La métagenomique alimentaire comme outil de maitrise de la qualité par Laurent Delhalle | Liege Creative, 17.05.13

Au cœur d’une spin-off

Laurent DELHALLE, Quality Partner

La métagenomique alimentaire comme outil de maitrise de la qualité

Avec le soutien de :

Le  poten(el  de  l’analyse  métagénomique    pour  l’industrie  alimentaire  

Liège Créative 17/05/13

Laboratoires d’essais issus du DDA –  physico-chimie –  Microbiologie –  caractérisation moléculaire –  caractéristiques technologiques et organoleptiques) –  unité expérimentale

2 sociétés « spin off » –  Quality Partner sa –  Food Safety Consult sa

2

Genèse  

Certification Consultance

Formation

PRIVATE SHAREHOLDERS

+ +

PUBLIC SHAREHOLDERS

MicroBiologie Lab

Pour une appoche pragmatique de la qualité et de la sécurité alimentaire

DNA Lab

Inspection

PRIVATE SHAREHOLDERS

+ +

PUBLIC SHAREHOLDERS

"   Metagenomics •  Food authenticity •  Detection

"   Identification "   Genotypes

Certification Consulting

Training

MicroBiology Lab

DNA Lab

Inspection

En bref:

ACCREDITATIONS AGREEMENT (AFSCA-FAVV)

HUMAN RESOURCES • 61 payroll + 20 freelances • Multilingue • Expertise et formation

POSITIONNEMENT STRATEGIQUE Flexibilité – Valeur ajoutée client – Expertise – rapidité – mesurabilité - IT

RANKING (Belgium 2011) • LAB : 1er en microbio alimentaire • INS : 1er en distribution • INS : Top 3 en filières

250 000 tests, 11000 audits, 6 000 000 € CA 16% de croissance annuelle

La  méta,  quoi  ?  

•  Defini(on    •  Comment  ça  marche  ?  •  Pourquoi  est-­‐ce  révolu(onnaire  ?  •  Applica(ons  et  étude  de  cas  •  Conclusions  et  perspec(ves  

Analyses  microbiologiques  •  Méthodes  de  détec+on  (P/A  dans  

x  g))  –  Seulement  les  bactéries  pathogènes  –  Toujours  un  enrichissement  nécessaire  

•  Méthode  de  comptage  (cfu/g)  –  Disponibes  pour  certaines  flores  

indicatrices  –  Disponible  pour  certaines  bactéries  

pathogènes  

8  

Detec(on  

24  H  3-­‐7  J  

Coun(ng  

La  métagénomique,  c’est  quoi  ?  

•  Une  rupture  technologique  •  Technique  culture-­‐indépendante  •  Technologie  de  séquençage  haute  débit  •  Ciblée  sur  l’iden(fica(on  des  bactéries  et/ou  des  levures/moisissures  

Blabla Blabla

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High throughput sequencing

Bioinformatics

Comment  ça  marche  ?  

Pourquoi  est-­‐ce  révolu(onnaire  ?  

L’analyse  métagénomique  alimentaire  fournit,  en  une  seule  analyse,  

l’iden(fica(on  de  plusieurs  milliers  de  microorganismes  

Food  Matrices  

Spoiling  flora  

Pathogens  

Technologic  flora  Shelf  life  

…  

Pourquoi  est-­‐ce  révolu(onnaire  ?  

5  à  10.000  sequences  /  sample  

Bacterial    diversity  profile  

Metagenomique  Microbiologie  classique  

   1      colony                            1  analysis                                            1  bacterial  iden+fica+on    20  colonies                      20  analysis                                      20  bacterial  iden+fica+ons  

                 But  are  they  the  ones  being  sought  ??  

1  analysis                                  >  5.000  iden+fica+ons  amongst  the  most  important  popula+ons  

Travail  Temps  Coût  

Isolement   Iden(fica(on   Caractérisa(on   …  

Approche  classique  

Approche  métagénomique  

iden(fica(on  

Iden(fica(on  

iden(fica(on  

iden(fica(on  

iden(fica(on  

iden(fica(on  

iden(fica(on  

iden(fica(on  

iden(fica(on  

iden(fica(on  

iden(fica(on  

iden(fica(on  

Analyse  

• NGS  (choix  des  plateformes  et  des  cibles)  • Quan(fica(on  absolue  (projet  METAQUANT)  

Bioinforma(que  

• Pipeline  d’analyse  • Bases  de  données  dédiées  propriétaires  

Interpréta(on  • Bases  de  données  «  experts  »  propriétaires  

Une  approche  d’avenir  

Dans  quel  cas  puis-­‐je  l’appliquer  ?  

•  Quel  microorganisme  cause  l’altéra(on  de  mon  produit  ?  

