- Requerimientos nutricionales (alimento) -Condiciones físicas (Temperatura, pH, actividad del agua…)

CRECIMIENTO MICROBIANO

¿QUE NECESITAN LOS ORGANISMOS PARA VIVIR?

- Requerimientos nutricionales (alimento)

-Condiciones físicas (Temperatura, pH, actividad del agua…)

REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

Los organismos necesitan obtener energía y materias primas para poder realizar sus actividades metabólicas y desarrollar todo su ciclo vital.

En términos nutricionales y de acuerdo a la cantidad se puede

decir que requieren de:

MACRONUTRIENTES MICRONUTRIENTES FACTORES DE CRECIMIENTO

MACRONUTRIENTES

Agregados en cantidades de gramos por litro

que están representados por las fuentes de C, N,

S, P, K y Mg.

o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por litro.

MICRONUTRIENTES

FACTORES DE CRECIMIENTO

Componentes orgánicos que no son sintetizados ni metabolizados por las células, sino incorporados a estructuras celulares (vitaminas, pseudovitaminas).

COMPOSICIÓN ELEMENTAL DE UN MICROORGANISMO

Componentes de las células (% peso seco)

 Carbono  50%  Oxígeno 32%

 Nitrógeno 14% (NH4 )  Fósforo 3% (PO 4

3-) Azufre 1% (SO4

2-) Elementos traza  Fe, K, Mg, Mn,

Co, Mb, Cu y Zn.

Elemento Bacterias Levaduras MohosCarbono 46-52 46 - 52 45-55

Hidrógeno Entre 8 y12 Entre 8 y12 Entre 8 y12

Oxígeno 18 - 24 18 - 24 18 - 24

Nitrógeno Entre 10 y 14 Entre 5 y 9 Entre 3 y 7

Magnesio 0,1 - 0,5 0,1 - 0,5 0,1 - 0,3

Fósforo 2,0 - 3,0 0,8 - 0,25 0,4 - 4,5

Azufre 0,1 - 1,0 0,01 - 0,025 0,1 - 0,5

Calcio 0,01 - 1,0 0,1 - 0,3 0,1 - 1,4

Potasio 1,0 - 4,5 1,0 - 4,0 0,2 -2,5

Hierro 0,02 - 0,2 0,01 - 0,5 0,1 - 0,2

Otros <0,01 <0,01 <0,01

COMPOSICIÓN ELEMENTAL DE CÉLULAS MICROBIANAS (% PESO EN BASE SECA)

Compuesto Bacterias Levaduras MohosProteínas 50 - 60 35 - 60 25 - 40

Carbohidratos Entre 6 - 15 30 - 45 40 - 55

Lípidos Entre 5 y 10 Entre 5 y 10 Entre 5 y 10

Ac. Nucléicos 15 - 25 Entre 5 y 15 Entre 2 y 10

Cenizas Entre 4 y 10 Entre 4 y 10 Entre 4 y 10

COMPOSICIÓN DE BIOMOLÉCULAS EN CÉLULAS MICROBIANAS (% PESO EN BASE

SECA)

RELACION DE COMPOSICIONES EN LA FORMULACIÓN DE UN

MEDIO

C:N:P100:10:(1-

5)

FACTORES FÍSICO-QUÍMICOS

•Temperatura•pH

•Actividad del agua (aw)•Potencial Redox

TEMPERATURA

Relación temperatura-velocidad de crecimiento (ecuación de Arrhenius)

k(T)= A*exp(-Ea/RT)

k(T): constante cinética (dependiente de la temperatura)

A: factor preexponencial o factor de frecuencia. Refleja la frecuencia de las colisiones.

Ea: energía de activación, expresada en kJ/mol.

R: constante universal de los gases. Su valor es 8,3143 J·K-1·mol-1

T: temperatura absoluta [K]

EFECTOS BIOLÓGICOS DE LA TEMPERATURA EN LA CÉLULA

Temperaturas cardinales:

mínima, máxima y óptima

CLASES DE MICROORGANISMOS SEGÚN LA TEMPERATURA DE

CRECIMIENTO

PH

Acidófilos Neutrófilos Alcalófilos

Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen más o menos amplio de pH (alrededor de un óptimo), los cambios bruscos pueden ser lesivos (afectando a la membrana y al transporte de solutos, e inhibiendo enzimas).

