Transcript
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
1/23
1
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
ELICANDRO AMBARITA (G84130084)KARTIKA ANGGRAENI (G84120033)
ISOLASI, PURIFIKASI, DAN KARAKTERISASI ENZIMINERTASE RAGI Saccharomyces cerevisiae
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
2/23
PENDAHULUAN
Ragi merupakan sumber penting penyedia enzim. Enzim dihasilkan oleh sel-sel
yang hidup baik hewani maupun nabati. Bila enzim diberikan pada campuran organik tertentu, kegiatan campuran organik tersebut biasanya akan meningkat walaupun tidak
cenderung memisahkan. Enzim hanya aktif dalam larutan, peka terhadap panas, dan
peka terhadap pH. Enzim yang terdapat dalam ragi salah satunya enzim inertase. !ama
lain enzim inertase adalah beta-fruktofuronosidase Enzim ini adalah enzim intraseluler
yang dapat mengubah atau memecah sukrosa men"adi glukosa dan fruktosa #gula
inert$. %ula inert sebagian besar digunakan di industri makanan, minuman, dan
konersi. %ula inert dapat diproduksi dengan proses kimia menggunakan katalisis
asam atau proses biokimia menggunakan katalisis inertase. &ikroorganisme yang
mampu menghasilkan enzim inertase adalah Saccharomices cerevisiae yang terikat
pada dinding selnya #'olaina dan &c(abe )**+$.
nertase atau β -fruktofuranosida fruktohidrolase merupakan enzim yang
mengkatalis ikatan antara molekul α --glukosa dan β --ruktosa dari fruktosa
dengan cara menghidrolisisnya men"adi monosakarida-monosakarida glukosa dan
fruktosa. Enzim ini "uga menhidrolisis β
-fruktan seperti rafinosa men"aedi gula-gula
sederhana. nertase tumbuhan mengkatalis hidrolisis pemecahan ikatan pada sukrosa
yang merupakan bentuk transport utama dari karbohidrat pada tumbuhan tingkat tinggi.
/ukrosa ditranspor dari "aringan sumber #daun dewasa$ melalui floem ke "aringan sink
yang lain #akar, batang, organ reproduksi, dan organ penyimpanan egetatif$. Enzim ini
erperan dalam metabolisme karbohidrat tumbuhan karena dalam akuola sel tumbuhan
ter"adi reaksi pemecahan sukrosa dalam pembentukan fruktan. /ukrosa merupakan
produksi akhir asimilasi karbon #($ pada proses fotosintesis yang ter"adi di daun dan
bentuk karbohidrat yang mudah ditransportasikan ke "aringan simpan atau sink tissues
0rgan penting seperti buah atau umbi akan memiliki aktiitas inertase yang tinggi. Hal
ini ditun"ukkan pada buah anggur yang akan meningkat aktiitas inertasenya ketika
mendekati maturasi buah #Heldt dan Heldt )**$.
Enzim inertase banyak ditemukan pada ragi roti yang mengandung khamir
Saccharomyces ceriviseae. nertase diproduksi oleh bakteri, fungi, tumbuhan tingkat
tinggi, dan beberapa sel hewan #2ee Huang et al. )***$. 'emanfaatan enzim secara
komersial terus dipela"ari dan diterapkan yaitu pemanfaatan enzim untuk proses
enzimatik pada industri makanan, minuman, farmasi, dan biokimia. /alah satu contoh pemanfaatan tersebut adalah pematangan buah-buahan hi"au yang dipanen, pelayuan
daging, pengawetan ke"u, pencegahan kekeruhan bir, dan pembentukan tekstur gula.
/edangkan pemanfaatan enzim inertase banyak dilakukan dalam industri makanan dan
minuman khususnya pada pengolahan selai, permen, produk gula-gula, dan produksi
asam laktat dari fermentasi sirup tebu #3costa et al. )***$. 4u"uan dari praktikum ini
adalah mengisolasi dan melakukan purifikasi inertase dari ragi, menentukan aktiitas
dan kuantitas protein inertase, serta melakukan karakterisasi inertase berdasarkan
bobot molekulnya.
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
3/23
5
METODE
!"#$% &"' T*"$
'raktikum ini dilakukan di 2aboratorium Biokimia epartemen Biokimia
akultas &atematika dan lmu 'engetahuan 3lam nstitut 'ertanian Bogor. 6aktu
pelaksanaannya yaitu setiap hari 7amis, mulai 18 ebruari s9d )) &aret )*18 pukul
1*.** 6B - selesai.
