1 Gelelektrophorese von Proteinen SDS-PAGE, IEF, 2D Christina Himmler
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Gelelektrophorese von Proteinen
SDS-PAGE, IEF, 2D
Christina Himmler
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Gliederung
Was ist Gelelektrophorese? SDS-PAGE IEF 2D
Vor- und Nachteile der dargestellten Methoden
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Was ist Gelelektrophorese? geladene Teile (Proteine) wandern je nach
Größe und Ladung in einem elektrischen Gleichstrom-Feld
Zonenelektrophorese Verwendung eines oder mehrerer Puffer
oder pH-Gradient Apparatur bestehend aus Trenneinheit
(Kapillare, horizontale oder vertikale Kammern), Stromversorgung (500-5000V und 150-400mA) und Kühlvorrichtung
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Was ist Gelelektrophorese?
Gelelektrophorese
kontinuierlich diskontinuierlich
1 Puffer 2 Puffer
Aufteilung in Sammel- und Trenngel
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Herstellung von Gelen zur Elektrophorese Gele aus Polyacrylamid oder Agarose Poymerisation von Acrylamid mit Bisacrylamid
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Herstellung von Gelen zur Elektrophorese Porengröße abhängig von
TotalacrylamidkonzentrationTotalacrylamidkonzentration T [%]=g Acrylamid +g Bis x100 / 100mL und Vernetzungsgrad („crosslinking“)Vernetzungsgrad („crosslinking“) C [%]=g Bis x100 / (g Acrylamid +g Bis) unter Luftabschluss polymerisieren Polymerisationseffekt abhängig von
Temperatur, pH-Wert, T-Wert etc. Nachpolymerisation, daher einen Tag
stehen lassen
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GelelektrophoreseVorteile: hohe Auflösung (ca. 1-
800 kDa) Porengröße variabel chemisch inert und
stabil durchsichtig, gut
anzufärben leicht aufzubewahren
Nachteile: Monomere des
Acrylamids neurotoxisch und cancerogen
Porengröße limitiert: nur bis 800 kDa
basische Gele werden hydrolysiert, nur bedingt haltbar
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SDS-PAGESodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese
anionisches Detergenz, überdeckt Eigenladung von Proteinen
durch Erhitzen mit SDS-Überschuss: Auflösen der Quartär- und Tertiärstruktur
reduzierende Thiolverbindung (β-Mercaptoethanol oder DDT) spaltet Schwefelbücken zwischen Cysteinen auf
→ einheitliche Stab- bzw. ellipsoide Form Verwendung von SDS-haltigem (0,1%),
diskontinuierlichen Tris-HCl / Tris-Glycin-Puffersystem
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Disk. SDS-PAGESodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese
einheitlich negativ Ladung, daher gleiche Wanderungsgeschwindigkeit
Clˉ als Leit-Ion, Glycin als Folge-Ion
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Disk. SDS-PAGESodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese
Auftrennung der Stapel im Trenngel nur nach Molekülgröße!
Anfärben mit Coomassie-Brilliant-Blau oder Silbernitrat
Kalibrierungskurve
Bestimmung der Molekülmasse durch Vergleich mit Standardprotein
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Disk. SDS-PAGESodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese
Vorteile: auch hydrophobe und
denaturierte Proteine können aufgetrennt werden
schnelle Trennung Wanderung in eine
Richtung Trennung nach 1
Parameter: Molekulargewicht
Nachteile: irreversibles
Denaturieren der Proteine
nicht kompatibel mit nicht-ionischen Detergenzien
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IEF – Isoelektrische Fokussierung Wanderung der Proteine durch Gel mit pH-Gradient bis
zum pI Stagnation am pI Konzentrierungseffekt wirkt Diffusion entgegen
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IEF – Isoelektrische Fokussierung
Herstellung von immobilisierten pH-Gradienten:
Immobiline (Acrylamidderivate) werden in Gelmatrix einpolymerisiert, binden kovalent an Polyacrylamidnetzwerk
R: Carboxygruppe oder tertiäre
Aminogruppe
schwache Säuren oder schwache Basen kontinuierliches Verändern des
Immobilinmischungsverhältnisses während des Gießens
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IEF – Isoelektrische Fokussierung
Vorteile von Agarosegel:
schnelle Trennung über 800 kDa ungiftig
Vorteile von Polyacrylamidgel:
kaum Hintergrund-färbung
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IEF – Isoelektrische Fokussierung Vorteile: Endpunktmethode sehr genaue
Trennung; erfasst Unterschiede in einer geladenen AS
mit SDS-PAGE kombinierbar
pI einfach zu ermitteln
Nachteile: zeitaufwendig aufwendiges
Anfärben Proteine können
aggregieren, wandern nicht in das Gel ein
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2D-Gelelektrophorese
zweidimensionale Gelelektrophorese in zwei Schritten
zuerst Auftrennung mittels IEF, anschließend SDS-PAGE
elektrisches Feld um 90° gedreht
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2D-Gelelektrophorese Vorteile: gute Auftrennung nach
zwei Parametern ( pI und Molekülmasse)
hohe Auflösung für alle Proteine
universell einsetzbar schnell durchzuführen
Nachteile: schwierige
Durchführung Proteinverlust von IEF
zu SDS-PAGE
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Das war's,
danke schön!