•  Quel  est  l’évolu(on  de  la  flore  durant  la  conserva(on  ?  

•  Comment  augmenter  la  durée  de  vie  de  mon  produit  ?  

•  Quel  est  l’impact  d’une  ma(ère  première,  d’un  changement  de  recebe?    

•  Le  processus  de  fabrica(on  est-­‐il  maitrisé  ?  

Cas  d’étude:  Salami  non  conforme  

•  Produit  de  viande  fermenté  •  Produit  non  conforme:  gonflement  •  Analyses  microbiologiques  conformes  •  Plusieurs  lots  de  produits  ont  été  perdus  •  Pour  le  producteur,  le  ferment  est  à  l’origine  de  la  contamina(on  

0%#

10%#

20%#

30%#

40%#

50%#

60%#

70%#

80%#

90%#

100%#

Ferment# Salami#conforme# Non#conform#Salami#

Weissella halotolerans

Staphylococcus xylosus

Staphylococcus carnosus

Lactobacillus versmoldensis

Lactobacillus sakei/graminis

Lactobacillus paraplantarum

Lactobacillus nodensis

Lactobacillus curvatus

Lactobacillus brevis

Ferment  Produit  conforme  

Produit  non  conforme  

Cas  d’étude:  Salami  non  conforme  

Dans  quel  cas  puis-­‐je  l’appliquer  ?  

•  Quel  microorganisme  cause  l’altéra(on  de  mon  produit  ?  

•  Quel  est  l’évolu(on  de  la  flore  durant  la  conserva(on  ?  

•  Comment  augmenter  la  durée  de  vie  de  mon  produit  ?  

•  Quel  est  l’impact  d’une  ma(ère  première,  d’un  changement  de  recebe  ?    

•  Le  processus  de  fabrica(on  est-­‐il  maitrisé?  

Etude  de  cas  :  haché  de  porc  

1/3  at  4°C  and  2/3  at  8°C  

3  jours  

6  jours  

1/3  at  4°C  and  2/3  at  8°C  

70%  O2    30%  CO2  

Echan(llon  J  0  

Echan(llon    FE  –  3  jours  

Echan(llon    MAP  –  6  jours  

Etude  de  cas  :  haché  de  porc  

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14/2-50.4

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8/00,2633"

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-/2363,9,"

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7/25933"

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D/63-39B,+1/23;-"0,:-59

/;-"

E9+:,003F/6

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G25+451423H"I,295B,+1/23;-" >,+15B,+3::;0" >/;+595015+" J4515B,+1/23;-" J0/;65-59,0" J0@+425B,+1/2"

<,@"!" ;96/2".:,0C+"K2,."L%"6,@0M" ;96/2"NOJ"L("6,@0M"

Bactéries  lac(ques   Pseudomonas  

Leucon

ostoc  

Brocho

trix  

6  log  

Dans  quel  cas  puis-­‐je  l’appliquer  ?  

•  Quel  microorganisme  cause  l’altéra(on  de  mon  produit  ?  

•  Quel  est  l’évolu(on  de  la  flore  durant  la  conserva(on  ?  

•  Comment  augmenter  la  durée  de  vie  de  mon  produit  ?  

•  Quel  est  l’impact  d’une  ma(ère  première,  d’un  changement  de  recebe  ?    

•  Le  processus  de  fabrica(on  est-­‐il  maitrisé  ?  

•  Augmenta(on  de  la  durée  de  vie  •  Iden(fica(on  de  la  flore  bactérienne  avec  et  sans  un  mélange  de  lactate/diacétate  

Cas  d’étude:  avec  ou  sans  lactate/diacétate  

0

25

50

75

100

waaslandse_kop_standard waaslandse_kop_zonder_additifssampleNames

Spe

cies

pro

port

ion

in %

Genus−SpeciesBacillus−thermoamylovoransBrochothrix−thermosphactaCarnobacterium−divergensCarnobacterium−gallinarumEnterococcus−cecorumLeuconostoc−lactisPseudomonas−antarcticaSerratia−grimesiiunclassified−unclassifiedOthers−Others

Bactéries  altérantes  Carnobacterium  

avec  lactate/diacetate  

sans  lactate/diacetate  

Cas  d’étude:  avec  ou  sans  lactate/diacétate  

Dans  quel  cas  puis-­‐je  l’appliquer  ?  

•  Quel  microorganisme  cause  l’altéra(on  de  mon  produit  ?  

•  Quel  est  l’évolu(on  de  la  flore  durant  la  conserva(on  ?  

•  Comment  augmenter  la  durée  de  vie  de  mon  produit  ?  

•  Quel  est  l’impact  d’une  ma(ère  première,  d’un  changement  de  recebe  ?    