B"+"'
Bahan yang digunakan pada praktikum kali ini antara lain ragi komersial dengan
merk dagang ermipan, pasir kuarsa, toluen, akuades, batu es, asam asetat 1 !,
amonium sulfat, ekstrak kasar, fraksi amonium sulfat *-)* :, )*-;* :, ;*-8* : dan
8*- running bufer pH
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
4/23
P''%+"' &'"' A.'% S%5"$
F-"#/'"/ E#/$-"# I'-$"/ R" %aram amonium sulfat digerus dengan
mortar. /ebanyak *.+5 g garam amonium sulfat ditambahkan kedalam m2 ekstrak
fraksi untuk ke"enuhan *-)*:. 7emudian didiamkan selama1* menit dan disentrifuse
pada kecepatan 1)** rpm selama 1 menit kemudian ditambahkan *.* & 4ris-H(l pH+. dan pelet hasil sentrifugasi dipisahkan. 'elet di"adikan sebagai fraksi a sedangkan
supernatannya di ditambahkan garam amonium sulfat sebagai fraksi b sesuai dengan
tabel tingkat ke"enuhan. 'embuatan fraksi dilakukan sampai tingkat ke"enuhan 8*-
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
5/23
*.1*, dan *.*C reagen ( ditambahkan ke dalam setiap tabung sebanyak m2. /etiap
tabung dihomogenkan dengan orte> lalu diinkubasi selama menit pada suhu ruang.
'enambahan reagen harus diatur dengan baik. 'ada lima menit terakhir ditambahkan *.
m2 reagen ke tabung 1 dan dan ke tabung selan"utnya dengan selang waktu 5* detik
untuk tiap tabung. /etiap tabung dihomogenkan kembali dengan orte> lalu diinkubasiselama 5* menit pada suhu ruang. 3bsorbansi setiap standar diukur pada D+** nm.
P'%#%-"' #"&"- *-.$' '9 '-$"/ raksi 1, ), dan 5 hasil
pengenceran disiapkan. Enzim inertase * kali. /ebanyak *.1* m2 fraksi ditambahkan
dengan ;.* m2 akuades lalu diorte>. /ebanyak 1 m2 larutan untuk setiap fraksi
digunakan dalam pengukuran kadar protein. 7emudian sebanyak tu"uh buah tabung
reaksi bersih dan kering disiapkan untuk pembuatan blanko dan penger"aan duplo dari
ketiga fraksi. Blanko disiapkan dari *.* m2 akuades. /ebanyak *.* m2 dari fraksi 1,
), dan 5 dimasukkan ke dalam tabung masing-masing kemudian ditambahkan *.; m2
akuades ke dalamnya. /elan"utnya setiap larutan dihomogenkan dengan orte>.
/ebanyak m2 reagen ( ditambahkan ke dalam setiap tabung. 4abung diinkubasi pada
suhu ruang selama menit. /elan"utnya *.* m2 reagen ditambahkan ke dalam setiaptabung lalu tabung dihomogenkan dengan orte> kembali. 4abung kembali diinkubasi
pada suhu ruang selama menit. 3bsorbansi setiap larutan diukur pada D+** nm.
K'$#" E'9 I'-$"/
P%"$"' B"'#. S*#$-.5.$.$- K'$#" I'-$"/ R" /ebanyak 1
m2 akuades diinkubasi selama 1* menit pada suhu ruang, kemudian ditambahkan
kupritartrat 1 m2. (ampuran ini dihomogenkan menggunakan vortex dan dididihkan
selama < menit. /etelah diangkat dari penangas air, ke dalamnya ditambahkan
fosfomolibdat 1 m2. 2alu, dihomogenkan kembali dan ditambahkan akuades sebanyak
+ m2. 2arutan dihomogenkan kembali kemudian didinginkan dan diukur absorbansinya
pada pan"ang gelombang 88* nm.
