实实实实实实 PCR 实实实实实实实实 (Real time Quantitative PCR) 戚戚戚 2012 戚 12 戚 15 戚
Jan 03, 2016
实时荧光定量 PCR 技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR)
戚振华2012 年 12 月
15 日
Contents
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实时荧光定量 PCR 原理
实时荧光定量 PCR 的方法介绍
实时荧光定量 PCR 的应用
实时荧光定量 PCR 定义:
• 在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实现了实时监测整个 PCR 进程,对起始模板进行定量分析的方法。
与普通 PCR 的区别
普通 PCR 技术普通 PCR 技术 实时定量 PCR 技术实时定量 PCR 技术
在 PCR 结束后对终点产物进行定量分析。
实时检测 PCR 扩增,在扩增的指数期对起始模板进行定量。
相同模板进行 96 次扩增,终点处产物量不恒定; Ct 值则极具重现性。
Ct 值的定义: 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。
Ct 值
定量 PCR 的数学原理
•理想的 PCR 反应: X=X0*2n
•非理想的 PCR 反应: X=X0(1+Ex)n
n :扩增反应的循环次数X :第 n 次循环后的产物量X0 :初始模板量Ex :扩增效率
在扩增产物达到阈值线时 : XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1)XCt: 荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。 在阈值线设定以后 , 它是一个常数 , 我们设为 M
方程式 (1) 两边同时取对数得 : log M=log X0(1+Ex)Ct (2)
整理方程式 (2) 得 : log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M (3)
最后结论: Log X0 与 Ct 呈线性关系,根据样品扩增的 Ct 值就可计算出样品中所含的模板量。
Log 起始拷贝量与 Ct 呈线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,根据样品 Ct 值,就可以计算出样品中所含的模板量。
标准曲线
实时荧光定量 PCR 的方法介绍
DNA 产物的荧光标记
非特异性荧光标记:1 、 SYBR Green
特异性荧光标记:2 、 TaqMan3 、 Molecular Beacon
SYBR Green 法工作机理
1.SYBR Green 只有和双链 DNA 结合后才发荧光。2.变性时, DNA 双链分开,无荧光。3.在延伸结束阶段采集荧光信号。4.SYBR Green 也能和非特异的双链 DNA 结合发光,所以必须在反应结束时做熔解曲线分析。
SYBR Green 熔解曲线分析
融解曲线分析,单一峰,无非特异性荧光,定量准确
融解曲线分析,出现杂峰其他产物出现非特异性荧光,因此定量不准确
SYBR Green 法优缺点
优点优点 缺点缺点
1. 对 DNA 模板没有选择性 -- 适用于任何 DNA
2. 使用方便 -- 不必设计复杂探针
3. 非常灵敏4. 便宜
1. 容易与非特异性双链 DNA 结合,产生假阳性,但可以通过融解曲线的分析,优化反应条件
2. 对引物特异性要求较高
TaqMan 法
1. 5′ 端标记有报告基团 (Reporter, R) ,如 FAM 、 VIC 等2. 3′ 端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)3. 探针完整, R 所发射的荧光能量被 Q 基团吸收,无荧
光, R 与 Q 分开,发荧光4. Taq 酶有 5′→3′ 外切核酸酶活性,可水解探针
TaqMan 法工作原理
每扩增一条 DNA 分子,释放一个荧光信号
TaqMan 法 PCR 反应的建立
1.引物、探针的设计:探针 Tm 为 68-70℃ , <30 bp, 5’ 不能有 G , G 可能会淬灭荧光素,引物尽量靠近探针,扩增片段 <400 bp ,引物 Tm 为 59-60℃2.反应参数的确定:一般为: 95 ,3min ℃ 、 94 ℃ , 15S 、 60 ℃ , 60S ( Taq 酶 5′→3′ 外切酶活性在 60℃ 最高也可通过温度梯度优化退火温度)3.优化引物和探针浓度:引物浓度: 50-900nM 探针浓度: 50-250nM4.其他与常规 PCR 相同
TaqMan 法优缺点
优点优点 缺点缺点
1. 对目标序列的高特异性 -- 阴性结果确定
2. 引物设计相对简单
3. 重复性比较好
1.只适合一个特定的目标2.委托公司标记,价格较高
荧光定量 PCR 技术的应用1. 绝对定量 基因表达研究 转基因食品检测2. 相对定量 基因在不同样本中的表达差异 药物疗效考核3. 阴阳性分析 病原体( HBV , HCV 等)检测 禽流感检测4. 等位基因分型 SNP 分析 与疾病相关的等位基因点突变检测
拓展应用1. MicroRNA 分析2. 基因拷贝数分析3. 表观遗传学分析4. 蛋白质分析5. 肿瘤稀有突变检
测
两种定量的不同方法
1.绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数 标准曲线法
2.相对定量是确定经过不同处理的样本之间基因的表达 差异
2- Ct△ △
双标准曲线法
优点:给出的是目标基因的绝对数量,数据容易处理缺点:必须有标准品;标准品必须准确测定,难以制备和质控
绝对定量 相对定量优点:不需要知道模板的确切拷贝数。可以不做标准品;标准品容易制备;使用广泛缺点:数据处理比较麻烦,数据理解困难
相对定量—— ΔΔ Ct 法
相对定量——相对标准曲线法
当目的基因和内对照的扩增效率不一致时使用,只需知道稀释倍数 , 不需要知道准确拷贝数或浓度,需对每个基因作一条标准曲线
通过并列跑两条扩增曲线,查看指数增长期曲线是否平行来确定扩增效率是否相似 .
两种方法的区别
谢谢!