上海生科院_实验生物学_酶工程041130

酶工程杨 晟

中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所分子微生物学开放实验室

上海生命科学研究院研究生课程 实验生物学课程

2004.11.30

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酶

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个人简历

1991-1995 浙江大学化工系 本科生 1995-2000 上海生物化学研究所 ( 酶工程组 ) 研究生 2000-2002 生化细胞所 ( 酶工程组 ) 助理研究员 2002- 植物生理生态研究所 ( 酶工程组 ) 副研究员

研究课题：半合成 β 内酰胺抗生素工业中的酶工程

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酶工程定义 定义 :

将酶所具有的生物催化功能 , 借助工程手段应用于社会生活的一门科学技术；

利用酶催化的作用 , 在一定的生物反应器中 , 将相应的原料转化为所需要的产品；

利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能，通过适当的反应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊目的的一门技术科学。 ( 大唐搜索 )

领域 : 酶学理论与工程技术相结合而形成的新技术

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“ 工程”的定义 (Webster)

“ 酶工程”的定义运用酶学知识结合数学和 / 或其他系统性知识设计有

实用价值的新酶( 生物催化剂，固定化生物催化剂，生物催化反应体

系 , 生物催化反应器。。。 )

一门研究如何发挥酶的催化功能的技术科学

超越常规实践技巧运用数学或系统性知识设计有实用价值的复杂体系

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课程基础

张惠展 重组 DNA 技术与基因工程 钟杨 基因组学与生物信息学 周金秋 蛋白质相互作用 ( 蛋白质纯化 ) 张嗣良 发酵工程

•生物化学 ( 氨基酸，酶学 )•蛋白质化学 ( 蛋白质纯化，蛋白质结构)•微生物学

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参考资料

王镜岩 《生物化学》 第 3 版 第 8 章 酶通论 Colin Ratledge 《 Basic Biotechnology 》 2001

郭勇 《酶工程》 1994

罗贵民 《酶工程》 2002

孙志浩 《生物催化工艺学》 2004

Martin Chaplin 《 Enzyme Technology 》 1990http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/index.html

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内容安排 (50 分钟休息 5 分钟 )

复习与简介 复习酶的基本概念 酶工程发展概况

基础 学习酶的生产方法

重组表达 酶的分离提取

酶的固定化技术 酶反应器

提高 酶的改造

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酶学知识复习

王镜岩 《生物化学》 第 3 版 第 8 章 酶通论

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酶是什么？

有催化活力的蛋白质

蛋白质一般不稳定 , 反应条件温和

催化能力高效性 , 专一性 化学选择性，区域选择性，立体选择性

The Mechanism of Enzyme Catalysis

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酶学相关定义 U 酶活力单位

1 分钟内转化 1umol 底物所需酶量 Vmax 最大反应速度

酶分子所有的活性部位都被底物占据时的反应速度

Km 米氏常数反应速度达到 Vmax 一半时的底物浓度

Kcat 酶转换数以每分钟每酶分子形成的产物的分子数表示的 Vmax

米氏方程

][

][max

SK

SVV

m

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酶的命名氧、转、水、裂、异、合 ( 连 )

1. Oxidoreductases 氧化还原酶2. Transferases 转移酶3. Hydrolases 水解酶4. Lyases 裂合酶5. Isomerases 异构酶6. Ligases 连接酶 ATP 随机偶联

国际酶学委员会 Enzyme Commission (EC)

Oxidoreductases

b-D-glucose + oxygen D-glucono-1,5-lactone + hydrogen peroxide

Transferases

[1.2]

L-aspartate + 2-oxoglutarate          oxaloacetate + L-glutamate

Hydrolases

k-casein + water para-k-casein + caseino macropeptide

Lyases

L-histidine urocanate + ammonia

Isomerases

a-D-glucopyranose a-D-fructofuranose

Ligases

ATP + g-L-glutamyl-L-cysteine + glycine ADP + phosphate + glutathione

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酶知识复习小结

酶是有催化活力的蛋白质 酶与过渡态中间物的紧密结合，稳定了底物

的过渡态结构，从而降低了底物形成其过渡态所需克服的能垒，提高了反应的速度

酶活力的国际单位定义是 1 分钟内催化 1umol 底物分子所需的酶量

酶分为 6 大类，酶的命名可以在 http://us.expasy.org/enzyme 上查询

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酶工程发展概况

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酶工程的历史在麦芽中发现淀粉酶 18 33

在胃中发现消化酶 -- 胃蛋白酶 18 36

18 73 从小牛胃提取凝乳酶用于制酪Enzyme 定名 --意为 " 在酵母中 " 18 78

钥匙 -锁理论提出 18 94 以米曲霉生产淀粉酶作为消化酶中间产物学说米氏方程 19 13

获得脲酶结晶酶是蛋白质 19 26

19 49 液体深层发酵生产细菌 α- 淀粉酶固定化酶 19 53

操纵子学说酶生物合成机制 19 60

19 69 固定化氨基酰化酶生产 L- 氨基酸19 73 基因工程技术19 78 定点突变技术19 84 TyrRS 的蛋白质工程19 86 重组酶生产19 94 DNA shuffling