P%"$"' B"'#. A#$$"/ K'$#" I'-$"/ R" /ebanyak + buah tabung
reaksi disiapkan untuk blanko ini. 7emudian, substrat berupa sukrosa *. &
ditambahkan ke dalam masing-masing tabung dengan konsentrasi sebagai berikutF
tabung 1 sebanyak )* G2, tabung ) sebanyak ;* G2, tabung 5 sebanyak 8* G2, tabung ;
sebanyak
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
6/23
ditambahkan ke dalam ketu"uh tabung reaksi sebanyak 1** G2. (ampuran ini
dihomogenkan menggunakan vortex dan dididihkan selama < menit. /etelah diangkat
dari penangas air, ke dalamnya ditambahkan fosfomolibdat 1 m2. 2alu, dihomogenkan
kembali dan ditambahkan akuades sebanyak + m2 dan diukur absorbansinya pada 88*
nm.
P''$%"' B..$ M.#% P-.$' I'$"-/
P%"$"' G. Running gel dibuat dari beberapa bahan yaitu 3krilamida 1):
sebanyak running buffer +8* =l, 1* : // )** =l,
dd H)0 5.) =l. (ampuran dari running gel tersebut diaduk kemudian diberikan
3mmonium 'errosulfat 1** =l dan 4E&E 8 =l untuk mencegah pembentukan
gelembung udara. /tacking gel dibuat dari bahan yaitu %el sebanyak ;.55 ml #untuk
ketebalan gel sebesar *.+ mm$, larutan monomer *. ml , ;> running buffer 1.5* ml, 1*
: // 8** =l, dd H)0 ).1 =l, 3mmonium 'errosulfat 5* =l dan 4E&E 5 =l.
(ampuran dari running gel dituang kedalam plat kaca dengan pipet kaca hingga
mencapai "arak ; cm dari atas kaca. 7emudian diberikan penambahan n-butanol hingga permukaan atas gel yang belum membeku tertutup lalu dibiarkan membeku dalam
waktu 1. "am. 7etika running gel membeku, n-butanol dibuang, dibilas dengan
menggunakan running gel oerlay dan ditambahkan sebanyak 1 m2 running gel oerlay
dan dibiarkan hingga stacking gel siap digunakan. 7emudian dua buah sumur gel
disiapkan dan setiap sumurnnya diisi dengan standar B& protein campuran dan yang
kedua dengan B& protein inertase.
E#$-.5.-// SDS:PAGE (ampuran sampel protein #)*-1**Gg atau *-1**Gg$
dengan ) kali treatment buffer didalam tabung eppendorf, dididihkan didalam be"ana air
selama * detik. /ampel disimpan pada *( hingga siap digunakan. /ampel protein dan
standar dipipet sekitar G2 dan diletakkan ke dalam sumur gel secara hati-hati. /etelah
sampel seluruhnya diletakkan kedalam sumur gel, sistem elektroforesis dirakit dan
dihubungkan dengan power supply #*-1** olt$
P7"-'""' /$"'&"- 'enyimpanan gel dilakukan di dalam larutan fiksasi
pewarnaan cepat. %el *.+ A 1.* mm digoyang perlahan selama 1*-1 menit atau 5*-8*
min untuk gel 1. mm. 2arutan fiksasi diganti dengan larutan pewarnaan coomassie
blue. 'enggoyangan dilakukan ) "am hingga ); "am sampai pita protein terlihat. 2arutan
pewarnaan diganti dengan larutan destaining #F;F1, methanolFH)0Fasam asetat$
hingga background gel "ernih. 2arutan tersebut disimpan selama ); "am dalam asam
asetat +: atau ddH)0 kemudian dilakukan pengamatan dan penentuan B& berdasarkan
Rm dari B& 'rotein standar terhadap Rm inertase ragi.
