(09) dr. farida jr mkes, peran biomol-dlm-dx&tx

Rekayasa Genetika Pada dasarnya rekayasa genetika adalah

memanipulasi DNA (asam deoksiribosenuklat). Gen atau pembawa sifat yang bisa diturunkan dalam mahkluk terdiri dari rantai DNA.

Rekayasa genetika merupakan suatu rangkaian metode yang canggih akan tetapi sederhana dalam hal prinsip, yang memungkinkan untuk dilakukan pengambilan gen atau sekelompok gen dari sebuah sel dan mencangkokkan gen atau sekelompok gen tersebut pada sel lain. Gen atau sekelompok gen tersebut mengikat dirinya dengan gen atau sekelompok gen yang sudah ada dan bersama-sama menanggung reaksi biokimiawi penerima.

Transgenik

Secara sederhana transgenik atau sering disebut juga GM (genetically modified) atau GMO (genetically modified organism) dapat diartikan kromosom yang di dalamnya telah disisipkan satu atau lebih dari organisme yang berbeda baik secara alami atau buatan

Awal penemuan

Warner Arber pada tahun 1960, menemukan enzim untuk memotong untaian DNA, enzim tersebut dikenal sebagai enzim restriksi.

Stanley Cohen dan Herbert Boyer tahun 1973, berhasil memotong dan memindahkan potongan DNA dari satu bakteri ke bakteri lain. Proses inilah awal mula dari “transgenik buatan” yang dilakukan di laboratorium

Enzim restriksi Enzim tersebut diisolasi dari bakteri yang kini

menjadi amat penting dalam dunia rekayasa genetika dan terapi gen.

Enzim penting yang dihasilkan bakteri tersebut disebut enzim restriksi atau enzim endonuklease restriksi. Enzim ini sesuai namanya berfungsi untuk melindungi bakteri dari virus bakteri yang menginfeksinya, yang disebut bakteriofaga.

Manusia memanfaatkan untuk memotong-motong DNA suatu gen.

lanjutan

Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada sekuen spesifik yang panjangnya 4-6 pasang basa

Saat ini sudah banyak enzim restriksi yang bisa diisolasi dari berbagai spesies bakteri.

Nama enzim diawali 3 huruf yang menyatakan nama bakteri yang memproduksi

Setiap enzim mengenal sekuen dan situs pemotongan yang khas

Nama Enzim Sekuens pengenal Organisme asal

EcoRI G AATTC E. coli

HindIII A AGCTT H. influenzae

HhaI GCG C H. haemolyticus

TagI T CGA T. aquaticus

BsuRI GG CC B. subtilis

BalI TGG CCA B. albidum

NotI GC GGCCGC N. otidis-carviarum

BamHI G GATCC B. amyloliquefaciens

Contoh Enzim

Elektroforesis

Merupakan metode standar untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakteri-sasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA maupun protein.

Merupakan alat pendukung pokok dalam teknologi DNA rekombinan dengan aplikasi yang luas untuk fraksinasi untai tunggal maupun ganda

Dapat menggunakan Agarose atau Acrylamid

lanjutan

Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda

lanjutan Dalam elektroforesis gel, terdapat dua material

dasar yang disebut fase diam dan fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring" objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis gel.

lanjutan

Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom (disebut well) pada sisi elektroda negatif. Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan bergerak ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan ukuran objek. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah. Objek berukuran lebih besar akan lebih lambat berpindah

lanjutan

Pada pH mendekati netral DNA bermuatan (-) dan akan bermigrasi dari Kathode ke Anode

Poliakrilamid gel (tanpa denaturasi) dapat digunakan untuk memisahkan fragmen DNA (double strain) mulai dari 6 bp (20% akrilamid) sampai 1000 bp (3% akrilamid)

Agarose gel mempunyai kemampuan range yang lebih luas : 70 bp (3% agarose) dan 800.000 bp (0,1 % agarose)

Agarose gel elektroforesis Lokasi fragmen DNA dapat diamati secara in

situ dengan menggunakan etidium bromid sebagai pewarna (mencampur langsung dalam gel, gel buffer atau setelah elektroforesis berakhir.

