm
Ch 3610 nm
Ch 4640 nm
Ch 5670 nm
Ch 6710 nm
Marcadores inespecificos( SybrGreen)
Sondas
Tipos de marcadores
PCR en tiempo real
Fluorescencia
PCR en tiempo real
Marcadores inespecíficos
SYBRGreen®
El SYBR green es una molécula que se une específicamente al DNA de doble cadena, incrementando de manera muy importante su florescencia. Durante la fase de extensión, mas y mas DNA se unirá al producto de PCR incrementándose el señal. En cada ciclo de PCR se genera un señal mayor. .
3
PCR en tiempo real
SYBRGreen®
Marcadores inespecíficos
PCR en tiempo real
SYBRGreen®
Marcadores inespecíficos
• Emite un fuerte señal al unirse al DNA
• Es una unión inespecífica
• Requiere una extensiva optimización
• Permite hacer análisis de curvas de fusión
• Amplicones largos generan señales mayores
• Es mucho mas económico que trabajar con sondas
• Una buena opción para secreening o para análisis en los que se conoce muy bien el tipo de muestra.
PCR en tiempo real
Sondas FRET, Fluorocromo-Reporter
Hyb Probes
Sondes de Quencher-Reporter:
Taqman ( hidrólisis)
Molecular Beacons
Scorpion
Eclipse
Sondas Lux
…plexor, Universal probeLib.
Marcadores específicos
4
PCR en tiempo real
• Fluorochrome+Reporte = light emission• Both molecules have to be very close together for the reporter to
absorb the emitted fluorescence
F R F
NO light
LightR F R
F R F R F R
Fluorocromo & Reporter
Sondas Fluorocromo-Reporter
PCR en tiempo real
Hybridization probes
PCR en tiempo real
Sondas de Hibridación (Hyb Probes) FRET
FluoresceinLC Red
Hybridization probes
5
PCR en tiempo real
• Sondas Hidrólisis: TaqMan
• Sondes de Reporter-Quencher (no hidrólisis):Molecular BeaconsScorpionEclipse
Sondas Fluorocromo-Quencher
PCR en tiempo real
• Un fluorocromo es una molécula que absorbe la luz de una longitud de onda específica y emite luz (la fluorescencia) de una longitud de onda más baja
• Un quencher es una molécula que absorbe la luz emitida por un fluorocromp
F Q F Q
light
F Q
Fluorocromo- Quencher: fundamento
Fluorocromo & Quencher
PCR en tiempo real
• Fluorochrome+quencher = no light emission• Both molecules have to be very close together for the quencher to
absorb the emitted fluorescence
F Q F Q
light
F Q
F Q F Q
light
F Q
NO light
Light
Fluorocromo & Quencher
Fluorocromo- Quencher: fundamento
6
PCR en tiempo real
• A specific probe that will hybridize within the amplified product
– It requires the identification of a third signature sequence
• Probe is labeled with a F and a Q
• The 5’-exonuclease activity of the Taqpolymerase hydrolyze the probe, releasing the F from the Q
Sondas Taqman
PCR en tiempo real
Sondas de Hidrólisis (TaqMan Probes)
reporter quencher
Sondas Taqman
PCR en tiempo real
Elcipse probes
-Son similares a las sondasTaqman, pero sin hidrólisis
- Presentan bases modificadas y MGB, que mejoran el funcionamieno de la sonda e incrementan su Tm
7
PCR en tiempo real
Molecular Beacons
– Contiene un F y un Q
– La hairpin structure acerdaF y el Q si estan en disolución
– En la fase de hibridizaciónla sonda se une a su diana
• No se destruye durante la reacción
• En cada cilo se une a sudiana
PCR en tiempo real
Molecular Beacons
F-Q interaction is based on FRET ‘fluorescence resonance energy transfer’
PCR en tiempo real
-Son verdaderamentebifuncionales, actuan como primer y sonda ( a diferencia de las lux). Mantienen el doble nivelde especificidad.
- Señales más estables y intensos, tiempos de reaccióncortos y discriminacionesexcelentes.
- Diseño complejo
Scorpion probes
8
PCR en tiempo real
Scorpion probes
http://www.dxsgenotyping.com/0608.swf
PCR en tiempo real
Comparación de curvas de PCR usando diferentes marcadores.
The unique combination of online available assay design software andonly 165 prevalidated, real-time PCR probes allows to quantify virtually anytranscript in the transcriptomes of a large number of organisms.