Transcript
Koncept vrste
Pri rastlinah in živalih je vrsta definirana kot populacija osebkov, ki se med
seboj lahko križajo in imajo plodno potomstvo.
Pri mikroorganizmih, ki so haploidni organizmi in se lahko razmnožujejo
nespolno, koncept fertilnega potomstva ni uporaben.
Moderni koncept vrste temelji na genetskih razlikah. Pripadniki iste vrste so
tisti osebki, ki imajo 16S ali 18S rRNA sekvenco > 97 % podobno.
Taksonomija : filogenija
Taksonomija je klasificiranje in poimenovanje objektov. V mikrobiologiji
je taksonomija tradicionalno vezana na fenotispko analizo (npr. oblika,
molekulska sestava).
Filogenija je uvrščanje bioloških vrst v sistematske enote, ki so
zasnovane na sorodstvenih odnosih med vrstami. Filogenija v
mikrobiologiji je vezana na genetsko analizo.
nastanek zemlje
kemijska evolucija
era dinozavrov
milijarda let
- 4
0
-3
- 2
- 1
bakterijearheje evkarionti
moderni evkarionti
višji organizmi
kambrijska eksplozija
10
20
oksigena fotosinteza
endosimbioza
kisik (%)
1ozonski plašč
Evolucijski kronometer
Uporabni kronometri:
• citokromi
• železo-žveplovi proteini
• ribosomalna RNA
• ATPaza
• RecA
Kaj zahtevamo od dobrega kronometra:
• univerzalno zastopan
• funkcionalno homologen pri različnih
organizmih
• možnost naleganja sekvenc (primerjava
homolognih in heterolognih sekvenc)
• spremembe kronometra morajo odražati
evolucijsko oddaljenost
Sestava bakterijskega ribosoma
50S
30S
16S rRNA
23S rRNA + 5S rRNA
23S rRNA ~ 2900 nukleotidov
5S rRNA ~ 120 nukleotidov
16S rRNA ~ 1500 nukleotidov
Bakterijski ribosom
proteini
rRNA
30S50S
16S rRNA
Določanje 16S rRNA sekvence
mikroorganizem
izolirana DNA
16S rRNA gen
PCRpomnoževanje
DNA
Sekvenciranje 16S rRNAPCR pomnožka
Nastanek filogenetskega drevesa
1
2
3
ACGUUCGACU1
CCGUUCGUCU
E12 = 0.2
Evolucijska razdalja
2
UCGAUGGCCU
E23 = 0.4
E31 = 0.43
Primer evolucijskega drevesa: arheje
Karakteristične rRNA sekvence
Karakteristične sekvence so krajše 16S rRNA sekvence značilne za
skupino organizmov (npr. arheje, bakterije in evkarionte) oziroma
posamezne vrste mikroorganizmov znotraj skupine
karakteristična pozicija na 16S rRNA arheje bakterije evkarionti sekvenca (%) (%) (%)
AAACUCAAA 910 3 100 0
AAACUUAAAG 910 100 0 100
CUCCUG 1390 > 95 0 0
UCACACCG 1400 0 > 99 100
CCACACCG 1400 100 0 0
Bakterije
• enocelične
•praktično vse imajo celično steno iz peptidoglikana
• maščobne kisline vezane z esterskimi vezmi na glicerol, nimajo sterolov
• imajo eno vrsto RNA polimeraze, ki je sestavljena iz 4 polipeptidov
• protein se vedno začne z formilmetioninom
• imajo en kromosom
• nimajo organelov
Arheje
• enocelične
• celične stene iz pseudopeptidoglikana
• maščobne kisline vezane z eterskimi vezmi na glicerol, nimajo sterolov
• ieno vrsto RNA polimeraze, sestavljena iz 8 do 10 polipeptidov
• protein se vedno začne z metioninom
• imajo en kromosom
• nimajo organelov
Evkarionti
• enocelične in večcelične
• v koliko imajo celično steno je iz hitina ali celuloze
• maščobne kisline vezane z esterskimi vezmi na glicerol, imajo sterole
• 3 različne RNA polimeraze, podobna arhejski RNA polimerazi
• protein se vedno začne z metioninom
• imajo več kromosomov
• imajo organele
Tradicionalna identifikacija I
- morfologija
- barvanje po Gramu
- prehranske zahteve (npr. fototrof, kemoorganotrof, kemolitotrof)
- kemijska sestava celične stene
- kemijska sestava membran
- prisotnost vključkov in rezervnih snovi
- kemijska sestava kapsule
- pigmenti
- izraba različnih vrst ogljikovih, dušikovih in žveplovih spojin
- fermentacijski produkti
Tradicionalna identifikacija II
- poraba plinov (npr. O2, CH4, N2, H2S, H2, CO2, CO)
- zahteve glede temperature
- zahteve glede vodne aktivnosti
- zahteve glede pH
- občutljivost na antibiotike
