(13)Pemulihan (Bahan Aajar)1

1

PEMULIHAN DAN PEMURNIAN PRODUK FERMENTASI

MAHRENI

2

Apa yang harus anda pertimbangkan ketika menjumpai proses pemulihan dan pemurnian produk industri bioteknologi? Tujuan industri bioteknologi adalah untuk memperoleh produk kualitas tinggi dengan efisien biaya minimal. Walaupun demikian, kisaran biaya pemuliah dan pemurnian hasil fermentasi berkisar diantara 15% sampai dengan 70% dari total biaya produksi. Biaya pemulihan dan pemurnian tergantung kepada jenis produk yang akan dihasilkan. Untuk produksi etanol hanya sekitar 15% dan untuk produksi enzim kira kira sampai 70% dari biaya produksi.

Tujuan pemulihan dan pemurnian

3

Hasil analisis terhadap produk fermentasi yang baru saja dipanen menunjukkan dua hal yaitu:

Konsentrasi sangat rendah diantara 5-15%. Terdiri dari sel mukrobia, bagian bagian sel yang terfragmentasi dan produk metabolit.

Mungkin produk metabolit adalah produk intra seluler yang labil dan dapat dengan mudah terdekomposisi oleh adanya komponen komponen sel.

Sehingga dalam merancang alat alat pemurnian produk fermentasi harus cermat sehingga ukuran dan jenis alat dapat digunakan untuk memisahkan produk dengan baik.

Spesifikasi produk fermentasi

4

Pemilihan alat pemulihan dan pemurnian produk fermentasi didasarkan kepada :

Produk fermentasi berada di dalam sel (intraseluler) atau di luar sel (ekstraseluler).

Berapa konsentrasi produk di dalam kaldu fermentasi. Sifat fisika dan kimia produk yang diinginkan (untuk

membantu dalam pemilihan alat pemisah dan pemurni). Tujuan penggunaan produk. Derajat kemurnian produk mengacu pada standar yang

ditetapkan. Jumlah komponen beracun yang ada di dalam kaldu

fermentasi. Jumlah pengotor yang ada di dalam kaldu fermentasi. Harga produk di pasaran.

Dasar pemilihan alat alat pemisah

5

Tahap pertama pemulihan dan pemurnian hasil metabolit ekstraseluler adalah pemisahan komponen padat yang terdiri dari sel dan molekul besar menggunakan sentrifugasi dan filtrasi.

Tahap berikutnya adalah fraksinasi komponen komponen yang ada di dalam filtrate hasil filtrasi atau hasil sentrifugasi. Alat alat yang digunakan di dalam proses frkasinasi adalah: ultra filtrasi, reverse osmosis, adsorpsi/penukar ion/ filtrasi gel dan kromatografi afinitas, ekstraksi fasa cair-cair dan ekstrasi dua fasa (presipitasi).

Produk hasil fraksinasi dimurnikan dengan cara pengendapan bertahap.

Setelah dimurnikan masih ada proses lanjut yaitu memisahkan pengotor dengan menggunakan alat pemisah kromatografi yang mempunyai selektivitas tinggi atau dengan cara kristalisasi.

Tahap tahap pemulihan produk ekstra seluler:

6

Kaldu fermentasi

Pemisahan sel (filtrasi atau sentrifugasi) Sel (padatan)

Filtrat terdiri dari bermacam macam jenis komponen

Pengendapan bertahap menggunakan anti solvent

Fraksinasi komponen (ultra filtrasi, RO, adsorpsi/penukar ion, dll)

Endapan (produk utama) belum memenuhi standar

Filtrat (produk samping)

Isolasi produk menggunakan alat pemisah krpmatografi selektivitas tinggi

Penguapan vakum atau kristalisasi

Produk dengan kemurnian tinggi sesuai standar

Permeat

Retentat (hasil samping)

7

Proses pemisahan produk fermentasi yang ideal. Pemisahan yang ideal : Removal of insoluble , Isolation of product, Purification, Polishing.

