Morpho Logie
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Physiologie bactérienne appliquée
à l’identification
Sophie Blevesbleves@imm.cnrs.fr
Microbiologie Biologie des µorganismes
!levures, moisissures, champignons
(mycètes)
!algues
!protozoaires (amibes, parasites)
eucaryotes inférieurs (protistes)
!bactéries
procaryotes 2 groupes taxonomiques
eubactériesarchées
c épithéliales (35!m) GR (8!m) Bactéries (1!m) Virus (10-100nm) 1 000 b sur 1 mm
Comment observer les bactéries?
- microscopie optique (G 1 000-1 500 fois)
- microscopie électronique (G >10 000 fois)
Microscopie optique
Etat frais
Contraste de phase
E. coli
Bleu de méthylène
Fixation + Coloration
Acinetobacter(cocci isolés ou en chaîne entourés d’une capsule)
bactéries d’un frottis de yaourt
Encre de chine!
bacillescoques sprirales
incurvées
bâtonnets fuseau
sphériques
Formes différentes selon les espèces Coloration de Gram
Peptidoglycane: réseau delongues chaînes polysaccharidespontées par peptides
épaisse couche de PG fine couche relâchée de PG (7 à 8 nm) dans lepériplasme + membrane externe
épaisse couche de PG fine couche dans le périplasme relâchée+ membrane externe
Coloration de Gram
Peptidoglycane
Membrane plasmique(bicouche symétrique dephospholipides)
Périplasme
ou Mb interne
Mb externe(bicouche asymétriquephospholipides et LPS)
Gram +Gram -
Coloration spores(vert de malachite, contre
coloration fushine)Bacillus thuringiensis
Autres colorations
Coloration flagellaire(Leifson, fuschine basique)
Vibrio
Microscopie électronique à balayage E. coli x30 000
Microscopie électronique à transmissionE. coli
Microscopie électronique
Identification de bactéries
Echantillon -------------------------> Identification ?
Identification de bactéries
Echantillon- biologique (sang, urines...)- eaux- aliments- environnement- …
EnrichissementIsolement
Identification(culture pure)
Il existe de nombreuses espèces bactériennes, qu’on peut classer d’aprèsquelques critères fondamentaux :
- morphologie des colonies- forme & taille des cellules- coloration GRAM- quelques caractères biochimiques simples d’orientation- mode respiratoire- mobilité
Croissance et maintien des µorganismes en laboratoire- aliments essentiels (acides aminés, peptides, bases nucléiques, sucres…),- éléments minéraux : fer, phosphore, soufre, magnésium,....-facteurs de croissance (sang, protéines, vitamines)
Système tampon pour éviter les variations importantes du pH
Milieu liquide ou semi-solide ou solide (agar)
Les milieux de culture
1-milieux complexes (ou riches) : composition chimique inconnue (croissance dela plupart des µorganismes)peptones (hydrolysats de protéines à partir digestion viande, caséine, soja,gélatine....) = source C et énergie
ex LB (Luria Broth), bouillon au soja
2-milieux synthétiques (ou minimums)composés chimiques purs (phosphate, azote, soufre....) en solution dans l’eauex milieu M9
Plusieurs espèces dans l’échantillon1- Isoler la bactérie d’intérêt2-Enrichir
Une espèce dans l’échantillon1- Enrichir
--> Morphologie des colonies
Morphologie des colonies
Couleur
Aspect (sec, gras, transparent…)
Les types de milieux de culture
Milieux solides pour l’isolement liquides pour culture de bactéries pures ou lors d’infection monoµbienne
!: bactéries incultivables (Mycobacterium leprae: intracellulaire obligatoire)
1- milieux sélectifs empêchent la croissance de certaines bactéries et favorisentla croissance de celles d’intérêt = SELECTION
E. coli et Proteus mirabilis(Drigalski)
S. aureus (Chapman)
ex AntibiotiqueDrigalski (cristal violet) : croissance G-SS (sels biliaires) : croissance Salmonella, ShigellaChapman (75% NaCl) : croissance Staphylococcus
Antibiogramme (inhibition croissance)
La température peut être sélective
Serratia marcescensE. coliBacillus stearothermophilus
Pshycrophiles
Mésophiles
Thermophiles
Extrêmophiles
4°C37°C 60°C
2- milieux différentiels: distinction de différents groupes de bactéries(caractéristiques biologiques) = IDENTIFICATION
Mee propriétés biochimiques d'une bactérie pour commencer à l'identifier: étudedu métabolisme respiratoire, des glucides, des protéines, des lipides....