酶的历史

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主要酶制剂生产和供应商

世界最大工业酶制剂公司 8 亿美元 (2003)

世界第二大工业酶制剂公司

酶技术公司 DNA shuffling 专利持有者

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酶的应用领域 ( 按价值计 )

食品 45%

洗涤剂 34%

纺织 11%

制革 3%

制浆 / 造纸 1%

其它 6%世界市场 (除了医药 ) 数十亿美元

Data from Colin Ratledge ed. Basic Biotechnolgy

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半合成 β 内酰胺抗生素工业 Semi-synthetic β-lactam antibiotics industry

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酶工程面临发展机会以化学催化为核心的基础物质加工业面临严重的危机

(1 ）资源危机：化石资源－不可再生资源

(2 ）能源危机：化石燃料－不可再生能源

(3 ）环境危机：三废排放－环 境 污 染

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◆ 2002 年我国利用催化技术的主要行业：化工 9000 亿元、食品加工 3000 亿元、医药3170亿元，合计占我国 GDP的 15.5%。

““ 催化技术”事关国计民生、国家安全催化技术”事关国计民生、国家安全

最大份额基础产业

GDP

15.5%（ 2002年）

◆ 这些行业的产品关乎国民经济的所有行业、人民的衣食住行和国家安全。

◆ 目前的催化技术基本是化学催化。

化学催化 生物催化酶工程

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生物技术产业化的三个浪潮

医药生物技术 1982 年重组人胰岛上市 农业生物技术 1996 年转基因大豆、玉米、油菜、相继上市 工业生物技术 世纪之交　聚交酯、生物钢、聚乳酸相继上市

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三次生物技术浪潮的特点

第一次 第二次 第三次

技术 基因工程 细胞工程 酶工程

产品 蛋白质或多肽药物 优良品质的农作物 各种小分子或大分子

用途 医药 农业 几乎涉及各行业

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转化过程生物质原料

用途燃料－生物酒精－生物柴油－甲醇－氢气－沼气电热产品－精细化学品－大宗化学品－食品－塑料－溶剂－酚类－粘合剂－脂肪酸－醋酸－碳黑、颜料－燃料、香料、墨水－洗涤剂

工业生物技术（ biorefinery）

－树木－木材加工废弃物－草－农作物－农产废弃物－废弃动物－城市有机垃圾

－酸水解 / 发酵－酶 / 发酵－气 / 液发酵－热化学加工

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理想的生物冶炼厂

燃料酒精发酵技术生物柴油

高效酶系统

太阳能利用工厂•制造成本最低•净化空气与清洁环境•运行成本最低

Stephan Herrera. Industrial biotechnology – a chance at redemption. Nature Biotech 2004, 22(6):671-5

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《复习与简介》 小结

酶是有催化活力的蛋白质

酶工程将在工业生物技术领域起越来越重要的作用

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基础篇

学习酶的生产方法 重组表达系统 酶的分离提取

酶的固定化技术 酶反应器

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酶的生产

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植物来源来源 酶 应用刀豆 脲酶 诊断木瓜 木瓜蛋白酶 烘焙，制酪，制革，

嫩肉粉，啤酒澄清无花果 无花果蛋白酶 嫩肉粉菠萝 菠萝蛋白酶 烘焙辣根 辣根过氧化物酶 诊断柠檬 β-糖苷酶 科研小麦 酯酶 酯水解与合成大麦 β- 淀粉酶 烘焙，麦芽糖浆大豆 β- 淀粉酶 烘焙，麦芽糖浆

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动物来源的工业用酶

来源 酶 工业用途

肝 过氧化氢酶 食品胰腺 胰凝乳蛋白酶 制革胰腺 脂肪酶 食品皱胃 凝乳酶 制酪胰腺 胰蛋白酶 皮革

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微生物来源的工业用酶Enzymea EC numberb Source Intra/extra-cellularc  Scale of productiond Industrial use

Bacterial enzymes

-Amylase 3.2.1.1 Bacillus E +++ Starch-Amylase 3.2.1.2 Bacillus E + StarchAsparaginase 3.5.1.1 Escherichia coli I - HealthGlucose isomeraseh 5.3.1.5 Bacillus I ++ Fructose syrupPenicillin amidase 3.5.1.11 Bacillus I - PharmaceuticalProteasei 3.4.21.14 Bacillus E +++ DetergentPullulanasej 3.2.1.41 Klebsiella E - Starch