- patogenost
- simbiontska razmerja
- imunološke karakteristike
- habitat
Molekularna identifikacija
• sekvenciranje DNA
• GC deleži
• hibridizacije DNA
• DNA polimorfizem
• PCR verižna reakcija s polimerazo
• FAME (fatty acid methyl ester)
• imunološke metode za identifikacijo
• metabolna identifikacija
Molekularna identifikacija: izolacija DNA
celična suspenzija DNA v raztopini
celice liziramo
odstranimocelični debri
centrifugiramo
DNA je v etanolu
dodamo etanol in kloroform
dodamo fenol
odstranimo proteine
Molekularna identifikacija: sekvenciranje DNA
C G A C T C G A T T C
G C T G
3’
5’
5’
3’
DNA, ki jo sekvenciramo
radioaktivno označen začetnik
-AG-AGCTAAG
-A-AGCTA-AGCTAA
-AGCT -AGCddGTP ddATP ddTTP ddCTP
7654321
G A T C
avtomatsko sekvenciranje s fluorescenčno označenimi dideoksi nukleotidi
Molekularna identifikacija: DNA polimorfizem
DNA različnost (polimorfizem) lahko pokažemo na več načinov:
• s kromosomsko DNA hibridizacijo
• z restrikcijsko analizo
• SNP (single nucleotide polymorphism)
• PCR
Molekularna identifikacija - hibridizacija DNA
vrsta A vrsta B vrsta C
T T T C C G A AA G C A A T G C T C G T T A C G
A G T T T C A AT C
GT T A C G
tarčna DNA in neznana DNA sta delno homologni in zato delno hibridizirata.
T C G T T A C G
tarčna DNA in neznanaDNA sta nehomologni in ne hibridizirata.
tarčna DNA in označena neznana DNA sta homologni in zato dobro hibridizirata.
Molekularna identifikacija - FISH z ribosomsko tarčo
mikroskopija
Vezava označene probe naribosome tarčnega organizma
A T T C G A C
Molekularna identifikacija - restrikcijska analiza
vrsta A vrsta BDNADNA
Restrikcijsko analizo lahko naredimo za celoten genom (RFLP
makrorestrikcijska analiza) ali pa za izbrani gen (npr. ribotipizacija).
Predhodno lahko željeni del DNA namnožimo s PCR in tako dobimo
AFLP profil.
PCR - polymerase chain reaction
Kvantitativni real-time PCR
3’5’
5’3’
R Q
3’5’
5’3’
3’5’
5’3’
3’5’
5’3’
polimerizacija
RQ
ločevanje fluorescenčne probe
QRpolimerizacija končana
QRcepitev fluorescenčne probe
S cepitvijo fluorescenčne
probe se sprosti quenching
fluorofora, kar omogoča
povečan kvantni prinos
fluorescence.
Molekularna identifikacija - FAME (Fatty Acid Methyl Esters)
V celicah je veliko različnih lipidov (> 100), ki so zastopani v različnih deležih
Za analizo lipide izoliramo, modificiramo do metilnih estrov, analiziramo s
plinsko kromatografijo. Kromatogrami lipidnih profilov dajejo značilne
vzorece, ki jih med seboj primerjamo.
Pri analizi uvrstimo lipide v več skupin:
- nasičene maščobne kisline
- nenasičene maščobne kisline
- ciklopropanske maščobne kisline
- razvejane maščobne kisline
- hidroksilne maščobne kisline
Imunološke metode za identifikacijo
Uporabljamo označeno protitelo, ki ga vežemo na mikrobni antigen. Specifično
vezavo protitelesa na antigen določimo z:
• imunofluorescenco
• radioimunskimi testi (RIA - radioimumunoassay)
• encimsko imunsko reakcijo (ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
• encimsko reakcijo kombinirano s fluorescenco (ELFA - Enzyme Linked
Fluorescence Assay)
• aglutinacijo
• imunomagnetnim ločevanjem (IMS - Immuno Magnetic Separation)
ELISA
Metabolna identifikacija
Uporaba metabolnega profila mikroorganizmov, ki temelji na uporabi
substratov, respiraciji ali fermentaciji:
• biolog
• kristal ID
• API
• mikro ID
Viri za taksonomijo in filogenijo bakterij
• Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology
Temelji na standardnih in molekularnih taksonomskih kriterijih in
zajema vse znane prokarionte, vsebuje veliko dihotomnih
klasifikacijskih ključev in drugih informacij, ki so koristne za
identifikacijo.
• The Prokaryotes
Temelji na filogeniji, vendar ima tudi klasično taksonomijo.
top related