Pemakaian etidium bromid dengan melarutkan langsung dalam buffer akan mempengaruhi mobilitas DNA dalam gel. Warna ini berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan memberikan warna orange flourescence di bawah lampu UV.

lanjutan

Konsentrasi agarose menentukan besar pori-pori dari matrik gel. Makin tinggi konsentrasi agarose maka pori yang terbentuk makin kecil. Network pori-pori gel berfungsi sebagai saringan molekul, DNA dengan fragmen kecil bermigrasi lebih cepat dari pada fragmen besar

Pemilihan konsentrasi yang tepat menentukan range molekul yang dapat dipisahkan

Range Pemisahan Molekul DNA dengan Agarose Gel

Agarose (%) Separasi optimal dari mol DNA (kb)

0,3 5,0 - 60

0,6 1,0 - 20

0,7 0,8 - 10

0,9 0,5 - 7,0

1,2 0,4 - 6,0

1,5 0,2 - 4,0

2,0 0,1 - 3,0

lanjutan

Agarose dengan konsentrasi di bawah 0,5% tidak begitu menguntungkan karena sukar penanganannya dan gel yang terbentuk sangat fragil

Agarose merupakan polimer molekul (polisakarida)

Poliakrilamid gel elektroforeses (PAGE)

Poliakrilamid gel terbentuk dari polimerisasi monomer poliakrilamid menjadi rantai linier

Konsentrasi akrilamid menentukan panjang rantai polimer

Contoh hasil elektroforesis

Contoh hasil elektroforesis

Kloning

Kloning gen : suatu prosedur untuk memperoleh replika yang sama dari sel atau organisme

Kloning Teknik kloning salah satu teknik yang digunakan

untuk mencoba menciptakan makhluk hidup yang hampir sama dengan yang sudah ada melalui rekayasa genetika. Kloning memperkenalkan manusia pada perkembangan badan yang deterministik, lewat cetak biru gen organisme induknya. Membuat klon gen merupakan suatu teknologi untuk mengidentifikasi, mengisolasi, dan membuat copy gen dari protein tertentu, dengan tujuan agar gen itu dapat dianalisis atau dipakai untuk memproduksi protein tersebut dalam jumlah besar .

lanjutan Kloning yang pertama kali berhasil :

domba Dolly Legalitas kloning manusia sejauh ini

memang masih diperdebatkan sehubungan masih adanya pro dan kontra.

FATWA MUI Secara umum, kloning terhadap tumbuh-tumbuhan

dan hewan akan membawa kemanfaatan dan kemaslahatan kepada umat manusia.

Kloning terhadap manusia dapat membawa manfaat, antara lain : rekayasa genetik lebih efisien dan manusia tidak perlu khawatir akan kekurangan organ tubuh pengganti (jika memerlukan) yang biasa diperoleh melalui donor, dengan kloning ia tidak akan lagi merasa kekurangan ginjal, hati, jantung, darah, dan sebagainya, karena ia bisa mendapatkannya dari manusia hasil teknologi kloning.

Kloning terhadap manusia juga dapat menimbulkan mafsadat (dampak negatif yang tidak sedikit) antara lain :

lanjutan

• menghilangkan nasab anak hasil kloning yang berakibat hilangnya banyak hak anak dan terabaikannya sejumlah hukum yang timbul dari nasab;

• institusi perkawinan yang telah disyari'atkan sebagai media berketurunan secara sah menjadi tidak diperlukan lagi, karena proses reproduksi dapat dilakukan tanpa melakukan hubungan seksual;

lanjutan

• lembaga keluarga (yang dibangun melalui perkawinan) akan menjadi hancur, dan pada gilirannya akan terjadi pula kehancuran moral (akhlak), budaya, hukum, dan syari'ah Islam lainnya;

• tidak akan ada lagi rasa saling mencintai dan saling memerlukan antara laki-laki dan perempuan;

• hilangnya maqashid syari'ah dari perkawinan, balk maqashid awwaliyah (utama) maupun maqashid tabi'ah (sekunder).

FATWA MUI

• FATWA MUSYAWARAH NASIONAL MAJELIS ULAMA INDONESIA TENTANG KLONING.

• Kloning terhadap manusia dengan cara bagaimanapun yang berakibat pada pelipatgandaan manusia hukumnya adalah haram.