Fungal enzymes

-Amylase 3.2.1.1 Aspergillus E ++ BakingAminoacylase 3.5.1.14 Aspergillus I - PharmaceuticalGlucoamylasek 3.2.1.3 Aspergillus E +++ StarchCatalase 1.11.1.6 Aspergillus I - FoodCellulase 3.2.1.4 Trichoderma E - WasteDextranase 3.2.1.11 Penicillium E - FoodGlucose oxidase 1.1.3.4 Aspergillus I - FoodLactasel 3.2.1.23 Aspergillus E - DairyLipasee 3.1.1.3 Rhizopus E - FoodRennetm 3.4.23.6 Mucor miehei E ++ CheesePectinasen 3.2.1.15 Aspergillus E ++ DrinksPectin lyase 4.2.2.10 Aspergillus E - DrinksProteasem 3.4.23.6 Aspergillus E + BakingRaffinaseo 3.2.1.22 Mortierella I - Food

Yeast enzymes  

Invertasep 3.2.1.26 Saccharomyces I/E  - ConfectioneryLactasel 3.2.1.23 Kluyveromyces I/E - DairyLipasee 3.1.1.3 Candida E - FoodRaffinaseo 3.2.1.22 Saccharomyces I - Food

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微生物酶生产率提高的手段

菌种选育 －－诱变育种 发酵工艺优化－－发酵工程 重组表达 －－基因工程

张惠展课 进一步提高

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分子生物学知识复习 中心法则

操纵子理论 重组蛋白质表达载体必需元件 选择标记 启动子 核糖体结合位点 转录终止信号 复制起点

( 自主复制质粒必需 ) 编码 (c)DNA

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重组蛋白质的表达 获取基因 选择表达系统 选择表达载体

基因克隆至表达载体

转化至表达宿主细胞 筛选转化子

生长表达蛋白质

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克隆天然酶基因

已知序列－－ PCR直接扩增 未知序列

1. 联配同类酶的已发表序列，根据保守氨基酸序列设计简并引物扩增基因

2. 纯化酶，测定部分氨基酸序列，设计简并引物扩增基因3. 以方法 1 ， 2设计 DNA探针进行 southern杂交和 / 或菌落杂交，筛选文库

4. 建立表达文库 利用能表达酶活性的宿主菌的表型不同进行筛选 纯化酶，制备抗体，用免疫印迹的方法筛选阳性克隆

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重组表达系统 E. coli (T7, tac/trc, T5, ara …)

Bacillus

Pichia pastoris (aox1, gap)

Aspergillus niger

……

Baculovirus

CHO

蛋白质产量 翻译后修饰加工，折叠 ( 二硫键 ) 和糖基化

蛋白质纯化 经济性 可用设备

表达系统选择

考虑因素 :

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首选重组蛋白质表达系统－－大肠杆菌

介绍G- 细菌生长最快 实验操作最方便可高密度发酵遗传背景清楚 容易获得各种载体和宿主

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Factors influencing recombinant protein production in E.coli

Mergulhao etal Journal Microbiol Biotechnology 2004

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启动子最关键！E.coli 表达系统可用启动子列表

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常用大肠杆菌表达系统trc 启动子

pTrcHIS(Invitrogen)pKK223, pTrc99(Pharmacia)

T7 启动子pET(Novagen)pRSET, pCRT7(Invitrogen)

T5 启动子pQE系列 (Qiagen)

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首选系统 pET

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改善重组蛋白质的可溶性 温度， IPTG浓度

融合表达 Maltose binding protein (pMal 系列 NEB) Glutathione S-transferase (pGEX-T 系列 Pharmacia) Nus Tag

Trx Tag

Chaperone-assisted (GroE) protein folding

The unfolded polypeptide enters the central cavity of chaperonin, where it folds. The hydrolysis of several ATP molecules is required for chaperonin function

The unfolded polypeptide enters the central cavity of chaperonin, where it folds. The hydrolysis of several ATP molecules is required for chaperonin function

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D- 氨甲酰水解酶与分子伴侣GroELES的共表达

Control

s p s p

D-氨甲酰水解酶

GroELES

GroEL,ES

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大肠杆菌表达系统小结 优点

最方便，最有效 缺点

分泌表达能力弱 二硫键形成困难 无翻译后修饰

提示：启动子最重要

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大肠杆菌表达实验策略

首选 pET 系统 , 如 pET24/BL21(DE3)

1mM IPTG诱导 无表达 ?Trc, T5 系统 包涵体？1. IPTG 浓度 (1uM, 10uM, 100uM) ，降温低至 18℃2. 融合表达3. 共表达分子伴侣改善可溶性 摇瓶放大 发酵罐？

酵母表达系统

Saccharomyces cerevisiaPichia pastoris

http://www.invitrogen.com

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Pichia pastoris 简介

Budding Pichia pastoris

醇氧化酶的催化场所––––过氧化物酶体可占到细胞总体积的 80%

无快速碳源而含有甲醇，产生醇氧化酶能占到细胞总蛋白的 30%

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Pichia pastoris 表达体系的优点

外源基因稳定整合 醇氧化酶基因的启动子强，且可

用甲醇严格调控表达

重组蛋白质可以以胞内或胞外形式表达

含有真核表达系统共有的翻译后修饰功能

有商品化宿主 / 载体，操作简便 放大方便，发酵密度极高

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Pichia pastoris 表达的蛋白

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Typical Pichia pastoris expression vector