HASIL
I/."/ &"' P"'"/"' E#/$-"#/ I'-$"/
4abel 1 olume fraksi ekstrak inertase ragi
Volume (mL)Fraksi I 9.9 7.0Fraksi II 7.0 5.0
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
7/23
+
P''%+"' &'"' A.'% S%5"$
4abel ) ata hasil fraksinasi amonium sulfat
Meja Fraksi Ulangan Volume(mL)Bobot ammonium
sulfat (g) 0!"0 #
5.0 0.575"" 5.0 0.575"
"0!"0 #
5.0 0.5700" 5.0 0.5700
"0!$0 # 5.0 0.%"00" $.5 0.5500
&0!$0 #
5.0 .""00" 5.0 .""00
$0!%0 # 5.5 0.7&00" 5.5 0.7&00
$ 0!%0 #
5.0 .9500
" 5.0 .9500
%0!'0 # 5.0 0.7"00" 5.0 0.7"00
(ontoh perhitungan penentuan bobot ammonium sulfat fraksi * A )*: FBobot amonium sulfat di tabel
Volume standar di tabel× Volume fraksi sebelum sentrifugasi =
114 gram
1000 mL × 5 mL = 0.5752 gram
U A#$$"/ I'-$"/ &'"' M$.& F.' !%
4abel 5 3ktiitas inertasemetode ollin 6u D88* nm
amel*teruk
ur
*terkore
ksi
*terkore
ksiblanko
+glukosa, (mM)
Unitakti-itas(unitmL)
Blanko sektro 0 0 0 0 0
blanko /rue 0."'0 0."'0 0."' 0.0$'0 !
1rue 0.&5 0.&5 0.07 0.0% !0.0""7
1rue " 0.&&" 0.&&" 0.05" 0.00'& !0.0"$'
Blankoemanasan
0.&$ 0.&$ 0.&$ 0.05'% !
Fraksi emanasan
0.&$& 0.&$& 0.00" !0.000$ 0.0&%9
Fraksi emanasan"
0.&'9 0.&'9 0.0$' 0.007% 0.0&9
Blanko 0!"0# 0.0$5 0.0$5 0.0$5 0.007 !
Fraksi 0!"0#. 0."7" 0."7" 0.""7 0.0&'' 0.09'
Fraksi 0!"0#." 0.&& 0.&& 0."%' 0.0$59 0.0"$&
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
8/23
Blanko fraksi "0!$0#
0.50& 0.50& 0.50& 0.0'%' !
Fraksi "0!$0#. 0.59 0.59 0.0'' 0.0$5 !0.0$5"
Fraksi "0!$0# "." 0.597 0.597 0.09$ 0.05% !0.0$$5
Blanko fraksi $0!%0#
0.009 0.009 0.009 0.000' !
Fraksi $0!%0#. 0.005 0.005 !0.00$ !0.005 !0.00$
Fraksi $0!%0# "." 0.0" 0.0" 0.00& !0.000& !0.0007
Blanko fraksi %0!'0#
0.09 0.09 0.09 0.00"5 !
Fraksi %0!'0#. 0.0"7 0.0"7 0.00' 0.000% 0.00"
Fraksi %0!'0# "." 0.0&9 0.0&9 0.0" 0.00"7 0.000
(oper #raksi *-)*.1$F A blankoterkoreksi= Aterukur− A blanko spektro
A blankoterkoreksi=0.280−0=0.280
F terkoreksi blanko= Aterukur fraksi− Ablankospek − Ablankoterkoreksi
Fraksiterkoreksi blanko=0.351−0−0.280=0.071
y=5.741 x+0.0045 > Iraksi )*-;*:J
0.088=5.741 x+0.0045 y #raksi )*-;*:.1$ *.* *.*1; m&
Knit aktiitasCsampel−Cblankoaktivitas
2 x t (menit ) >Vt
Ve x FP
Knit aktiitas0.0145−0.08!8
2 x 10 menit >1mL
0.8 mL x 10
Knit aktiitas -*.*;) unit9m2
P''$%"' K"&"- P-.$' &'"' M$.& L.7-
4abel ; /ampel enzim inertase metode 2owry pada" =700 nm
/ampel 3 terukur 3 terkoreksi7adar protein
#mg9m2$
Blanko *.*5;
fraksi 1.1 *.1*5 *.*8 *.*
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
9/23
fraksi ).) *.*++ *.*;5 *.*)*
blanko *-)*: *.*1
*-)*: 1 *.*< *.**+ *.***8
*-)*: ) *.* *.**; -*.**5+
blanko )*-;*: *.***)
)*-;*: 1 -*.*; -*.*;) -*.*
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
10/23
Blanko akti-itas'0
0.0"9 ! ! ! ! !
ubstrat '0 0."&" 0."0& 0.0$ "5.00 0.7%' 5.%570Blanko akti-itas
00
0.0"" ! ! ! ! !
ubstrat 00 0."57 0."&5 0.05 "0.00 0."0$% $.''%7Blanko akti-itas"00
0.07 ! ! ! ! !
ubstrat "00 0.'& 0.07% 0.0 0.00 0.0%%" 5.0&Blanko akti-itas$00
0.050 ! ! ! ! !
ubstrat $00 0.'7" 0.'"" 0."0 5.00 0.75' .&97(ontoh perhitunganF
L1 > !1 L) > !) 7onsentrasi /ampel 7onsentrasi Blanko
)* > *.1*** > !) y .+;1> M *.**; y .+;1> M *.**;
I/J !) 1** & *.*8 .+;1> M *.**; *.*11 .+;1> M *.**;
N *.*1* & N *.**11 &
V =Csampel−Cblanko
2 x T +
Ve
Vt + Fp
y ;.