• Kloning terhadap tumbuh-tumbuhan dan hewan hukumnya boleh (mubah) sepanjang dilakukan demi kemaslahatan dan/atau untuk menghindarkan kemudaratan (hal-hal negatif).

lanjutan

Kloning ekspresi : salah satu teknik dasar biologi molekular yang digunakan misalnya untuk mempelajari fungsi protein. Pada teknik ini, potongan DNA penyandi protein yang diinginkan ditransplantasikan ke suatu plasmid (DNA sirkular yang biasanya ditemukan pada bakteri; dalam teknik ini, plasmid disebut sebagai vektor ekspresi).

lanjutan Plasmid yang telah mengandung potongan DNA

yang diinginkan tersebut kemudian dapat disisipkan ke dalam sel bakteri atau sel hewan. Penyisipan DNA ke dalam sel bakteri disebut transformasi, dan dapat dilakukan dengan berbagai metode, termasuk elektroporasi, mikroinjeksi dan secara kimia. Penyisipan DNA ke dalam sel eukaryota, misalnya sel hewan, disebut sebagai transfeksi, dan teknik transfeksi yang dapat dilakukan termasuk transfeksi kalsium fosfat, transfeksi liposom, dan dengan reagen komersial. DNA dapat pula dimasukkan ke dalam sel dengan menggunakan virus (disebut transduksi viral).

lanjutan

Setelah penyisipan ke dalam sel, protein yang disandi oleh potongan DNA tadi dapat diekspresikan oleh sel bersangkutan. Berbagai jenis cara dapat digunakan untuk membantu ekspresi tersebut agar protein bersangkutan didapatkan dalam jumlah besar. Protein dalam jumlah besar tersebut kemudian dapat diekstrak dari sel bakteri atau sel eukaryota

Langkah dasar kloning gen

Fragmen DNA yang mengandung gen yang akan diklon diinsersikan pada molekul DNA sirkular yang disebut sektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombiner

Vektor yang bertindak sebagai wahana pembawa gen masuk dalam sel tuan rumah (host)

Di dalam sel host, vektor megadakan replikasi menghasilkan banyak copy atau turunan yang identik dengan gen yang dibawanya

lanjutan

Ketika sel host membelah, copy molekul DNA rekombinasi diwariskan pada progeni dan terjadi replikasi selanjutnya

Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau klon yang identik

Tiap sel dalam klon mengandung 1 copy atau lebih molekul DNA rekombinasi. Dengan demikian gen yang dibawa oleh molekul rekombinasi telah diklon

lanjutan

Untuk dapat bertindak sebagai wahana suatu molekul DNA harus mampu memasuki sel tuan rumah dan mengadakan replikasi untuk menghasilkan copy dalam jumlah besar

Molekul DNA alamiah yang memenuhi persyaratan tersebut : Plasmid dan bakteriofaga (virus yang menginfeksi bakteri)

Plasmid

DNA sirkuler selain kromosom yang terdapat pada bakteri. Dapat bereplikasi sendiri dan mengandung berbagai gen. Jenis dan jumlah pada pada bakteri berbeda sekalipun dalam satu spesies.

lanjutan

Pemotongan plasmid digunakan enzim retriksiPlasmid yang sudah terpotong dicampur

dengan DNA asing deng ditambah enzim ligase (plasmid akan bergabung dengan DNA asing atau DNA awal).

Transformasi : plasmid dicampur dengan bakteri yang tidak mempunyai plasmid akan terbentuk 3 bakteri (tidak mengandung plasmid, plasmid asli dan plasmid rekombinan)**

lanjutan

Seleksi bakteri yang mengandung plasmid rekombinan dapat digunakan antibiotik.

Contoh plasmid lain pUC 118 dan pUC 119 yang mengandung gen lac Z yang menyandi enzim beta-galaktosidase.