Efectos del pH sobre la velocidad de crecimiento:

a. Hongos. b. Bacterias

ACTIVIDAD DE AGUA (AW)

El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metabólicamente. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, disminuye su actividad de agua.

aW = P/Po

P = presión de vapor del agua en una soluciónPo = presión de vapor del agua pura

0 < aW < 1

ACTIVIDAD DE AGUA DE DIVERSAS SUSTANCIAS

Actividad de

agua aw

Material Organismo que crece

1.0000.9950.9800.9500.9000.8500.800

0.7500.700

Agua puraSangre HumanaAgua MarinaPanJarabe de arce, jamónChorizoPasteles de frutas, mermeladas Pescado saladoCereales, caramelosFrutos secos

Caulobacter SpirillumStreptococcus, E. coliPseudomonas, VibrioBacilos Gram positivosCocos Gram positivosLevadurasHongos filamentososHalobacterium, HalococcusHongos xerofílicos

ACTIVIDAD DEL AGUA PARA DIVERSOS MICROORGANISMOS

CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS DE ACUERDO A SU TOLERANCIA A LAS SALES DISUELTAS EN EL AGUA

POTENCIAL REDOX

Cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo.

CAPACIDAD DEL SUSTRATO DE:

ACEPTAR ELECTRONES

DONAR ELECTRONES

CARACTERÍSTICA OXIDANTE

CARACTARÍSTICA REDUCTORA

CLASIFICACIÓN DE LOS ORGANISMOS CON RESPECTO

AL CONSUMO DE OXÍGENO

Aerobios

Microaerófilos

Anaerobios facultativos

Anaerobios estrictos u obligados

Hay microorganismos que viven en ambientes anaerobios que llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor final de electrones que actúa como oxidante ambiental. (nitratos (NO3

-), sulfatos (SO42-) u otros

compuestos orgánicos oxidados).

CRECIMIENTO

En Organismos multicelulares

En Unicelulares

Implica un aumento ordenado de todos los componentes de un organismo y no solamente de alguno de ellos.

El crecimiento conduce a un aumento en el número de células más que en el tamaño celular.

DIVISIÓN CELULAR EN ORGANISMOS UNICELULARES

¿VIABILIDAD DE LOS MICROORGANISMOS?

Con los nutrientes necesarios y las condiciones físico-químicas adecuadas se puede realizar el cultivo de microorganismos de las siguientes formas:

- Batch (lotes)

- Fed-Batch (lotes alimentados)

- Continuo

CICLO DE CRECIMIENTO DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS

FASE LAGEtapa lenta o de retardo lag:- Adaptación enzimática al tipo de sustrato.- Adaptación a la concentración y condiciones de

operación.

Las células están vivas pero no se reproducen (hacen un censo del medio y las condiciones

físicas)

CRECIMIENTO EXPONENCIAL

Es el tipo de crecimiento donde el número de células se duplica cada cierto tiempo

VARIACION DE LA BIOMASA

La velocidad en la variación de la concentración de celular conocida también como la VELOCIDAD DE CRECIMIENTO en el número de células o en la masa celular) se puede expresar así:

dN/dt = (biomasa que nace)-(biomasa que muere)

dN/dt = µN - KdN

dN/dt=µN

dN/dt=0dN/dt=-Kd

N

Donde:dN/dt= rata de crecimientoN= Número de células o biomasa en el tiempo t,µ= velocidad específica de crecimiento (t-1 ),Kd = constante de velocidad de muerte ceular

Tiempo de

generación tg

Velocidad específica de

crecimiento µ

Constante de

velocidad K

El tiempo requerido para duplicar el número de células de una población

Cambio instantáneo en el # relativo de células en un intervalo de tiempo

El recíproco del tiempo de generación (generaciones/unidad de tiempo)

CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR EN

EL TIEMPO

Donde: N= Número de células o biomasa en el tiempo (t), No = Concentración inicial de células o biomasa,

n= número de generaciones,tg = tiempo de generación,

t= tiempo,K= constante de crecimiento

Nf =No 2nn=t/

tg

Nf =No 2t/tg

ln(Nf)=ln(No ) + [ln(2)/tg ]*t

tg=t*ln(2)/[ln(Nf)-ln(No )]

K=3,32*[log(Nf )-log(No )]/(tf – to )

K=1/tg

Los tiempos de generación varían ampliamente

El más corto conocido es de alrededor de 6 min/generación.

Algunas bacterias tienen tiempos de generación de horas, días, semanas, meses.

Bajo condiciones dadas de crecimiento (medio, temperatura, pH, etc) cada especie bacteriana tiene un tiempo de generación determinado genéticamente

VARIACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR

Donde: Variación de la concentración celular en el tiempo,

N: Concentración celular en tiempo (t), µ: Velocidad específica de crecimiento

(t-1 )

N=No expµt

Integrando

ln(N)=ln(No ) + µ*t

N=No expµt

ln(N)=ln(No ) + [ln(2)/tg ]*t

Linealizando

µ= [ln(2)/tg ]

CONSUMO DE SUSTRATO

Prolongar la fase log

Medio fresco

A medida que aumenta la concentración celular, la concentración de sustrato disminuye.

(dN/dt)=YS (-dS/dt)

Donde: dN/dt: Variación de la concentración celular en el tiempo,

dS/dt: Variación en la concentración de sustrato en el tiempo,

-YS : es el rendimiento de utilización de sustrato.

YS =(dN/-dS)

YS =(Nf – No )/(Sf – So )

(dN/dt)=YS (-dS/dt)

(1/N)*(dN/dt)=YS *(-dS/dt)*(1/N)

qs =(-dS/dt)(1/N)

µ=(1/N)*(dN/dt) µ=YS qs

Dividiendo por 1/N

Donde qs es la velocidad específica instantánea de consumo de sustrato por el microorganismo

en un intervalo de tiempo

Hay una compensación entre la tasa de consumo de sustrato y el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de sustrato tienen rendimientos mas bajos y viceversa.

µ=YS qs

CRECIMIENTO CELULAR CON SUSTRATOS

MÚLTIPLES

-Opcion A: consumo simultáneo -Opcion B: crecimiento diaúxico

ETAPA ESTACIONARIA

Elevada concentración de biomasa- Escasez de sustrato- Crecimiento lento- Sustrato usado básicamente para

mantenimiento

Velocidad de crecimiento = velocidad de muerte

(dN/dt)=0CRECIMIENTO

CRÍPTICO

Donde: mS: coeficiente cinético de mantenimiento celular,

kgS/(kgN*h)

Expresión cinética del proceso de mantenimiento

(dS/dt)=-ms N

ETAPA DE MUERTE O LISIS CELULAR

Expresión cinética del proceso de muerte celular

(dN/dt)=-Kd N

Muerte significa la pérdida irreversible de la capacidad para reproducirse (crecer y dividirse). Designar a una célula microbiana como muerta no implica su inactividad metabólica.

PROBLEMA

Un fermentador de 10 litros de medio es inoculado con 500 ml de inóculo de 4,1 g/l. Se sabe que si se deja crecer la cepa, al cabo de 6 horas la biomasa en el fermentador será de 6 g/l.

Determinar el tiempo de duplicación y el tiempo que deberá permanecer la cepa en el fermentador para alcanzar la misma concentración del inóculo.

RELACIÓN ENTRE LA VELOCIDAD ESPECÍFICA DE

CRECIMIENTO Y LA CONCENTRACIÓN DE

SUSTRATO

En condiciones de sustrato abundante y ausencia de inhibición, la concentración de sustrato no afecta el valor de µ. Pero cuando el sustrato se hace limitante, si hay un efecto.