•  Le  processus  de  fabrica(on  est-­‐il  maitrisé  ?  

•  Filet  américain  (steak  tartare)  •  Iden(fica(on  de  la  flore  bactérienne  chez  différents  producteurs  

•  2  boucheries  •  2  sandwicheries  •  2  restaurants  

Etude  de  cas  :  filet  américain  

0.000%$

10.000%$

20.000%$

30.000%$

40.000%$

50.000%$

60.000%$

70.000%$

80.000%$

90.000%$

100.000%$

Resto$_1$ Resto_2$ Sandwich_1$Sandwich_2$Boucherie_1$Boucherie_2$

Propor%ons(des(taxons((dans(le(steak(tartare(

Lactobacillus algidus Pseudomonas sp. Photobacterium phosphoreum Leuconostoc uncultured Brochothrix thermosphacta Lactococcus piscium Lactobacillus sakei Weissella sp. Acinetobacter sp. Xanthomonas campestris Psychrobacter sp. Acinetobacter uncultured Photobacterium uncultured Pseudomonas uncultured Lactobacillus paraplantarum Uncultured unclassified Acinetobacter baumannii Carnobacterium divergens Enterobacter cloacae Carnobacterium uncultured bacterium uncultured Aeromonas uncultured Psychrobacter uncultured

Steak  Tartare    

1,000.00

10,000.00

100,000.00

1,000,000.00

10,000,000.00

Res

to _

1

Res

to_2

San

dwic

h_1

San

dwic

h_2

Bou

cher

ie_1

Bou

cher

ie_2

Représentativité des populations suivant le taux de contamination observé sur PCA (CFU/g)

Lactobacillus_algidus

Pseudomonas_sp.

Photobacterium_phosphoreum

Brochothrix_thermosphacta

Leuconostoc_uncultured

Lactococcus_piscium

Weissella_sp.

Lactobacillus_sakei

Dans  quel  cas  puis-­‐je  l’appliquer  ?  

•  Quel  microorganisme  cause  l’altéra(on  de  mon  produit  ?  

•  Quel  est  l’évolu(on  de  la  flore  durant  la  conserva(on  ?  

•  Comment  augmenter  la  durée  de  vie  de  mon  produit  ?  

•  Quel  est  l’impact  d’une  ma(ère  première,  d’un  changement  de  recebe  ?    

•  Le  processus  de  fabrica(on  est-­‐il  maitrisé  ?  

Etude de cas : fromage

Connaissance  de  la  flore  du  fromage  

Comparaison  entre  le  cœur  et  la  croute  du  fromage  

Comparaison  entre  différents  processus  de  fabrica(on    (lait  cru/pasteurisé)  

Contrôle  qualité  

Contrôle  de  la  durée  de  vie  

Echantillons

From raw milk

Rind   Core  

From raw milk

From pasteurizedm

ilk

Other cheese made with raw milk

4 soft cheeses

Rind   Core   Rind   Core   Rind   Core  

8 échantillons Analyse de microbiologie classique et de métagénomique

1 2 3 4  

Resultats

Microbiologie  classique  

Results

1

2

3

4

Rind  

Core  

Rind  

Core  

Rind  

Core  

Rind  

Core  

RESULTATS  

Results 48  genres  and  163  

espèces  

Beaucoup d’espèces bactérienne différentes

Moins d’espèces, principalement

Lactococcus lactis (97,6%) au coeur

RESULTATS  

1 2 3Rind   Core   Rind   Core   Rind   Core   Rind   Core  

4

Results Core: Lactoccocus lactis and/or cremoris

Rind : -  Psychrobacter glacinola -  Staphylococcus equorum -  Corynebacterium casei -  Marinilactibacillus

psychrotolerans -  Brevibacterium spp -  Psychroflexus spp

1 2 3Rind   Core   Rind   Core   Rind   Core   Rind   Core  

4

RESULTATS  

Results Toutes ces espèces sont présentes en différentes quantité suivant l’origine et le procédé de fabrication du fromage

Deux  espèces  sont  présentes  en  majorité  dans  ces  matrices  donnant  des  indica(ons  sur  le  procédé  de  fabrica(on    Lactoccocus  cremoris  and  Leuconostoc  citreum  

1 2 3Rind   Core   Rind   Core   Rind   Core   Rind   Core  

4

RESULTATS  

Dans  quel  cas  puis-­‐je  l’appliquer  ?  

 •  Produits  lai(ers  •  Fromage  •  Vin  •  Bière  •  Eau  •  Etc.  

