分子生物学实验 Experiments of molecular biology

分子生物学实验分子生物学实验Experiments of molecular biology Experiments of molecular biology

一、 教学目的一、 教学目的 《分子生物学实验》课程主要从提取和分析遗传物质和基因为基础，《分子生物学实验》课程主要从提取和分析遗传物质和基因为基础，

从从 DNADNA 的分离、纯化、克隆到目的基因的鉴定、表达等过程设计了的分离、纯化、克隆到目的基因的鉴定、表达等过程设计了一系列基础实验，形成一个涵盖现代分子生物学基础实验内容的实验一系列基础实验，形成一个涵盖现代分子生物学基础实验内容的实验课程教学体系，包括现代分子生物学基本技术方法，帮助学生巩固有课程教学体系，包括现代分子生物学基本技术方法，帮助学生巩固有关分子生物学的相关理论知识，并较系统地学习和掌握分子生物学的关分子生物学的相关理论知识，并较系统地学习和掌握分子生物学的基本实验方法、技术和操作技能。基本实验方法、技术和操作技能。

二、 教学要求二、 教学要求 通过学习使学生对所有实验内容有一个整体的了解；通过学习使学生对所有实验内容有一个整体的了解； 熟悉分子生物学实验技术（包括熟悉分子生物学实验技术（包括 DNADNA 技术、技术、 RNARNA 技术、蛋白质技术、技术、蛋白质技术、

杂交技术等）的基本原理方法，掌握杂交技术等）的基本原理方法，掌握 DNADNA 提取纯化提取纯化 ,, 定量定量 , DNA, DNA 克克隆隆 , , 电泳等基本实验技术，重点掌握质粒电泳等基本实验技术，重点掌握质粒 DNADNA 纯化技术纯化技术 , , 酶切技术酶切技术 , , DNADNA 片段回收片段回收 ,, 重组连接技术重组连接技术 , , 电泳技术电泳技术 , , 转化技术转化技术 , , 基本基本 PCRPCR 技技术以及蛋白质的诱导表达技术等；术以及蛋白质的诱导表达技术等；

要求学生分子生物学实验实验室操作安全与污染物处理；要求学生分子生物学实验实验室操作安全与污染物处理； 学习仪器设备的使用学习仪器设备的使用

分子生物学实验室要求分子生物学实验室要求1.1. 穿实验服进入实验室；穿实验服进入实验室；2.2. 保持实验室安静； 保持实验室安静； 3.3. 保持实验室清洁干净和实验台面整洁；保持实验室清洁干净和实验台面整洁；4.4. 实验前要预习实验教材；实验前要预习实验教材；5.5. 不准穿拖鞋进入实验室；不准穿拖鞋进入实验室；6.6. 不准在实验室吃东西、喝水；不准在实验室吃东西、喝水；7.7. 要求刷卡进入实验室； 要求刷卡进入实验室；

实验一核酸的提取实验一核酸的提取（质粒（质粒 DNADNA 的提取和纯化）的提取和纯化）

【目的要求】【目的要求】11 ．学习载体的基本结构．学习载体的基本结构22 ．了解碱裂解法质粒提取过程中各步骤的设．了解碱裂解法质粒提取过程中各步骤的设计思想；计思想；33 ．掌握碱裂解法提取质粒的原理方法和各项．掌握碱裂解法提取质粒的原理方法和各项基本技术；基本技术；

【实验原理】【实验原理】 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNADNA 和线性和线性

染色体染色体 DNADNA 在拓扑学上的差异来分离质粒在拓扑学上的差异来分离质粒 DNADNA 。在。在 pHpH值介于值介于 12.0-12.512.0-12.5 这个狭窄的范围内，线性的这个狭窄的范围内，线性的 DNADNA 双螺双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒粒 DNADNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入仍会紧密地结合在一起。当加入 pH4.8pH4.8 乙酸钾高盐缓冲液乙酸钾高盐缓冲液恢复恢复 pHpH 至中性时，共价闭合环状的质粒至中性时，共价闭合环状的质粒 DNADNA 的两条互的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体体 DNADNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNADNA 与不稳定的大分子与不稳定的大分子 RNARNA ，蛋白质，蛋白质 -SDS-SDS 复合物等一复合物等一起沉淀下来而被除去。起沉淀下来而被除去。

【实验材料和用品】【实验材料和用品】 恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、压灭菌锅、 EnpendorfEnpendorf 管、含管、含 pET-29apET-29a 质质粒及含目的基因质粒的大肠杆菌、碱裂解粒及含目的基因质粒的大肠杆菌、碱裂解溶液，酚、氯仿、乙醇、溶液，酚、氯仿、乙醇、 TETE 缓冲液、胰缓冲液、胰 RRNANA 酶酶

【实验步骤】

1. Pick single colony and inoculate 5 ml of LB broth containing 200 g/l Ampicillin or 1mg/5ml with a loosened cap and a piece of tape to hold it in place. Shake at 250 RPM 37oC overnight.

