1. cinética enzimática

Cinética Enzimática

• Cinética enzimática • Modelo cinético de Michaelis-Menten • Cálculo de la KM y la V.max de un

enzima • Actividad enzimática

CINETICA QUIMICAEs el estudio de la velocidad de cambio entre el estado inicial de los reactivos y productos y su estado final.EXPRESIONES DE LAS VELOCIDADES DE LAS REACCIONES QUIMICAS

De acuerdo al número de moléculas que reaccionan:a) Monomoléculasb) Bimoleculasc) Trimoleculares

Dependiendo de la Influencia de la Concentración de los reaccionantes sobre velocidad

•Reacciones 1º orden: Tienen lugar a una v- es proporcional a la ] de Reactantes.

•Reacciones 2º orden: La v- es proporcional al producto de los dos Reaccionantes.

•Reacciones 3º orden: La v- es proporcional al producto de los tres Reaccionantes.

•Reacciones orden Cero: Cuando son independientes de la concentración de

cualquier reactivo. *La v- depende de la E ?

La Reacción: A B

Determinación del orden cinético de la reacción

Se puede escribir una expresión matemática que defina la v- de la reacción en:

Desaparición de A ó formación B en función del tiempo

v- = D A + d B Kr An

d t d t = =

Kr = Contante de VelocidadA= ReaccionanteN = Orden cinético de la reacción

Cuando n = 0 n = 1

v- = Kr Aº= Krv- = Kr Aº= Kr A

REACCIÓN ORDEN CERO REACCIÓN PRIMER ORDEN

v-

A

ORDEN CERO

PRIMER O

RDEN ORDEN CERO: La v- es independiente de A (la v- permanece constante)

PRIMER ORDEN: La v- es directamente proporcional A (un incremento de la a produce un incremento lineal)

.

CINÉTICA ENZIMÁTICA ESTUDIA LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES QUÍMICAS

QUE SON CATALIZADAS POR ENZIMAS EL ESTUDIO DE LA CINÉTICA DE UNA ENZIMA PERMITE

EXPLICAR:

LOS DETALLES DE SU MECANISMO CATALÍTICOSU PAPEL EN EL METABOLISMOCOMO ES CONTROLADA SU ACTIVIDAD EN LA CÉLULACOMO ES INHIBIDA SU ACTIVIDAD CON FÁRMACOSVENENOS O POTENCIADO POR OTRO TIPO DE MOLÉCULAS.

Cinética enzimática ESTUDIA LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES

CATALIZADAS POR ENZIMAS.

Modelo cinético de Michaelis-Menten

Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del

sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo

enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis (foto de la

izquierda) y Maud Menten (foto de la derecha) desarrollaron esta

teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el

comportamiento cinético de los enzimas.

De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.

A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción (Figura de la derecha). Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero.

Para explicar la relación oservada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas:

En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre:

A concentraciones de sustrato pequeñas ([S] << KM) v = (k3 [ET]/KM) [S]. Como los términos entre paréntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva constante, kobs, de forma que la expresión queda reducida a: v = kobs [S], con lo cual la reacción es un proceso cinético de primer orden.

Para cualquier reacción enzimática, [ET], k3 y KM son constantes. Vamos a considerar dos casos extremos:

[S] << km

V= Vmax [S] km + [S] V= K. [S]

A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k3 [ET].

La velocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero.

Además, tanto k3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción (Vmax): Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima disponible se encuentra unido al sustrato.

[S] << km

V= Vmax [S] km + [S] V= Vmax [S] [S] V= Vmax

Si introducimos el parámetro de Vmax en la ecuación general de la velocidad, (la fórmula recuadrada anteriormente), obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis – Menten:

V = Vmax [S] km + [S]

CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA

La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hipérbola. La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

EL VALOR DE KM DA IDEA DE LA AFINIDAD DE LA E POR LA S:

A menor Km, mayor afinidad de la enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad.

Este hecho tiene fácil explicación si tenemos en cuenta que KM se define como ( K2+K3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reacción 1 lo forma. Así, si KM es grande, el complejo ES es Inestable pues prodomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si KM es pequeña, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo(gran afinidad hacia el sustrato)

Vo= Vmax Todos los sitios activos están ocupados y no hay moléculas de E libre.