V =0.0105−0.0011
2 x 10 +
0.8 mL
1 mL +10
19 #7m9Lma>$ > #19I/J$ M 19Lma>
L *.*;+* &9menit 19Lma> ;. *.)*;
y ;.
19 #7m9Lma>$ > #19I/J$ M 19Lma>
7m9Lma> *.)*17m *.)*1 > *.)*; *.*;15
%ambar 1 7ura &ichaelis-&enten aktiitas enzim inertase
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
11/23
11
f(3) 4 &.093 ! &.5
6 4 0.55
%ambar ) 7ura 2ineweaer-Burk aktiitas enzim inertase
P''$%"' B..$ M.#% P-.$' I'$"-/
Hasil penelitian /iakumar et al. )*1) menun"ukkan bahwa inertase mutan
memiliki < pita, sedangkan inertase wildtype memiliki pita.
%ambar 5 Hasil // '3%E inertase , &-&arker, 41-sampel 1, 4)-sampel ),
dari data sekunder #/iakumar et al. )*15$
4abel 8 Bobot molekul sampel 41 dengan metode //-'3%E
!omor Rf 41 #cm$ 2og bobot molekul #7a$ Bobot molekul #7a$
1 *.*1< 1.
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
12/23
R
,arakmigrasi %rotein '-m(
,arakminggrasi total (-m ) 0 .1
5 .7 *.*1< cm
y -*.*;> M 1.**8
2og B& 1.**8 - *.*; #*.*1 M 1.**8
2og B& 1.**8 A *.*; #*.*5$
1.
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
13/23
15
residu9pecahan dinding-dinding sel, maka hasil yang diperoleh berupa ekstrak kasar
enzim inertase yang berwarna cokelat pada lapisan toluena. /elan"utnya, pemisahan
enzim dilakukan dengan cara disentrifuge dengan kecepatan 1)*** rpm selama 1
menit. Hal ini berguna untuk memisahankan pecahan dinding dinding sel dari
supernatannya. 'rinsip dari metode sentrifuge ini, yaitu proses pemisahan ekstrak enzimyang didasarkan pada berat molekul dengan menggunakan gaya sentrifugal. /ehingga
nantinya berat molekul yang ringan akan berada diatas dan yang berat berada dibawah
#7oolman )***$.
P''%+"' &'"' A.'% S%5"$
Ekstrak toluena digunakan sebagai pelarut untuk mengekstrak enzim inertase.
raksi yang diperoleh dari ekstraksi toluena merupakan ekstrak kasar enzim.
'emisahan enzim dilakukan dengan cara disentrifus dengan kecepatan 1)***
rpm selama 1 menit #Bintang )*1*$. Hal ini berguna untuk memisahkan pecahan
dinding dinding sel dari supernatanya #7aufman 1
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
14/23
#Hasanah dan 'utra )*1*$, dan akhirnya diambil 1 m2 dari olume total fraksi untuk
analisis aktiitas dan kadar protein.
Hasil percobaan berdasarkan data 4abel ) menun"ukkan bahwa semakin besar
presentase pengendapan dari fraksi, maka semakin banyak pula "umlah amonium sulfat
yang harus ditambahkan untuk melarutkan protein yang terkandung dalam tiap fraksi#3costa et al. )***$. 3ktiitas tertinggi interase sebanding dengan banyaknya protein
interase. 3rtinya, aktiitas optimum inertase berada pada tingkat ke"enuhan 8*-M *,**; yang akan digunakan untuk mengukur konsentrasi glukosa. 'ersamaan garis
tersebut selan"utnya digunakan untuk menententukan konsentrasi gula inert yang
terbentuk. !ilai R ) *.8< setara dengan .8
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
15/23
1
E$ membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap cahaya #Bintang )*1*$. Reduksi
kupritartat dan reaksi dengan reagen olin-(iocalteu yang menghasilkan perubahan
warna biru dapat diukur dengan nilai absorbansinya pada pan"ang gelombang +* nm.