5’AOX1: AOX1 5’ region including promoter MCS: Multiple cloning site TT: AOX1 terminator HIS4: histidinol dehydrogenase 3’AOX1: AOX1 3’ region Amp: Ampicillin-resistance marker fi ori: f1 bacteriophage origin. Sig: signal sequences SacI, SalI, StuI and BglII cutting site are used to

linearize the vector before transformation

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Promotor

aox1启动子： 强启动子 甲醇诱导 葡萄糖，甘油等快速碳源阻遏 表达调控技术较成熟

gap启动子 组成型强启动子 葡萄糖 强启动子 甘油 中等强启动子 甲醇 弱启动子

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Pichia pastoris strains Strain Genotype Application

X33 Wild-type Selection of Zeocin-resistant expression vectors

GS115 his4 Selection of HIS4 expression vectors

KM71 his4, aox1::ARG4;arg4

Selection of HIS4 expression vectors to generate strains with MutS phenotype

KM71H aox1::ARG4;arg4 Selection of Zeocin-resistant expression vectors to generate strains with MutS phenotype

SMD1165 his4prB1 Selection of HIS4 expression vectors to generate strains without protein B activity

SMD1168 his4pep4 Selection of HIS4 expression vectors to generate strains without protease A activity

SMD1163 his4pep4prB1 Selection of HIS4 expression vectors to generate strains without protease A and protease B activity

SMD1168H pep4 Selection of Zeocin-resistant expression vectors to generate strains without protease A

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Pichia pastoris 表达系统小结

优点有商品化宿主 /载体，操作简便真核表达系统重组蛋白质可以以胞内或胞外形式表达高密度发酵方便有翻译后加工

缺点翻译后加工形式有独特性

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Pichia pastoris 表达实验策略

外源基因克隆到 pPIC9 的 alpha 信号肽序列之后 电转化 GS115

初筛 (50ml离心管 ) 有表达 复筛 (250ml摇瓶 ) 发酵罐

无表达

pPIC3.5K

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重组酶表达小结

首选文献报道表达系统次选大肠杆菌大肠杆菌中无活性选用酵母系统根据基因来源定表达系统

BacillusStreptomycesAspergillus niger

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酶的分离提取

参见蛋白质纯化手册

发酵工程

。。。 基因工程菌发酵相对较简单

酶制备流程图

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纯度 vs 成本

StepRelativeweight

Yield(%)

Specificactivity

Totalcost

CostPer

weight

CostPer

activity

  1.000 100 1 1.00 1 1.00

1 0.250 75 3 1.10 4 1.47

2 0.063 56 9 1.20 19 2.13

3 0.016 42 27 1.30 83 3.08

4 0.004 32 81 1.40 358 4.92

5 0.001 24 243 1.50 1536 6.32

工业离心

真空转鼓离心机

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细胞破碎手段

超声波 目前只用于实验室或小规模 高压匀浆机 (high pressure homogenizer)

珠磨机 (bead mills)

freeze-presses 小规模 渗透压冲击法 自发分解 (yeast, Bacillus)

酶裂解 ( 溶菌酶 )

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细胞破碎需考虑因素Heat

All mechanical methods require a large input of energy, generating heat. Cooling is essential for most enzymes. The presence of substrates, substrate analogues or polyols may also help stabilise the enzyme.

ShearShear forces are needed to disrupt cells and may damage enzymes, particularly in the

presence of heavy metal ions and/or an air interface.]

Proteases

Disruption of cells will inevitably release degradative enzymes which may cause serious loss of enzyme activity. Such action may be minimised by increased speed of processing with as much cooling as possible. This may be improved by the presence of an excess of alternative substrates (e.g. inexpensive protein) or inhibitors in the extraction medium.

pHBuffered solutions may be necessary. The presence of substrates, substrate analogues

or polyols may also help stabilise the enzyme.

Chemical

Some enzymes may suffer conformational changes in the presence of detergent and/or solvents. Polyphenolics derived from plants are potent inhibitors of enzymes. This problem may be overcome by the use of adsorbents, such as polyvinylpyrrolidone, and by the use of ascorbic acid to reduce polyphenol oxidase action.

OxidationReducing agents (e.g. ascorbic acid, mercaptoethanol and dithiothreitol) may be

necessary.

Foaming The gas-liquid phase interfaces present in foams may disrupt enzyme conformation.

Heavy-metaltoxicity

Heavy metal ions (e.g. iron, copper and nickel) may be introduced by leaching from the homogenisation apparatus. Enzymes may be protected from irreversible inactivation by the use of chelating reagents, such as EDTA.