2. Centrifuge 1.5mL cells in 1.5 mL Eppendorf tube at top speed for 1 minute. Discard supernatant. 

3. Resuspend cell pellet in 100 ul of GTE buffer (50 mM Glucose, 25 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, pH 8).  Vortex gently if necessary.

4. Add 100 ul of NaOH and SDS lysis solution (0.2 M NaOH, 1% SDS) respectively. Invert tube 6-8 times.

5. IMMEDIATELY add 150 ul of 5 M potassium acetate solution (pH 4.8). This solution neutralizes NaOH in the previous lysis step while precipitating the genomic DNA and SDS in an insoluble white precipitate. Spin at top speed 1 min.

6. Transfer supernatant to new tube, being careful not to pick up 6. Transfer supernatant to new tube, being careful not to pick up any white flakes.  Precipitate the nucleic acids with 0.5mL of iany white flakes.  Precipitate the nucleic acids with 0.5mL of isopropanol on ice for 10 minutes and centrifuge at top speed fsopropanol on ice for 10 minutes and centrifuge at top speed for 1 minute.or 1 minute.

7. Aspirate off all the isopropanol supernatant. Dissolve the pellet 7. Aspirate off all the isopropanol supernatant. Dissolve the pellet in 0.4 ml of in 0.4 ml of TE bufferTE buffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.5). (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.5). Add 10ul of RNAse A solution (20 mg/ml stock stored at -20 °Add 10ul of RNAse A solution (20 mg/ml stock stored at -20 °C), vortex and incubate at 37 °C for 20 to 30 minutes to digest C), vortex and incubate at 37 °C for 20 to 30 minutes to digest remaining RNA. remaining RNA.

8. Extract proteins from the plasmid DNA using phenol/chlorofor8. Extract proteins from the plasmid DNA using phenol/chloroform/ isoamyl alcohol (PCIA) by adding about 0.4 ml. Vortex vigm/ isoamyl alcohol (PCIA) by adding about 0.4 ml. Vortex vigorously for 30 seconds. Centrifuge at full speed for 5 minutes orously for 30 seconds. Centrifuge at full speed for 5 minutes at room temperature. Note organic PCIA layer will be at the bat room temperature. Note organic PCIA layer will be at the bottom of the tube. ottom of the tube.

9. Remove upper aqueous layer containing the plasmid DNA care9. Remove upper aqueous layer containing the plasmid DNA carefully avoiding the white precipitated protein layer above the Pfully avoiding the white precipitated protein layer above the PCIA layer, transferring to a clean 1.5 ml eppendorf tube. CIA layer, transferring to a clean 1.5 ml eppendorf tube.

10. Repeat 9 step again.10. Repeat 9 step again.11. Add 1 ml of absolute ethanol to precipitate the plasmid DNA 11. Add 1 ml of absolute ethanol to precipitate the plasmid DNA

and 50 ml of 3 M Sodiun acetate solution on ice for 10 minuteand 50 ml of 3 M Sodiun acetate solution on ice for 10 minutes. Centrifuge at full speed for 5 minutes at room temperature. s. Centrifuge at full speed for 5 minutes at room temperature.

12. Discard ethanol solution and resuspend DNA pellet in 50ul of 12. Discard ethanol solution and resuspend DNA pellet in 50ul of TE buffer. TE buffer.

13. Dissolve 5uL in 995ul of water, and spec (blank spectrophoto13. Dissolve 5uL in 995ul of water, and spec (blank spectrophotometer to water). The absorbance at 260 nm multiplied by ten is meter to water). The absorbance at 260 nm multiplied by ten is the concentration of the DNA in units of mg/ml for a 1 cm patthe concentration of the DNA in units of mg/ml for a 1 cm pathlength cuvette (i.e. 50 mg/ml/OD 260nm). hlength cuvette (i.e. 50 mg/ml/OD 260nm).

14.Store it at -20 °C.14.Store it at -20 °C.