/tandar yang digunakan adalah B/3. 'embuatan kura standar pengukuran konsentrasi
protein dilakukan dengan menggunakan standar Bovine Serum Albumin #B/3$,akuades, dan reagen pada berbagai olume yang berbeda. 7andungan protein yang
diukur dalam praktikum ini adalah protein terlarut dan protein total. 'rotein terlarut
merupakan oligopeptida dan mudah diserap oleh sistem pencernaan. 'rotein total
merupakan pengukuran kandungan nitrogen #!$ dalam sampel. 0leh karena itu, terdapat
senyawa non-protein yang ikut terdeteksi dan terkalkulasi namun dalam kadar yang
relatif kecil dan dapat diabaikan #0lson dan &arckwell )**+$.
Reduksi kupritartat dan reaksi dengan reagen olin-(iocalteu yang
menghasilkan perubahan warna biru dapat diukur dengan nilai absorbansinya pada
pan"ang gelombang +* nm. /tandar yang digunakan adalah B/3. 'embuatan kura
standar pengukuran konsentrasi protein dilakukan dengan menggunakan standar Bovine
Serum Albumin #B/3$, akuades, dan reagen pada berbagai olume yang berbeda.7andungan protein yang diukur dalam praktikum ini adalah protein terlarut dan protein
total. 'rotein terlarut merupakan oligopeptida dan mudah diserap oleh sistem
pencernaan. 'rotein total merupakan pengukuran kandungan nitrogen #!$ dalam
sampel. 0leh karena itu, terdapat senyawa non-protein yang ikut terdeteksi dan
terkalkulasi namun dalam kadar yang relatif kecil dan dapat diabaikan #0lson dan
&arckwell )**+$.
%ambar merupakan kura standar untuk mengukur kadar protein inertase
berdasarkan hasil pengukuran absorbansi standar-standar protein. 7ura standar di atas
menghasilkan persamaan garis sebesar y -*.) M *.11) yang akan digunakan
untuk mengukur kadar protein inertase. 4abel ; merupakan hasil pengukuran kadar
protein inertase menggunakan metode 2owry. Hasil percobaan menun"ukkan bahwa
kadar protein inertase terbesar terdapat pada fraksi *-)*: ulangan 1 dan kadar protein
terkecil terdapat pada fraksi 8*- 1*8 #Bintang
)*1*$.
&enurut 'olaina dan &c(abe #)**+$, aktiitas enzim inertase sebanding dengan
kadar protein inertase oleh sebab itu menurutnya fraksi 5 merupakan fraksi yang
memiliki kadar protein tertinggi karena dalam fraksi ini ditambahkan ammonium sulfat.
ungsi dari ammonium sulfat ini adalah mengendapkan protein lain selain protein
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
16/23
enzim inertase. Oield enzim merupakan perbandingan antara total unit dalam fraksi
yang dimurnikan dengan total unit dalam ekstrak kasar, sedangkan fold enzim
merupakan perbandingan antara aktiitas spesifik dari fraksi yang dimurnikan dengan
aktiitas spesifik ekstrak kasar.
!ilai kinetika enzim inertase berupa nilai 7m dan Lmaks diperoleh dari kura plot hubungan konsentrasi dengan unit aktiitas sampel. %ambar ) #7ura &ichealis-
&enten$ dan 5 #7ura 2ineweaer-Burk$ menun"ukan la"u inetrase yang dipengaruhi
oleh konsentrasi substrat dengan persamaan garis y *.)*1> M ;. sehingga
nilai 7m didapatkan sebesar *.*;15 mg9m2. nterpretasi dari nilai tersebut menun"ukan
bahwa untuk mencapai setengah nilai Lmaks maka nilai 7m yang dibutuhkan sebesar
*.*;15 mg9m2. /emakin besar nilai 7m maka la"u atau aktiitas enzim inertase tidak
baik karena semakin banyak substrat yang dibutuhkan untuk bereaksi #Bintang )*1*$.