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Manton-Gaulin匀浆机

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从澄清液中提取酶

超滤 硫酸铵沉淀 有机溶剂沉淀 热处理

浓缩

去不耐热的杂蛋白

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双水相

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胞内酶纯化去除核酸非特异性硫酸铵沉淀 特异性带正电荷材料

( 与核酸带负电的磷酸基团作用形成复合物 )聚乙烯亚胺，阴离子洗涤剂十六烷

基三乙基溴化铵，硫酸链霉素，硫酸鱼精蛋白

牛胰核酸酶

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色谱 （层析）

离子交换色谱 吸附色谱

亲和色谱 疏水色谱

凝胶排阻色谱 （分子筛）

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酶制剂

使用添加剂 共价修饰固定化

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小结

酶的来源很多，但主要来源于微生物发酵 酶的工业化应用取决于他们的效果，成本和安全性 离心一般用于收集含酶固体

过滤更多用于液体酶回收双水相体系将会在酶回收操作中得到更多应用

制备工业用酶需尽量压缩分离提取步骤 酶制剂必须稳定，使用安全

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固定化酶优点

便于从反应体系中分离 从而易于控制反应时间，减少酶失活

可反复使用 降低用酶成本

提高酶稳定性

缺点 传质限制 动力学性质发生变化 固定化增加额外成本

a. 吸附b. 共价连接c. 包埋d. 膜限制

酶的固定化方法

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固定化酶方法比较

Characteristics    Adsorption Covalent

bindingEntrapment

Membraneconfinement

Preparation    Simple    Difficult    Difficult    Simple

Cost    Low    High    Moderate    High

Binding force    Variable Strong    Weak    Strong

Enzyme leakage    Yes    No    Yes    No

Applicability    Wide    Selective    Wide    Very wide

Running Problems    High    Low    High    High

Matrix effects    Yes    Yes    Yes    No

Large diffusional barriers    No    No    Yes    Yes

Microbial protection    No    No    Yes    Yes  

多点作用使酶稳定化

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固定化载体

Eupergit C®

Sepabeads® series

Amberzyme™ Oxirane

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Immobilized Penicillin G AcylaseBacillus megaterium Penicillin G Acylase on Eupergit®C

Cycle number : 1000

Productivity : 800 Kg 6-APA/Kg (wet form )

520 Kg 7-ADCA/Kg (wet form )

Immobilized D-amino acid oxidase and glutaryl acylase

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新型固定化方法—无载体固定化

The different approaches to the production of carrier-free immobilised enzymes: (a) crystallization; (b) aggregation; (c) spray-drying; (d) direct cross-linking. AGG, aggregates; CRY, crystals; SDE, spray-dried enzyme.

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固定化酶小结

酶的固定化使得他们能高效和连续使用 酶的固定化形式有 4 种 酶的固定化影响动力学性质 酶的固定化一般可提高其使用的经济性 酶的固定化新技术－－无载体固定化

酶反应器图解

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基础篇小结

重组微生物将是酶的最重要来源 工业用酶的分离提取对成本敏感 固定化酶是工业用酶制剂的重要形式 酶反应器对于发挥酶的催化作用也很重要

提高篇

酶的改造

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获得新酶的途径

自然界中获取有理设计新酶随机突变筛选新酶

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生物多样性与新酶的发现

嗜热菌（Thermophiles) 嗜冷菌（Phyphophiles) 嗜酸菌（ Acidophiles) 嗜碱菌（ Alkaliphiles) 嗜盐菌（Halophiles) 嗜压菌（ Barophiles)

极端微生物的特殊生长环境及代谢产物，使酶在“恶劣”环境下能够发挥高效催化作用。

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目前已经有 158 种微生物的基因组被全测序

S α I β

Distribution for penicillin G acylase

PGA precursor structure

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天然酶

自然进化中 天然酶的结构功能对应于其活细胞的生理功能而进化的

天然酶往往不适用于生物技术应用•化学 - 转化天然底物•物理 - 耐受差•生物 - 代谢调控和高转换数

•环境不同•要求不同

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改造目的

•高专一性

只催化所需反应 减少甚至没有副产物•高活性

高生产率 不易受抑制•高稳定性

存放时间长 操作稳定性高

生物催化剂应用依赖于天然酶改造或重新设计方法

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酶的改造

蛋白质工程－－有理设计通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究获取关于蛋白质物理、化学等方面的信息，在此基础上对编码该蛋白的基因进行有目的的设计改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终将其投入实际应用。

基因工程，结构生物学和生物信息学

化学修饰固定化

定向进化－－无理设计

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Timeline | 20 years of protein engineering

James A. Brannigan and Anthony J. Wilkinson. Protein engineering 20 years on. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2002, 3, 964-70

CDR, complementarity-determining regions: TyrRS, tyrosyl-tRNA synthetase

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分子生物学知识复习

中心法则

蛋白质功能＝ f( 蛋白质序列 )