8

StepTipe

pemisahanKonsentr

asi (g/l)Kualitas

(%)Pemanena

n hasilFerment

asi0,1-5 0,1-1,0

Pemisahan komponen tidak larut

Filtrasi 1,0-5 0,2-2,0

Isolasi Ekstraksi 5-50 1-10Purifikasi Kromato

grafi50-200 50-80

Finishing Kristalisasi

50-200 90-100

9

Pemisahan komponen tidak larut: Apabila produk ada di dalam sel, maka

sel harus dipecah dulu baru produknya diisolasi. Dua alat yang selalu digunakan di dalam pemisahan komponen tidak larut dalam kaldu fermentasi adalah sentrifugas dan filtrasi.

10

Filtrasi dapat memisahkan padatan dari cairan dengan menekan cairan melalui media penyaring (filter). Filtrasi adalah metode sederhana untuk memisahkan Kristal dari cairan. Namun karena sel mempunyai ukuran kecil dan deformabilitas mikroorganisme membuat penyaringan bir fermentasi jauh lebih rumit. Hal ini menyebabkan penyaringan produk fermentasi menggunakan filtrasi konvensional memerlukan waktu yang relative lama dibandingkan dengan waktu yang diperlukan untuk menyaring produk kimia.

Filtrasi

11

Dalam bab ini akan dijelaskan mengenai dua tujuan yang akan dicapai pada penyaringan produk fermentasi yaitu:

(1) bagaimana caranya agar supaya alat penyering konvensional dapat digunakan di dalam penyaringan kaldu fermentasi untuk memisahkan sel dari campuran hasil fermentasi,

(2) Modifikasi proses filtrasi kaldu fermentasi dengan media filter aid untuk membentuk agregat dengan sel sehingga membentuk partikel yang lebih besar dan waktu penyaringan lebih cepat. Tidak semua padatan yang tidak larut di dalam kaldu fermentasi dapat dipisahkan secara langsung menggunakan alat filtrasi. Sebagai bahan bantu adalah tanah diatom.

Filter aid

12

Kaldu fermentasi dan produk produk biologi lainnya terkenal sangat susah untuk dipisahkan menggunakan alat filtrasi. Karena kental atau padatan yang menempel pada saringan sangat kuat melekat pada permukaan media penyaring. Terutama untuk mikroorganisme yang berbentuk miselia tetapi sebagian bakteri juga sama. Sehingga beberapa produk biologi harus diberi perlakuan khusus sebelum dilakukan penyaringan. Ada tiga macam perlakuan pendahuluan terhadap kaldu fermentasi yaitu: (1) pemanasan, (2) koagulasi dan flokulasi dan (3) adsorpsi menggunakan tanah diatom (filter aid). Perlakuan pendahuluan tersebut dapat juga digunakan untuk memudahkan pemisahan padatan tak larut menggunakan cara sentrifugasi atau sedimentasi (pengendapan).

Perlakuan pendahuluan sebelum dilakukan filtrasi:

13

Perlakuan pendahuluan yang sederhana adalah memanaskan kaldu fermentasi. Tujuan pemanasan disamping untuk meningkatkan ksrakteristik kaldu fermentasi di dalam transportasi juga untuk pasteurisasi. Hasilnya adalah produk stabil terhadap panas. Kenapa pemanasan dapat merubah sifat kaldu fermentasi. Jawabannya sangat kompleks. Sebagai contoh kaldu fermentasi yang mengandung ovalbumin di dalam larutan. Apabila kita memanaskan kaldu fermentasi yang di dalam larutannya mengandung ovalbunin, maka protein tersebut terdenaturasi dan lebih mudah untuk memisahkan protein tersebut tetapi ovalbumin tidak dapat kembali seperti semula setelah dipanaskan.

Pemanasan.

14

Metode perlakukan pendahuluan yang kedua adalah koagulasi dan flokulasi. Koagulan yang digunakan adalah polielektrolit untuk menstimulasi terjadinya koagulasi dan flokulasi.

Reagensia sebagai polielektrolit dari yang bersifat asam, basa atau polielektrolit sintetis. Elektrolit dapat berperan sebagai bahan destabilisasi muatan ion yang sama di dalam koloid. Atau penetralisir gaya repulsive elektrostatik antar partikel koloid. Apabila besarnya gaya repulsive antar partikel berkurang gaya atraksi London- van der waals akan dominan dan koloid dapat dikoagulasi sebagai pertikel yang besar, padat dan mudah untuk disaring.