P''$%"' B..$ M.#% P-.$' I'$"-/
'ercobaan terakhir adalah karakterisasi enzim inertase dengan elektroforesis
// '3%E. 4eknik ini merupakan teknik analisis protein dengan menggunakan sifat
migrasi protein dengan dialiri medan listrik dan menggunakan gel poliakrilamid.
'enentuan agar ini karena sifatnya yang memungkinkan mempunyai pori yang berbeda
untuk stacking tempat pemisahan protein #konsentrasi tinggi dengan pH
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
17/23
1+
/tacking gel mempunyai fungsi untuk mengumpulkan sampel yang akan
dipisahkan sehingga memungkinkan cuplikan untuk bergerak bersama-sama dan
membentuk suatu pita cuplikan yang pekat. Resoling gel mempunyai fungsi untuk
ter"adinya pemisahan yang lebih baik sehingga memungkinkan ter"adi perbedaan gerak
yang "elas terlihat antara spesies dengan molekul besar dan spesies dengan molekulyang lebih kecil. ungsi buffer elektroforesis untuk mempertahankan pH di dalam
reseroir dan gel serta sebagai elektrolit pembawa aliran listrik. 0leh karena itu
pemilihan buffer harus memenuhi kriteria antara lainF pemilihan buffer didasarkan pada
tidak adanya interkasi yang ter"adi antara buffer dengan makromolekul yang dipisahkan,
pH yang digunakan tidak mengakibatkan denaturasi protein #kisaran yang digunakan
untuk protein biasanya ;.-.*, kekuatan ionik dan konsentrasi buffer harus
diperhitungkan dengan tepat #kekuatan ionik biasanya berkisar *.*-*.1$ #3costa et al.
)***$.
/istem buffer kontinyu adalah gel yang digunakan dalam satu slab terdiri dari dua
gel yaitu stacking gel dan separating gel . Buffer dan konsentrasi akrilamid yang
digunakan pada kedua gel tersebut berbeda. 'ada stacking gel digunakan buffer dengan pH 8.< dan konsentrasi akrilamid rendah. /edangkan pada separating gel digunakan
buffer dengan pH
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
18/23
penguasaan dan ketelitian dalam metode //-'3%E sehingga tidak ter"adi kesalahan
yang dapat mempengaruhi hasil percobaan.
DAFTAR PUSTAKA
3costa !, Beldarrain 3, 3lonso O. )***. (haracterization of recombinant inertase
e>pressed in methylotropic yeasts. Biotechnology and Applied Biochemistry 5)F
1+-1
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
19/23
1
/iakumar 4, Raikumar &, 'rakash &, /hanmugara"u L. )*15. 'roduction of
e>tracellular inertase from Saccharomyces cerevisiae strain isolated from grapes.
%JC(A(. 1#)$F+)-5
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
20/23
LAMPIRAN
2ampiran 1 3bsorbansi standar glukosa *.*; m& metode ollin 6u D88* nm
Volumelukosa (mL)
+lukosa, (mM)
*terukur
*terkoreksi
Blanko 0 0 00.0 0.00$ 0.0&& 0.0&&0.5 0.00% 0.0&$ 0.0&$
0."0 0.00' 0.057 0.0570."5 0.00 0.0%' 0.0%'0.&0 0.0" 0.0%5 0.0%50.&5 0.0$ 0.0'5 0.0'50.$0 0.0% 0.09% 0.09%
(ontoh perhitunganF#terkoreksi= #terukur$# blanko
#terkoreksi= 0.033$0=0.033
IglukosaJawalF *.*; &m
Lolume totalF 1 m2
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
21/23
)1
V1 × 1= V2 × 2
0.1 × 0.04 = 1 × 2
&) *.**; m&
%ambar ; kura standar IglukosaJ *.*; m& metode ollin 6u D88* nm
2ampiran ) 3bsorbansi standar B/3 metode 2owry #D+**nm$
IB/3J 3 teukur 3 tekoreksi
Blanko *,*;*
;* *,*8< *,*)<
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
22/23
%ambar 7ura standar pengukuran kadar protein inertase
2ampiran 5 Bobot molekul marker dengan metode //-'3%E
!omor Bobot molekul
#7a$
2og Bobot molekul
#7a$R marker #cm$
1 118.* ).*8;; *.*5
) +.; 1.R *.+
8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx
23/23
)5
%ambar + Hasil // '3%E inertase 2ab. 1
top related