改变序列影响蛋白质功能

(c)DNA序列蛋白质序列立体结构功能

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蛋白质序列空间

b

a

bbaan2020...2020 1120

b

a

b1b1aan2020...202020

a 表示最小蛋白质的氨基酸残基数， b 表示最大蛋白质的氨基酸残基数。

n个氨基酸残基组成的线性长链的序列空间为 20n

所有蛋白质都可以表示为这个 b 维空间的唯一一点，比如枯草芽孢杆菌蛋白酶 BPN’ 坐标为（ A,Q,S,V,P,Y,G,V,S,Q,I,K,A,…, A,Q,0,…,0,0,0）。

小至 100个氨基酸残基组成的酶的序列空间也大至20100

序列空间蛋白质特性 序列空间距离近蛋白质性质接近

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PAM250氨基酸相对突变率矩阵和基本氨基酸性质关系 venn图

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有理设计

根据详尽的结构功能关系知识结构一级结构 氨基酸顺序

二级结构 -螺旋 , -折叠 , 转角 , 无规卷曲

三级结构 3D 折叠 (结晶， NMR)

功能活性位点 氨基酸残基和辅因子

催化 , 特异性和动力学

调节 竞争性抑制和变构控制

怎么获得这些信息？

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序列与结构分析

多重联配 序列保守性信息同源模建 获得立体结构三维结构分析 分子图像分析

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多重联配ClustalW

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Glutaryl acylase crystal and structure

Ding Y etal. 1GHD.PDB 2000

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Crystals: 18% PEG6K, 0.1 M Bicine, pH 8.5, 0.01 M CdCl2.

Structural studies of D-hydantoinase from Burkholderia pickettii

Summary of purification of DHase from E. coli BL21(DE3)/pXZPH2

Purification step Sample vol (ml)

Total protein (mg)

Total activity (U)

Sp act (U/mg)

Purification factor

Activity yield (%)

Cell extract 25.0 600 30.8 0.05 1.0 100

Ni2+ chelate affinity column

4.0 4.4 5.0 1.13 22.6 16.6

A Ribbon diagram showing the overall structure of DHase monomer and tetramer viewed from the catalytic active site.

Xu Z etal Journal of Bacteriology 2003

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Constructed PGA-penicillin G complex

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提高热稳定性的重要全局性因素

•环区长度减少以及随之而来的二级结构增加•表面电荷相互作用•敏感氨基酸残基减少

( 如半胱氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺 )•芳香环堆积增加•疏水作用增加•金属离子结合能力提高•寡聚增加

Jason K Yano and Thomas L Poulos. New understanding of thermostable and peizostableenzymes. Current opinion in Biotechnology, 2003, 14:1-6

常用提高稳定性方法引入二硫键和 / 或盐桥

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C

C

O

O

C

C

O

O

C

C

O

O

C

C

O

O

C

C

O

O

Index 1 Index 2 Index 3 Index 4

0<OSP<0.15 0.15<OSP<0.30 0.30<OSP<0.45 0.45<OSP<0.60 0.60<OSP<0.75

Fully exposed state

Exposed state Boundary state

Buried state Well-buried state

Index 5

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氨基酸残基分布差异

高 　　　　PRO

　低　　　MET

　　低 极显著低低SER

　　（低） 低（低） ASN

高 　　　　TYR

高 　　　　TRP

　　　　低LYS

　高 极显著　高　GLU

　高　高　ARG

　　　　高 ILE

　　　低　VAL

高 极显著　　低 极显著　ALA

完全包埋包埋部分包埋 / 部分暴露暴露完全暴露　

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对于热稳定性改造的具体指导

完全暴露 SER,LYS ILE

暴露 ALA,VAL,ASN,SER ARG,GLU

部分包埋 /部分暴露 SER ?

包埋： MET ARG,GLU

完全包埋： ? ALA,TRP,TYR,PRO

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pH 曲线的改变

将蛋白质表面变得更带负电荷将提高酸性基团的 pKa 值，因为它们在离子化时丢失质子。反之，将表面变得更带正电荷则降低所有酸性基团的 pKa 值。

低离子强度时变化将最大 如果避免多电荷抗衡离子，当离子强度高至 0.1

M 时会出现明显的变化。 突变设计应避免在活性中心空穴附近聚集抗衡

离子。Russell and Fersht. Rational modification of enzyme catalysis by engineering surface charge. Nature,1987, 328 (6), 496-500

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融合蛋白质－－广义的有理设计

•组氨酸标签 (Histidine-tag, his-tag)•谷胱甘肽合成酶

(glutathione synthetase, GST)•麦芽糖结合蛋白质

(maltose binding protein, MBP)•内含肽 (Intein)•各种信号肽

改善重组蛋白可溶性，便于亲和层析纯化。。。

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1 2 3 4 5 6 7 8 9

94kd

43kd

34kd

20kd

14kd

66kd

Purification of recombinant PGAs by metal-chelate affinity chromatography

Lane1,Molecular weight marker;

Lane2, Purified Providencia rettgeri PGA; Lane3,Crude extract of induced JM109(DE3)/pETPrPGA cell;Lane4, Purified Alcaligenes faecalis PGA; Lane5,Crude extract of induced JM109(DE3)/pETAfPGA cell; Lane6, Purified Kluyvera citrophila PGA; Lane7,Crude extract of induced JM109(DE3)/pETKcPGA cell;Lane8, Purified Escherichia coli PGA; Lane9,Crude extract of induced JM109(DE3)/pETEcPGA cell.