KM= [S] Sí... ½ Vmax

KM representa la cantidad de sustrato necesaria para fijarse a la mitad de la E disponible y producir la mitad de la Vmax

KM representa la concentración del sustrato en una célula

Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk .

REPRESENTACIÓN DE LINEWEAVER - BURK

Es una recta en la cual:La pendiente es KM/Vmax La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax

De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

Se usan las reciprocas de la V y [S]• V = [S]Vmax

Km + [S]

• 1= Km + [S] V V max. [S]Ordenando:• 1 = Km + [S]

V Vmax. [S] V max. [S]

• 1 = Km • 1 + 1 V Vmax [S] Vmax

y = a x b

RESUMEN

• El modelo de Michaelis Menten da cuenta de las Propiedades Cinéticas de las Enzimas

E + S K2 k1 ES K3 E + P

• La velocidad (V) de la formación de producto está dada por la ecuación de M.M.

V= Vmax [S]

[S] + km

Vmax= es la velocidad es cuando la Enzima está completamente saturado con el S. Es un índice la eficiencia de la enzima.

Sus unidades son unidades de velocidadKm= Concentración de S a la cual la velocidad de la

reacción es la mitad de la máxima. Es una medida inversa de la afinidad de la enzima por el substrato.

Un bajo Km indica alta afinidad entre la E y la S.Las unidades son unidades de concentración

• La velocidad maxima, Vmax, es igual al producto de K3 y la concentración total de la Enzima

Vmax = K3 [Et]

K3: es el número de moléculas de S convertidas en P por unidad de tiempo por un solo centro catalítico cuando la E está completamente saturado con S

• la velocidad de una reacción catalizada (V) nos indica la cantidad de sustrato consumido o producto formado por unidad de tiempo.

• En el Sistema internacional se designa por “U” (unidad de actividad enzimática) y corresponde a los μmoles de sustrato consumidos en 1min.

U= μmol.S/min = μmolP/min

Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad del

enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no

es necesario purificar o aislar el enzima.

La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan

concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los

productos o la desaparición de los reactivos.

Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la reacción.

De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.

A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción (Figura de la derecha). Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero.

Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la de la Figura de la derecha.

Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).

Para explicar la relación oservada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre:

En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad. Según esto, podemos afirmar que:

v1 = k1 [E] [S] v2 = k2 [ES] v3 = k3 [ES]

Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la concentración total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo de la reacción) es:

[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según la cual la concentración del complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo largo de la reacción (Figura de la derecha). Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociación (v2+ v3): v1 = v2 + v3

Además, como [ES] es constante, la velocidad de formación de los productos es constante:v = v3 = k3 [ES] = constante.Como v1=v2+v3, podemos decir que:k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]

Despejando [ES], queda que:

, siendo

En donde la expresión (k2+k3)/k1 se ha sustituído por KM, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos aporta una explicación sobre las razones que hacen de la KM un parámetro cinético importante.

Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es:

v = v3 = k3 [ES] =

A concentraciones de sustrato pequeñas ([S] << KM) v = (k3 [ET]/KM) [S]. Como los términos entre paréntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva constante, kobs, de forma que la expresión queda reducida a: v = kobs [S], con lo cual la reacción es un proceso cinético de primer orden.

Para cualquier reacción enzimática, [ET], k3 y KM son constantes. Vamos a considerar dos casos extremos:

[S] << km

V= Vmax [S] km + [S] V= K. [S]

A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k3 [ET]. La velocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero. Además, tanto k3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción (Vmax): Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima disponible se encuentra unido al sustrato.

[S] << km

V= Vmax [S] km + [S] V= Vmax [S] [S] V= Vmax

Si introducimos el parámetro de Vmax en la ecuación general de la velocidad, (la fórmula recuadrada anteriormente), obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis – Menten:

V = Vmax [S] km + [S]

CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA

La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hipérbola (Figura de la izquierda). La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

El valor de km da idea de la afinidad de la e por la s:

A menor Km, mayor afinidad de la enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad. Este hecho tiene fácil explicación si tenemos en cuenta que KM se define como ( K2+K3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reacción 1 lo forma. Así, si KM es grande, el complejo ES es Inestable pues prodomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si KM es pequeña, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo(gran afinidad hacia el sustrato)

Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk .

REPRESENTACIÓN DE LINEWEAVER - BURK

Es una recta en la cual:La pendiente es KM/Vmax La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax

De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.