Asam dan basa akan merubah pH dan akan menurunkan muatan partikel. Kalau muatan partikel berkurang, maka pertikel dapat dikoagulasi dan lebih memudahkan untuk disaring. Apabila muatannya bertambah maka partikel akan lebih sukar untuk disaring.

Koagulasi dan flokulasi.

15

Peranan polielektrolit sintetis disamping dapat untuk menurunkan gaya repulsive elektrostatik juga dapat berperan sebagai adsorben terhadap partikel tertentu dan menjadi jembatan diantara partikel untuk saling menyatu menjadi partikel yang lebih besar. Hasilnya partikel koloid akan menjadi flok flok yang besar dan mudah untuk disaring. Polielektrolit bisa bersifat ionic (anionic atau kationik) atau nonionic. Polielektrolit yang komersial diantaranya adalah: polyacrylamide, polyethylenimines, derivativv dari poly amines. Plyelektrolit kimia diantaranya adalah feri klorida, atau alum yang biasa digunakan di dalam pengolahan air limbah. Akan lebih efektive apabila digunakan bersama sama dengan polielektrolit.

16

Cara yang ketiga dalam perlakuan pendahuluan adalah penambahan bahan filter aid (bahan pembantu penyaringan) dan ditambahkan langsung ke dalam kaldu fermentasi. Koloid (biomasa) akan melekat dipermukaan filter aid dan oleh karena itu akan lebih mudah untuk dipisangkan secara filtrasi. Terutama pada produk fermentasi yang mengandung sel berbentuk miselia, miselia yang terfragmentasi atau sel bakteri akan terserap ke permukaan filter aid dan akan menempel di permukaan filter. Dua macam filter aid yang telah dikenal luas adalah tanah diatome dan perlites. Tanah diatome adalah fosil tanamab kecil di laut sedangkan perlites adalah batuan vulkanik.

Adsorpsi di permukaan filter aid

17

Sebagai catatan apabila di dalam kaldu fermentasi mengandung aminoglycosidic antibiotic tidak boleh menggunakan tanah diatome karena bersifat asam, maka antibiotic akan melekat pada tanah diatome dan tidak dapat dilepaskan. Maka akan lebih baik sebelum memutuskan untuk menambahkan filter aid ke dalam kaldu fermentasi sebagai perlakuan awal sebelum filtrasi, perlu dilakukan percobaan pendahuluan.

18

Setelah pemisahan komponen tidak larut yang biasanya komponen tidak larut adalah sel menggunakan alat filtrasi atau sentrifugasi: Pada beberapa masalah komponen yang diinginkan ada di dalam sel. Ada kalanya ada diluar sel. Antibiotik biasanya ada di luar sel atau produk ekstra seluler. Enzim ekstra seluler ada di luar sel dan polisakarida serta asam amino biasanya ada di luar sel. Pada masalah ini sel dianggap sebagai hasil samping.

Pemecahan dinding sel

19

Pada beberapa masalah, produk yang diinginkan ada di dalam sel. Sering dalam praktek banyak protein dihasilkan menggunakan mikroorganisme hasil rekayasa genetika yang tidak mengeluarkan produk tersebut keluar dari sel. Tetapi mengendap di dalam sel. Lipida dan ada beberapa antibiotika masih ada di dalam sel. Pada produksi baker yeast, sel itu sendiri yang akan diambil sebagai produk . Steroid dapat diekstrak tanpa memecahkan dinding sel.

Untuk membebaskan komponen produk yang masih ada di dalam sel harus memecahkan dinding sel

20

Osmotoc shock Pelarutan menggunakan detergen. Pelarutan lipid. Penghancuran menggunakan enzim

dan Pemecahan menggunakan larutan

alkali.