α subunit

β subunit

Chen M etal. Manuscript in preparation

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PCR原理

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目标片段的指数扩增

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定向突变 - PCR

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有理设计小结 工具

酶数据库 Brenda

序列联配 ClustalW

同源模建 Swissmodel

分子图像 Rasmol

定点突变，序列重组 PCR

目标 热稳定性 表面氨基酸替换 催化效率 ？ 底物特异性 ？

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生物催化剂的定向进化

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高频随机突变导入方法 DNA 聚合酶 碱基错配率 / 每轮复制 大肠杆菌体内 1 X 10-10-10-8

Replinase 1.03 X 10-4

Vent(exo-) 1.9 X 10-4

Taq 2.0-21 X 10-5

KlenTaq 5.1 X 10-5

Vent 2.4-5.7 X 10-5

Pfu, PfuTurbo 1.6 X 10-6

易错 PCR error-prone PCR (= PCR with many errors/mutations)

• 无校对 DNA 聚合酶 e.g. Taq, Mutazyme• 非优化条件 e.g. Mn2+ 代替 Mg2+, 调整 4 种 dNTP 相对浓度

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Random Mutagenesis kit

突变率 0.1 － 1.6% /PCR, 相当于 1－ 7个碱基突变 / 基因

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高频随机突变导入方法以大肠杆菌 XL1-Red 作为基因复制宿

主

Mutants of the P. furiousus Alkaline Phosphatase Gene: Morphology of clones on LB plates containing BCIP indictor substrate. A: Parent Pfu alkaline phosphatase clone. B: Pfu 5. C: Pfu 5-1. D: Pfu 5-2.

XL1-Blue strain: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB lacIq ZΔM15 Tn10 (Tetr)] 正常菌株XL1-Red strain: endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac mutD5 mutS mutT Tn10 (Tetr) DNA修复缺陷

Greener, A. and Callahan, M. ( 1994), Strategies.  7: 32-34

培养到平台期 平均 2Kb 发生 1个碱基突变

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进化 逐步过程

自然进化

• 自发突变

• 重组

• 自然选择

达尔文进化理论

生命的复杂性是突变，重组和自然选择算法的结果

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人类的作物，花卉和家禽家畜育种实践有几千年历史

加速进化 快速改变

农业进化

• 自发突变

• 育种

• 筛选

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革命 极快改变

实验室进化

• 加快突变速度

• 分子育种

• 筛选

实验室进化不同于自然进化在于其明确的进化目标 . 在此意义上它是 “定向” 并且更像育种。此外，它非常快。

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加速进化 快速改变

农业进化

• 自发突变

• 育种

• 筛选

革命 极快改变

实验室进化

• 加快突变速度

• 分子育种

• 筛选

进化 逐步过程

自然进化

• 自发突变

• 重组

• 自然选择

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DNA shuffling

screen and select

* * *

*

* *

PCR

DNaseI

* * *

*

PCR

* **

* * library

Denature & anneal

5’ 5’ * *

*

Homo-duplex formation

5’ 5’ *

*

5’ 5’

**

5’ 3’3’ 5’

**

fill in & amplify

**

Error-prone PCR

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DNA Shuffling

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DNA shuffling – β-lactamase case

ββ-Lactamase -Lactamase : hydrolysis of beta-lactam antibiotics: hydrolysis of beta-lactam antibioticsββ-Lactamase -Lactamase : hydrolysis of beta-lactam antibiotics: hydrolysis of beta-lactam antibiotics

β-lactamase

AmpicillinCefotaxime

degrade

( Stemmer, W.P.C. Nature 1994 370:389-391 )( Stemmer, W.P.C. Nature 1994 370:389-391 )

TEM-1 W.T.

shuffling - 3 cycle

Back cross over - 2 cycle

X 16,000

X 32,000

MIC = 0.02 ug/ml

MIC = 640 ug/ml

periplasm

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定向进化方法比较

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Accumulation of mutations by sequential mutagenesis,pairwise recombination and poolwise recombination

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单基因 Shuffling 和多基因 Shuffling获得的突变库

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DNA Family shuffling

Parental Sequences

Random Fragmentation

Denaturization Annealing Extention Final Library

crossoverRepeated Cycles of Primerless PCR

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定向进化的基本过程Single gene

DNA shuffling

Multiple genes

DNA family shuffling

Expression and screen

Repeated as needed

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Staggered Extension Process(StEP)