Enzim beta-galaktosidase akan memecah x-gel menjadi galaktosa dan 5-bromo-4 chloroindigo (biru). Oleh karena itu bakteri yang mengandung pUC 118 dan 119 akan berwarna biru bila ditumbuhkan pada media x-gel

PCR

Polymerase Chain Reaction : kalau diterjemahkan adalah reaksi rantai polimerase. Merupakan prosedur yang efektif untuk amplifikasi sekuen DNA

Kegunaan utama dari PCR adalah untuk menggandakan sebuah bagian spesifik dari DNA (misal sebuah gen) hingga berkali-kali lipat (amplifikasi) sehingga bagian spesifik DNA yang kita inginkan dapat kita identifikasi dan diketahui keberadaannya

lanjutan

PCR : teknologi yang ditemukan oleh Kary B. Mullis pada tahun 1985

Mekanisme Ada 3 langkah utama dalam PCR, yang

sebetulnya dilakukan berulang-ulang hingga 30-40 kali. Langkah-langkah ini dilaksanakan pada mesin yang secara otomatis melakukan reaksi dalam waktu yang singkat. Langkah utama adalah sebagai berikut:

- Denaturasi pada suhu 95°C : Pada saat denaturasi, rantai ganda DNA dari objek penelitian mengalami pemisahan sehingga media berisi rantai tunggal DNA sebagai DNA template. (Tabung reaksi berisi DNA target, 2 primer oligonukleotida, polimerase tag yang tahan panas, 4 deoksiribonuklotida)

lanjutan- Annealing (Renaturasi) pada suhu 37°C-55°C: Pada

tahapan ini, molekul-molekul primer (rantai asam nukleat yang digunakan untuk mengawali proses PCR) yang telah ditambahkan pada media menempel/hibrid pada rantai DNA target. Primer didesain secara khusus agar bisa berkomplemen/berpasangan dengan DNA template. Primer didesain pula untuk mengamplifikasi target DNA yang kita inginkan (misal DNA virus WSSV).

- Perpanjangan rantai (polimerse) pada suhu 72°C: Pada tahapan ini DNA polimerase yang ditelah ditambahkan pada media mulai bekerja untuk memanjangkan rantai sehingga terbentuk rantai ganda DNA yang diinginkan.  

lanjutan

Semu tahap dan perubahan suhu dilakukan pada alat pemanas terprogram otomatis. Satu siklus biasanya membutuhkan waktu 3-5 menit

Rantai ganda DNA objek mengalami penggandaan sehingga terdapat peningkatan jumlah gen secara eksponensial. Reaksi PCR yang berulang membuat jumah gen template (gen yang kita ingin ketahui) memadai untuk kita periksa pada analisa selanjutnya

lanjutan Pada fase sintesis siklus pertama, DNA yang

baru terbentuk memperpanjang masing-masing primer sampai melewati lokus di mana primer satu menempel. Untai baru ini bekerja sebagai cetakan panjang yang akan ddigunakan pada siklus ke dua

Pada siklus ke dua, untai DNA asli dan untai baru didenaturasi dan hibridisasi dengan masing-masing primer. Sintesis menghasilkan untai yang panjang dan untai DNA yang kedua ujungnya mengandung primer dan komplemen pimer (cetakan pendek)

lanjutan

Pada siklus ke tiga, untai pendek, untai panjang dan untai asli dihibridisasi oleh primer dan kemudian polimerasi.

Pada tahap berikutnya akan terakumulasi untai pendek dan sampai pada siklus 30 untai yaitu sekitar sejuta kali banyaknya dari untai asli

lanjutan

Secara praktis, PCR dapat dilakukan dengan mesin yang sudah diperjualbelikan di pasaran

Untuk memverifikasi apakah PCR kita berhasil menggandakan gen maka digunakanlah teknologi elektroforesis gel.

Contoh elektroforesis

Dari gambar terlihat bahwa peneliti memakai dua buah primer pada positive control. Peneliti juga menyiapkan ladder (di ujung kanan) sebagai rujukan.Dari tiga buah sampel, Tissue 1 tidak memiliki gen yang dicari karena terlihat tidak memiliki garis hitam pada hasil elektroforesis

Kegunaan PCR

Mengetahui sekuen DNA yang telah diketahui namun dalam jumlah kecil

Mendeteksi infeksi virus atau bakteri Deteksi mutasi, membuat mutasi

spesifik in vitro Menghasilkan gen utuh dan untuk

sekunsing Deteksi penyakit keturunan