Pemecahan dinding sel cara kimia

21

No. 4 dan 5 merupakan cara memecahkan sel yang efesien dan efektif tetapi masing masing mempunyai kelemahan. Kelemahan pemecahan menggunakan enzim adalah harga enzim mahal tidak sesuai untuk produksi skala industry. Keuntungannya enzim dapat mengikat komponen dengan selektivitas tinggi. Enzim langsung bereaksi dengan dinding sel dan menghancurkan dinding sel karena enzim hanya dapat bereaksidengan komponen komponen penyusun dinding sel dan tidak bereaksi dengan komponen lainnya yang ada di dalam sel.

22

Pengolahan menggunakan alkali bertentangan dengan enzim, kurang efektif dan tidak selektif tetapi murah. Reaksi alkali dengan komponen penyusun sel melalui beberapa cara: Saponifikasi lipida di dinding sel dengan logam alkali. Konsentrasi alkali tinggi menyebabkan denaturasi protein sehingga alkali dapat memecahkan dinding sel tetapi juga dapat merusak produk. Walaupun perlakuan dengan menggunakan alkali murah tetapi jarang digunakan dibandingkan dengan perlakuan No. 1-3.

23

Osmotic shock adalah metode yang paling sederhana dibandingkan dengan metode lainnya. Prosesnya adalah membengkakan dinding sel sehingga dinding sel akan pecah dan isi sel akan keluar. Setelah produk masuk ke dalam fase larutan, selanjutnya sel yang telah pecah dipisahkan menggunakan filtrasi atau sentrifugasi. Kemudahan sel pecah akibat osmotic shock tergantung jenis selnya. Sel tanaman lebih sukar untuk dipecah menggunakan osmotic shock dubandingkan dengan sel binatang atau mikroorganisme. Yang dapat memeca dinding sel adalah tekanan osmosis: Teori yang bisa menjelaskan adalah kesetimbangan energy potensial kimia air:

Osmotic shock.

24

Agar sel tidak pecah, energy potensial kimia di dalam sel harus sama dengan diluar sel.

Pada kondisi kesetimbangan tekanan di luar sel harus lebih kecil dibandingkan di dalam sel karena di dalam sel ada komponen-komponen (solute) sehingga tekanan osmosisnya lebih besar. Apabila tekanan di dalam sel tidak lebih besar, maka air akan masuk ke dalam sel dan ada kemungkinan sel akan lisis. Equivalensi konsentrasi solute di dalam sel adalah 0,1 M NaCl sampai dengan 0,2 M. Sehingga kalau dihitung berdasarkan tekanan osmosis untuk konsentrasi 0,2 adalah 5 atm. Apabila tekanan diluar lebih besar dari 5 atm, maka kemungkinan sel akan pecah.

25

Metode yang paling banyak digunakan setelah tekanan osmosis adalah dengan cara pelarutan menggunakan detergen. Biasanya larutan detergen kental ditambahkan ke dalam larutan yang mengandung sel setengahnya. Detergen akan memecahkan dinding sel.

Mengapa detergen dapat melarutkan dinding sel karena detergen adalah mempunyai dua macam muatan sekaligus di dalam molekulnya. Muatan yang bersifat hidropobik adalah ekor dari makromolekul detergen dapat mengikat lipia dari dinding sel sedangkan gugus hidropilik dapat mengikat air. Detergen dapat tidak bermuatan, bermuatan negative atau positif. Detergen yang biasa digunakan adalah sodium dodecyl sulfat (SDS) merupakan detergen anionic. Jenis lainnya bisa dilihat pada halaman:85.

Pelutan menggunakan Toluen, benze, kloro benzene.

Pelarutan.

26

Setelah sel pecah produk yang diinginkan keluar dari sel dan dapat dipisahkan. Tetapi kemurniannya masih rendah Untuk memurnikan produk harus dilakukan isolasi. Isolasi adalah salah satu aspek yang membedakan dengan pemisahan bahan kimia non bio. Isolasi meliputi dua hal yaitu memisahkan komponen dalam larutan encer dan memisahkan air atau meningkatkan konsentrasi solute di dalam larutan encer. Larutan yang sudah pekat dapat dimurnikan dengan berbagai macam metode yang apabila digunakan untuk memisahkan komponen di dalam larutan encer tidak efektif.