核酸的分离与纯化

不论是基因工程还是蛋白质工程，核酸分子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是生化与分子生物学研究中非常重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。

核酸的种类： 真核生物的染色体 DNA 为双链线性分子；真核细

胞器 DNA 为双链环状分子； 原核生物的基因组 DNA 、质粒 DNA 为双链环状分

子； RNA 分子在大多数生物体内均是单链线性分子；

不同类型的 RNA 分子可具有不同的结构特点，如真核 mRNA 分子多数在 3’ 端带有 ploy(A) 结构 ;tRNA 的三叶草结构。

病毒的 DNA 、 RNA ，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状等。

一、核酸分离提取的原则

1.分离纯化核酸总的原则

① 应保证核酸一级结构的完整性；

② 排除其它分子的污染，保证较高纯度。

3. 为了保征分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中，应注意以下事宜：① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；② 减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4-10 条件下进行；

③ 减少物理因素对核酸的破坏，物理破坏因素主要是机械剪切力，其次是高温。 ④ 防止核酸的生物降解，细胞内或外界的各

种核酸酶（ DNA酶、 RNA酶）酶解核酸链中

的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。

其中 DNA 酶，需要金属二价离子 Mg2+ ， Ca2+

的激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸 (EDTA) 、柠檬酸盐，基本上可以抑制 DNA 酶的活性。 而 RNA 酶，不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是 RNA 提取过程中的主要危害因素。

提取高质量基因组提取高质量基因组 DNADNA的主要用途：的主要用途： PCRPCR 扩增的模板扩增的模板 用于构建基因组文库用于构建基因组文库 用于用于 Southern blot Southern blot 杂交分析杂交分析

二、真核细胞染色体 DNA 的制备

真核细胞染色体 DNA 的制备过程

1. 真核细胞的破碎 （ 1）物理方式 :超声波法、匀浆法、液氮破碎法、 Al2O3 粉研磨法等。这些物理操作均可导致 DNA 链的断裂。 （ 2）为了获得大分子量的 DNA ，一般采用蛋白酶 K和去污剂温和处理法。

2. 去除蛋白质 常用酚、氯仿抽提。反复的抽提操作对 DNA 链的机械剪切机会较多，所以有人使用高浓度甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可以获得 200kb 以上的 DNA 片段，适用于粘粒 (cosmid) 构建基因组文库。 根据不同的实验要求，可选择不同的实验方法制备真核细胞染色体 DNA 。

3.DNA 沉淀：一般采用 2倍体积乙醇沉淀 或用异丙醇（ 0.6 ）4.DNA 溶解：一般采用 TE

三、 RNA 的分离与纯化 - 真核细胞 RNA 的制备

从细胞中分离 RNA 的纯度与完整性对于许多分子生物学实验至关重要。如 Northern blot及 cDNA 合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上决定于 RNA 的质量。

RNA 主要由以下几类分子组成： rRNA( 占 RNA 总量的 80 ％— 85 ％ )、 tRNA 和核内小分子 RNA( 占 10 ％ -15 ％ )、 mRNA( 占 1％～ 5％ )。 rRNA 在总 RNA 分子中含量最丰富，由 28S、18S、 5S及 4S几类组成，它们之间同源性大，分子量变化不大，所以可根据它们的密度和分子大小，通过密度梯度离心，凝胶电泳或离子交换层析进行分离。

mRNA 分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数 mRNA 分子 ( 除血红蛋白及有些组蛋白 mRNA 以外 ) ，均在 3’端存在20-250个多聚腺核苷酸 poly(A) 。利用此特征，可很方便地从总 RNA 中，用寡聚 (dT)亲和层析柱分离 mRNA 。 mRNA 分子群体编码细胞内所有的多肽和蛋白质，而 mRNA 是分子生物学的主要研究对象之一。

鉴定所提取总 RNA 分子的质量，可以通过琼脂糖电泳后观察是否有明显得 28S、 18S 条带来判断。

Fig.1 Total RNA isolated from Trichoderma reesei induced by different inducers图 1. 木霉总 RNA 的分离1. 微晶纤维素 2. 天然稻草粉