Les types de milieux de culture
Lac+ (colonies rouges)
Lac- (colonies incolores)
Utilisation du LactoseMacConkey utilisation --> "pH(indicateur coloré, rouge neutre)
Caractère fermentaire (2 &3) ou oxydatif (1) Dégradation Glu -->déchets acides (indicateur de pH, rouge de phénol) Production soit de CO2 soit de CO2 et H2 (insoluble)
Fermentation - +- + + +Production H2 - - - + +
test catalase (addition H2O2 )+: dégagement H2
milieu jaune d’oeuf!: hydrolyse des lipides
Bacillus +
E. coli -
Alcaligenes -
test uréase!:Production NH3 --> "pH (indicateurcoloré, rouge de phénol)
E. coli - Proteus vulgaris +
gélose au sang!: bactéries hémolytiques ounon
E. coli - S. aureus +
mobilité (0,5% agar)
Effet de l’oxygène
Pseudomonas, Acinetobacter,Neisseria
Campylobacter, Mycobacteriaceae
Entérobactéries (Escherichia,
Salmonella), streptocoques,staphylocoques
Bactéries intestinales (Bacteroides,
Fusobacterium, Clostridium) et florecommensale
Exemples
Accepteur final d’électrons lorsrespiration aérobie (réduit en eau)
Nécessaire à < 0,2 atm (PP < celle air)
Pas nécessaire, mais utilisé (switch)(oxydation des substrats et fermentation)
Pas nécessaire, non utilisé (fermentation)
Toxique (fermentation, respirationanaérobie, photosynthèse)
Culture sous atmosphère réductrice
-
-
+
+
+
+
+-
+
+
-
Aérobie strict(1)
Microaérophile(3)
Aéro-anaérobiefacultatif (2)
Anaérobieaérotolérant
Anaérobiestrict (4)
Effet de l’O2+ O2+ O2
231 4
- milieux de culture dont la composition permet de mee une activité enzymatique: ß-galactosidase (ONPG), lysine décarboxylase (LDC), ornithine décarboxylase (ODC), uréase(URE)
- activité fermentaire est révélée avec un milieu type contenant un sucre, unindicateur coloré des changements de pH (fermentation sucre " pH)
Tests d’identification en microméthodeGalerie API20-E (Biomérieux)
plus sensiblesmesures photométriques en continu --> identification des principales bactéries isolées en pratique médicale en moins de 5 h
Systèmes automatisés
caractères morphologiques
caractères physiologiques et métaboliques
caractéristiques moléculaires :- composition en bases des AN (GC%)- amplification-séquençage gène codant ARN16S(phylogénie moléculaire : appareils de traduction sonttrès conservés, non échangés par transfertshorizontaux)- comparaison de protéines (séquençage, Ac)
Identification de bactéries
Echantillon- biologique (sang, urines...)- eaux- aliments--environnement…
EnrichissementIsolement
Identificationsur culture pure
Gram +
12 groupes de bactéries
G-
G+
Gram-Proteobacteria
HelicobacterAgrobacteriumEnterobacteriaPseudomonads
DesulfovibrioThiobacillus
Catalase (+ ou -)
Oxydase (+ ou -)
Coagulase (+ ou -)
Indole (+ ou -)
Utilisation des sucres (fermentation on non)
Activité enzymatique ou non (uréase, gélatinase, nitrate réductase…)
Production d’H2S …..
Tous ces caractères permettent d’obtenir une identification de plus en plusprécise, et finalement exacte de la bactérie
Caractères biochimiques simples
Gram +
Coques Gram +
Staphylococcus aureus(supuration, septicémie)
En amas : Staphylocoques (grappe de raisins)
Streptococcus pyogenes(angine, scarlatine)
En chaînettes: Streptocoques, entérocoques
Streptococcus pneumoniae(otite, pneumonie, méningite)
En diplocoques: Pneumocoques
Commensaux (peau, muqueuses, tube digestif)
Clostridium difficile (diarrée post antibiotique)
Bacilles Gram +
Listeria monocytogenes(méningite, avortement)
Bacillus anthracis(maladie du charbon,herbivores transmissible àl’homme)
Gram -
Coques Gram -
Neisseria meningitidis (méningocoque: méningite, septicémie)
Neisseria gonorrhoe (gonocoque, MST)
Entérobactéries
Gram -
Bacilles Gram -
2 familles importantes en pathologie humaine :
Les entérobactéries (Enterobacteriacae) Les Pseudomonas (Pseudomonacae)
Pseudomonas aeruginosaBurkholderiaPathogènes opportunistes(infections nosocomiales etmucoviscidose)
E. coli - commensal (infection urinaire)
- ETEC, EHEC, EIEC (gastro, speticémie)
Salmonella (infection digestive simple à fièvre thyphoïde)
Shigella dysenteriae (infection digestive mineure à grave-
Yersinia pestis
Vibrio cholerae (eau, épidémie Choléra)
Bordetella pertussis (coqueluche)
Mycobactéries Bacilles acido-alcoolo résistants ou «BAAR» Gram impossible --> coloration : Ziehl Nielsen
Mycobacterium tuberculosis (bacille de Koch)
Mycobacterium leprae
SpirochètesTreponema pallidum (syphilis)
Borrelia burgdorferi (maladie de Lyme, morsure tique)
Autres genres importants en pathologie humaine
Mycoplasma pneumoniae
Chlamydia pneumoniae Chlamydia trachomatis (MST)
Rickettsia conorii (fièvre boutonneuse-tiques-) Rickettsia typhi (typhus -puces et poux)
Bartonella henselae: maladie des griffes du chat
Germes intracellulaires : exemples
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