ISOLASI PRODUK

27

Sebagai contoh kromatografi elusi tidak bisa digunakan untuk larutan encer karena untuk mengisolasi sebuah komponen harus menggunakan pelarut selektif yang ditambahkan ke dalam larutan yang mengandung komponen yang akan diisolasi. Dua cara isolasi adalah ekstraksi dan adsorbsi. Ekstraksi digunakan untuk mengisolasi antibiotic dan telah digunakan untuk memproduksi antibiotic skala industry. Adsorpsi biasanya digunakan untuk produk yang sensitive seperti protein. Adsorpsi sangat sukar untuk digunakan pada skala industry. Kesimpulannya ekstraksi lebih sering digunakan dalam skala industry.

28

Setiap komponen memerlukan pelarut yang spesifik dan dapat dilihat pada Tabel 5.1-1.

29

Tipe Solute Solvent K Suhu

Asam amino Glycine n-butanol 0,01 25 C

Alanine n-butanol 0,02

Glutamic acid n-butanol 0,07

Asam alfa aminobutiric acid

n-butanol 0,02

Asam alfa aminocaproic acid

n-butanol 0,3

Lysine n-butanol 0,2

Antibiotik Celesticetin n-butanol 110

Cycloheximide Methylene chloride 23

Erythromycin Amyl acetate 120

Lincomycin n- butanol 0,17 pH 4,2

Gramicidine Benze, Kloroform/metanol

0,617

Novobiocin Butyl acetate 100 pH 7

0,01 pH 10,5

Peniciline F Amyl acetate 32 pH 4

0,06 pH 6

Penicilin K Amyl acetate 12 pH 4

0,1 pH 6

Protein Glukosa isomerase PEG 1550/potassium phosphat 3

Fumarase PEG 1550/potassium phosphat 0,2

Catalase PEG 1550/crude dextrans 3

30

Pemisahan produk fermentasi ideal : pemisahan komponen tak larut, isolasi produk, pemurnian produk dan finishing (pengeringan). Adsorpsi termasuk ke dalam isolasi produk. Isolasi secara ekstraksi telah dibahas pada bab sebelumnya dan pada bab ini akan dibahas mengenai adsorpsi. Adsorpsi focus kepada pemisahan komponen dalam laruytan encer tanpa menguapkan airnya. Komponen dalam larutan yang hanya kira kira 2% diserap dipermukaan adsorben kemudian dipisahkan dari larutan dan kemudian didesorpsi kembali sehingga didapatkan komponen yang diinginkan dan adsorben terbebas dari adsorbat dan digunakan kembali sebagai adsorben. Penyerapan komponen di permukaan adsorben bersifat reversible (dapat balik).

ADSORPSI

31

Penyerapan komponen (adsorbat) dapat terjadi apabila ada ikatan antara adsorbat dan adsorben. Proses adsorpsi ada empat tahap yaitu: pencampuran adsorben dan adsorbat, proses penyerapan adsorbat di permukaan adsorben, pemisahan cairan yang tidak mengandung adsorbat dan regenerasi adsorben menggunakan pelarut lain.

32

Adsorpsi sebanding dengan ekstraksi dan kedua metode digunakan dalam tahap isolasi produk fermentasi. Adsorpsi hanya digunakan pada skala kecil tetapi selektivitasnya lebih tinggi dibandingkan dengan ekstraksi. Sebagai contoh protein dapat diserap oleh adsorben tanpa terjadi denaturasi. Sehingga pada isolasi protein jarang menggunakan ekstraksi dimana pelarutnya adalah komponen organic. Kadang adsorpsi dilakukan terhadap kaldu fermentasi hasil fermentasi tanpa dilakukan filtrasi atau sentrifugasi. Kelemahan adsorpsi adalah apabila solute berikatan kuat dengan adsorben sehingga percobaan pendahuluan sklala laboratorium diperlukan sebelum memutuskan untuk menggunakan metode adsorpsi. Pada saat ini adsorpsi menjadi semakin penting dan lebih disukai terutama di dalam isolasi protein. Sedangkan ekstraksi digunakan untuk isolasi antibiotic. Kelemahan yang kedua adalah masalah pemindahan padatan serta hanya sesuai untuk skala kecil membuat kita memilih cara ekstraksi.