ECUACIÓN DE MONOD

μmax: velocidad específica de crecimiento máxima, (t-1 )

KS: constante de semisaturación, (g de S/l)

OTRAS ECUACIONES

Donde “n” es una constante empírica que se obtiene por ajuste de datos experimentales

INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO

Es la disminución de la actividad de los microorganismos, retardo e impedimento de su desarrollo, y por lo tanto, de la fermentación.

La fermentación pone lenta e incluso se para, principalmente por:

- Agotamiento de algún elemento necesario (oxigeno, sustancias nitrogenadas,.....)

- Formación o presencia de sustancias inhibidoras (alcohol, CO2, ciertos sustratos…)

INHIBICIÓN Por sustrato:

Donde “KIS” es la constante de inhibición por sustrato

INHIBICIÓN

Por producto:

Donde “KIP” es la constante de inhibición por producto y P es la concentración de producto

DATOS DE UNA FERMENTACIÓN

ANÁLISIS DE CURVAS DE CRECIMIENTO: APLICACIONES

Fuente del microorganismo: Fango del lago Mono en California, un lago hipersalino con altas concentraciones de arsénico

Objetivo: obligar a un microorganismo a crecer usando arsénico en lugar de fosfato para sus biomoléculas.

Análisis Nano-SIMS de células de GFAJ-1 creciendo con arseniato (imágenes B, D y F) o con fosfato (imágenes C, E y G). SIMS son las siglas en ingles de Secondary ion mass spectrometry y lo que nos dice esta técnica es la composición elemental de las células. A mayor color, más cantidad del elemento (As o P) que se está midiendo.

El fósforo es un bioelemento esencial. Los seres vivos lo usan para hacer ATP que usan como moneda energética en el metabolismo. Pero también se usa para hacer unas cuantas biomoléculas, principalmente los ácidos nucleicos y los fosfolípidos. Parece que el arsénico puede sustituir al fósforo en los ácidos nucleicos. El parecido en la reactividad química es lo que explica la toxicidad del arsénico. Se incorpora en las rutas metabólicas del fósforo sustituyéndolo en la formación de enlaces ésteres. Pero a diferencia del fósforo, las biomoléculas que llevan arsénico en su composición son mucho menos estables.

Curvas de crecimiento de GFAJ-1 en diferentes condiciones de cultivo. En A se representa la densidad óptica y en B el número de células de los cultivos en presencia de fosfato (línea contínua y círculos negros), arsenato (línea discontinua y cuadrados

negros) y sin fosfato ni arsenato (línea continua y triángulos blancos).

CONCLUSIONES

Halomonadaceae crece con un tiempo de generación de 31 horas en presencia de arsénico y sin fosfato. Si se crece en un medio con fosfato (1,5 mM) y sin arsénico, el microorganismo crece entonces con un tiempo de generación de 19 horas y se obtienen 10 veces más células en fase estacionaria. Si no hay ni fosfato ni arsenato en el medio, el microorganismo no crece.

CONSUMO DE SUSTRATOS

Caso A Caso B

Caso C

¿Qué nombre recibe este tipo de crecimiento con dos sustratos?

Calcule los tiempos de generación para dada uno de los sustratos en cada uno de los casos.

Cómo afecta la concentración inicial de sustrato a: rendimiento sustrato-biomasa, tiempo de generación global, tiempo total de fermentación y concentración final de biomasa.

Si se desea hacer una fermentación con un solo sustrato, ¿Cuál elige?

FERMENTACIONES FED-BATCH

Glicerol puro Glicerol crudo

Comparación productividades PHB

Influencia del oxígeno en la producción de biomasa

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30

Bio

mas

a -A

zúca

r to

tal

-Bio

etan

ol (g

/L)

Tiempo (h)

Xpred Spred Ppred

X S P

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30Bio

mas

a -A

zúca

r to

tal

-Bio

etan

ol (g

/L)

Tiempo (h)

Xpred Spred Ppred

X S P

CONDICIÓN 1

T= 28°C[ ] = 16°brix

Tiempo = 24 h

CONDICIÓN 2

T= 38°C[ ] = 20°brix

Tiempo = 24 h