RNA RNA 分离的关键因素是尽量减少分离的关键因素是尽量减少RNARNA 酶的污染！酶的污染！

如何创造一个无如何创造一个无 RNaseRNase 的环境 ？的环境 ？ 极力避免外源极力避免外源 RNaseRNase 的污染：主要来源的污染：主要来源

于操作者的手、实验的器皿和试剂于操作者的手、实验的器皿和试剂 尽力抑制内源性尽力抑制内源性 RNaseRNase 的活力：主要来的活力：主要来

源于样品中的组织细胞。源于样品中的组织细胞。

(1) 操作者的手直接触摸之处，毫无疑问会留

下 RNase ，说话带出的唾液也富含 RNase 。

故整个操作过程中，应戴口罩和手套。

(2)空气中飞尘携带的细菌、霉菌等微生物，

也是污染外源 RNase 的一条途径，所以操作

过程应在比较洁净的环境中进行。

怎样去除外源性 RNase 的污染？

(3)玻璃器经过常规洗净后，应用 0.1 ％焦碳酸

二乙酯 (diethyl pyrocarbonate ， DEPC)浸

泡处理 (37℃， 2 小时 ) ，再用双蒸灭菌水

漂洗几次。高压消毒去除 DEPC ，然后 200℃

烘烤 4 小时以上或 180℃烘烤过夜。

(4)塑料器材最好使用灭菌的一次性塑料用品，

Eppendorf 管、微量加样吸头最好是新的，

使用前进行高压蒸汽消毒。

(5) 所有溶液应加 DEPC 至 0.1 ％，室温处理过夜，

或室温下磁力搅拌 20 分钟，然后高压蒸汽灭

菌处理（或加热至 70℃1 小时或 60℃过夜，

以去除所有残留的 DEPC ）。

(6) 所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干

烤处理的称量勺。所有操作均应在冰浴中进行，

低温条件可减低 RNA 酶的活性。

要尽可能早地去除细胞内蛋白，加入 RNa

se 抑制剂，力争在提取的起始阶段对 RNase

活力进行有效地抑制。

如何抑制内源性 RNase 的活性？

RNase 抑制物：（ 1）低特异性 RNase 抑制物： 不同类型的低特异性 RNase 抑制物均可不同程度地抑制 Raise 的活性，其中包括DEPC 皂土 (bentonite):Al2O3·4SiO2·H2O复合硅酸盐 (Macaloid) 肝素氧钒基—核苷复合物多胺

（ 2）去除蛋白质的物质：蛋白质变性剂：酚、氯仿；尿素蛋白酶 K去污剂： SDS、十二烷酰肌氨酸钠 (sarkosyl) 、脱氧胆酸钠 (DOC) 是阴离子去污剂解偶剂 (胍类 ) ：盐酸胍、异硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离，所以又称解偶剂。

（ 3） RNase 的特异抑制剂 RNase阻抑蛋白 (RNasin) ： 这是一类从大鼠肝或人胎盘中提取出来的酸性糖蛋白质。 RNasin能与 RNase非共价结合从而抑制它们的活力， RNasin 是 RNA 酶的一种非竞争性抑制剂。抑制效果较好，被广泛用于体外翻译体系、 mRNA 反转录合成 cDNA及体外转录实验。

You will need: You will need: Guanidine isothiocyanate (Sigma)Guanidine isothiocyanate (Sigma)

1M sodium citrate, pH 7 (DEPC-treated, autoclaved)1M sodium citrate, pH 7 (DEPC-treated, autoclaved)Sarcosyl (Na-lauryl sarcosine, Sigma)Sarcosyl (Na-lauryl sarcosine, Sigma)b-mercaptoethanol (Sigma)b-mercaptoethanol (Sigma)2M sodium acetate, pH4 (DEPC-treated, autoclaved)2M sodium acetate, pH4 (DEPC-treated, autoclaved)3M sodium acetate, 100mM magnesium acetate, pH 5.23M sodium acetate, 100mM magnesium acetate, pH 5.2Absolute ethanolAbsolute ethanolPropan-2-ol (isopropanol)Propan-2-ol (isopropanol)70% ethanol (made with DEPC-treated, autoclaved water)70% ethanol (made with DEPC-treated, autoclaved water)0.5% SDS (made with sterile, DEPC-treated water) 0.5% SDS (made with sterile, DEPC-treated water) Solution D - 4M guanidine isothiocyanate, 25mM sodium citrate, Solution D - 4M guanidine isothiocyanate, 25mM sodium citrate, pH7, 0.5% sarcosyl, 100mM b-mercaptoethanol. pH7, 0.5% sarcosyl, 100mM b-mercaptoethanol.