Denaturation Annealing, Extension

DNA DNA

Denaturation Annealing, Extension

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RACHITT示意图

1. 两种野生型基因 A 和 B 双链 DNA处理成单链 DNA 。

2. DNaseI 处理单链 DNA ，形成许多的随机大小的片段。

3. 随机片段与单链模板杂交。4. 通过两端引物的 PCR扩增反应得

到具有目的片段大小的杂合基因。

14 crossover vs 1-4 crossover

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DNA shuffling - efficiency depends on homology

Homo-duplex formation

5’ 3’ 3’ 5’

5’ 3’3’ 5’

5’ 3’ 3’ 5’

Hetero-duplex formation

5’ 3’3’ 5’

PCR PCR

Resembles synthesis of synthetic gene

(Directed Mutagenesis)

Resembles synthesis of gene fusions

(Directed Mutagenesis)

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Incremental Truncation for the Creation of HYbrid enzymes (ITCHY)

对随机挑选的混组酶进行测序证明ITCHY 比普通混组方法在两个基因的非同源区发生了更多的交叉。而且通过 ITCHY 发现的嵌合酶比普通 DNA混组方法获得杂合酶的活性相同或更高。

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Sequence Homology-IndependentProtein Recombination (SHIPREC)

应用于膜结合人细胞色素P450 和可溶性细菌 P450亚铁血红素结构域的混组，将混组基因库和氯霉素乙酰基转移酶基因融合，筛选到 2个在细菌中可溶性比人 P450 高的 P450杂合酶。

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• error-prone PCR2-6 nucleotide mutations / DNA molecule1-3 amino acid substitutions / protein molecule

• DNA shufflinghigh homology at DNA level (> 60% identity) - fragmentation by DNase (multiple recombination)- restriction enzymes (multiple recombination)

low homology at DNA level - domain swapping (single-site recombination; ITCHY)- shuffling of “synthetic genes” (multiple recombination)

实验室进化 - 进化方法比较

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高通量筛选－－无理设计的有理部分

selection选择 screening 筛选

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定向进化的应用

BiocatalystsBiocatalystsBiocatalystsBiocatalystsProtein DrugProtein DrugProtein DrugProtein Drug

Evolved VectorEvolved VectorEvolved VectorEvolved Vector

VaccineVaccineVaccineVaccineGene Gene

TherapyTherapyGene Gene

TherapyTherapy

Small Molecule Small Molecule PharmaceuticalsPharmaceuticalsSmall Molecule Small Molecule

PharmaceuticalsPharmaceuticals

AntibodyAntibodyAntibodyAntibody Strain EvolutionStrain EvolutionStrain EvolutionStrain Evolution

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Milestones in Directed Evolution

Kauffman patent ’85

DNA shuffling ’94

Family shuffling ’98

Genome shuffling ’02

Genetic circuit ’02

1st industrial biotechnololgy & bioprocessing ’04

’89. Applied Molecular Evolution

’94. Diversa

’97. Maxygen ’99.00. IPOs; Maxygen, Diversa, AME,

Genencor ’02. Codexis & Verdia spinoff

’03. AME merger to Lilly

’04. Dupont, aq. Verdia(MaxyAg)’04. Codexis & Pfizer collaboration

2000

1990

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•找到减少所需库容量的方法选择亲本基因

• 发展高效快速的筛选方法发展智能测定

定向进化的局限性

含 100氨基酸的酶 : 有 20100 种可能组合筛选包含所有可能突变体的库不现实：

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定向进化小结

定向进化是更有效的蛋白质改造方法 突变 / 重组方法成熟 筛选能力是成败关键

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有理设计与定向进化的有机结合将是解决复杂酶设计问题的有效途径

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• 选择起始基因重组表达，建立测活体系和 / 或筛选方法

• 如果知道结构功能关系，第一步先采用有理设计方法

•此后，以随机突变技术微调得到的突变体 , 并辅以高效的体内或体外筛选

小结 蛋白质工程实验策略

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生物催化工艺开发 Development of biocatalytical processes

克隆cloning 改造 engineering

发酵 fermentation

生物转化biotransformation

表达 expression

纯化 purification

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生物催化剂开发时间表 用于生产新产品或改进已有工艺

克隆 表达 固定化纯化 改造

生物信息学 表达库

大肠杆菌酵母 芽孢杆菌

金属螯合层析 环氧树脂氨基树脂IDA树脂

定向进化 有理设计

2-30 天 2-30 天 2-15 天 2－ 7 天 …

筛选 生物催化工艺设计一个月开发出第一版生物催化剂

快速开发 … 2周到 3 个月

系列青霉素 G酰化酶， D-氨基酸氧化酶，头孢菌素酰化酶，海因酶，氨甲酰水解酶，乙酰葡萄糖胺异构酶和乙酰神经氨酸醛缩酶

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课后请多提宝贵意见助我进步 , 再次谢谢大家

！

谢谢！

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