Solution D can be made and stored at 4°C without b-mercaptoetSolution D can be made and stored at 4°C without b-mercaptoethanol for several months. b-mercaptoethanol should be added thanol for several months. b-mercaptoethanol should be added to 100mM immediately prior to use. b-mercaptoethanol is used to o 100mM immediately prior to use. b-mercaptoethanol is used to prevent the reformation of the intra-molecular disulphide bridges prevent the reformation of the intra-molecular disulphide bridges , one of the reasons for the extreme stability of ribonucleases. , one of the reasons for the extreme stability of ribonucleases.

1) Tissue is homogenized as rapidly as possible, at 4°C, in solution D (500ul per 50mg tissue) with an eppendorf pestle hom1) Tissue is homogenized as rapidly as possible, at 4°C, in solution D (500ul per 50mg tissue) with an eppendorf pestle homogenizer until a smooth, lysed, homogenous suspension is obtained. ogenizer until a smooth, lysed, homogenous suspension is obtained.

2) Add 50ul 2M sodium acetate, pH4.0 and mix vigorously. 2) Add 50ul 2M sodium acetate, pH4.0 and mix vigorously. 3) Add 500ul phenol and mix vigorously. 3) Add 500ul phenol and mix vigorously. 4) Add 100ul chloroform, mix vigorously and incubate on ice for 15 minutes. 4) Add 100ul chloroform, mix vigorously and incubate on ice for 15 minutes. 5) Centrifuge mixture at 10,000g for 10 minutes in a microfuge at 4°C. 5) Centrifuge mixture at 10,000g for 10 minutes in a microfuge at 4°C. 6) Remove upper, aqueous phase to a clean, sterile, DEPC-treated eppendorf tube. After centrifugation, RNA is present in t6) Remove upper, aqueous phase to a clean, sterile, DEPC-treated eppendorf tube. After centrifugation, RNA is present in t

he aqueous phase while, due to protonation at the acidic pH used, genomic DNA is partitioned into the phenol phase. he aqueous phase while, due to protonation at the acidic pH used, genomic DNA is partitioned into the phenol phase. 7) Extract the upper aqueous layer with an equal volume phenol/chloroform and centrifuge as before. Repeat the extraction7) Extract the upper aqueous layer with an equal volume phenol/chloroform and centrifuge as before. Repeat the extraction

s until no interface material is seen. s until no interface material is seen. 8) Precipitate the aqueous phase by the addition of an equal volume (500ul) of propan-2-ol. Incubate at -20°C for 20 minute8) Precipitate the aqueous phase by the addition of an equal volume (500ul) of propan-2-ol. Incubate at -20°C for 20 minute

s. s. 9) Pellet RNA by centrifugation at maximum speed in a microfuge for 10 minutes. 9) Pellet RNA by centrifugation at maximum speed in a microfuge for 10 minutes. 10) Wash the RNA once in 70% ethanol and vacuum dry. 10) Wash the RNA once in 70% ethanol and vacuum dry. 11) Re-dissolve in 200ul 0.5% SDS at 65°C. 11) Re-dissolve in 200ul 0.5% SDS at 65°C. 12) Extract with an equal volume (200ul) of phenol/chloroform as above. Repeat until no interface material is visible. 12) Extract with an equal volume (200ul) of phenol/chloroform as above. Repeat until no interface material is visible. 13) Precipitate pure RNA by the addition of 20ul 3M sodium acetate, 100mM acetate, pH 5.2 and 500ul absolute ethanol. In13) Precipitate pure RNA by the addition of 20ul 3M sodium acetate, 100mM acetate, pH 5.2 and 500ul absolute ethanol. In

cubate at -20°C for 20 minutes. cubate at -20°C for 20 minutes. 14) Pellet RNA by centrifugation at maximum speed in a microfuge for 10 minutes. 14) Pellet RNA by centrifugation at maximum speed in a microfuge for 10 minutes. 15) Wash the RNA once in 70% ethanol and vacuum dry. 15) Wash the RNA once in 70% ethanol and vacuum dry. 16) Dissolve RNA in appropriate buffer i.e. DEPC-treated, sterile TE, pH 8 or 0.5% SDS if no enzymic manipulation of the R16) Dissolve RNA in appropriate buffer i.e. DEPC-treated, sterile TE, pH 8 or 0.5% SDS if no enzymic manipulation of the R

NA is needed. SDS is an inhibitor of ribonucleases. NA is needed. SDS is an inhibitor of ribonucleases. RNA quality can be assessed by electrophoresis under denaturing conditions using agarose/formaldehyde gels and the MORNA quality can be assessed by electrophoresis under denaturing conditions using agarose/formaldehyde gels and the MO

PS buffer system.PS buffer system.