 •  Céréales  •  Thé  •  Ferments  •  Poissons  •  Plats  préparés  

Animal  

• Alimenta(on  animale  • Santé  animale  

Conserva(on  denrées  aa  

• Produc(on  transforma(on  denrées  • Echan(llons  environnementaux  

Homme  

• Santé  humaine  • Probio(ques  

Perspec(ves  et  collabora(ons  La  métagénomique,  une  vision  intégrée  de  l’agro-­‐alimentaire  et  de  la  santé  diges(ve  

Animal  Analyse  de  fourrages  et  ensilages  

Diversité du genre Lactobacillus Diversité des levures/moisissures

Collabora+on  avec  le  département  de  produc+on  animale  

Animal  

Influence  de  la  diète  sur  le  microbiote  diges(f  de  l’animal  

Populations différemment représentées dans le microbiote intestinal du porc selon le prébiotique utilisé

Collaboration avec la Faculté d’agronomie

Produits  agro-­‐alimentaires  

•  Suivi  vieillissement  des  aliments  (viande  de  bœuf)  

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100% Staphylococcus_vitulinus Staphylococcus_saprophyticus Staphylococcus_equorum Lactococcus_lactis Yersinia_ruckeri Pseudomonas_marincola Planomicrobium_psychrophilum Exiguobacterium_profundum Atopostipes_suicloacalis Jeotgalicoccus_psychrophilus Aeromonas_hydrophila Macrococcus_caseolyticus Leuconostoc_inhae Leuconostoc_carnosum Lactobacillus_graminis Leuconostoc_gelidum Lactobacillus_sakei Brochothrix_thermosphacta Carnobacterium_gallinarum Leuconostoc_gasicomitatum Carnobacterium_divergens Lactococcus_piscium Lactobacillus_algidus

Sous vide

-­‐1°C   +4°C  j15  J30   j45   j15  J30   j45  

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100% Staphylococcus_vitulinus Staphylococcus_saprophyticus Staphylococcus_equorum Lactococcus_lactis Yersinia_ruckeri Pseudomonas_marincola Planomicrobium_psychrophilum Exiguobacterium_profundum Atopostipes_suicloacalis Jeotgalicoccus_psychrophilus Aeromonas_hydrophila Macrococcus_caseolyticus Leuconostoc_inhae Leuconostoc_carnosum Lactobacillus_graminis Leuconostoc_gelidum Lactobacillus_sakei Brochothrix_thermosphacta Carnobacterium_gallinarum Leuconostoc_gasicomitatum Carnobacterium_divergens Lactococcus_piscium Lactobacillus_algidus

Sous atmosphère modifiée 30% C02/70% O2

-­‐1°C   +4°C  j15  J30   j45   j15  J30   j45  

Fonds propres du laboratoire

Produits  agro-­‐alimentaires  

• Biopréserva(on  des  aliments  réfrigérés  

Projet FLORPRO (Wagralim)

• Développement  de  produits  réfrigérés  à  qualité  microbiologique  maîtrisée  jusqu’à  la  DLC  

• Projet  collabora(f:  1  université,  1  centre  de  recherche  et  5  entreprises  

Homme  

Microbiote  intes(nal  favorable  chez  le  senior  

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

50,00%

60,00%

70,00%

80,00%

90,00%

100,00%

15305/2

/CC

1/e

xULg

15305/3

/CC

2/e

xULg

15305/4

/CC

3/e

xULg

15305/5

/CC

1/D

NA

15305/6

/CC

2/D

NA

15305/7

/CC

3/D

NA

Prevotella Oribacterium Microbacterium Flavonifractor Enterococcus 4C0d-2 Pseudobutyrivibrio Lachnospiraceae Acetitomaculum Barnesiella Anaerostipes Butyrivibrio Anaerofustis Roseomonas Faecalibacterium Christensenella Blautia Marvinbryantia Bifidobacterium Subdoligranulum Akkermansia CandidatedivisionTM7 Coriobacteriaceae Clostridium Streptococcus Parasutterella Thalassospira RF9 Lactococcus Mucispirillum Parabacteroides Anaeroplasma

Projet NUTRIGUTIOR (Wagralim)

•  Développement de produits santé pour l’alimenta(on du senior

•  Projet collaboratif: 2 universités et 6 entreprises

Ø Etablir la carte du microbiote intestinal chez différentes catégories de seniors

Ø Identifier des bio-marqueurs santé dans les populations microbiennes

Homme  Contrôle  qualité  des  probio(ques  

European  Scien+fic  League  for  Probio+cs  

•  Label  de  qualité  sur  les  produits  probio(ques  

Ø Valider  la  composi(on  Ø Valider  les  concentra(on  Ø Valider  la  viabilité  

Résultats

0%  

10%  

20%  

30%  

40%  

50%  

60%  

70%  

80%  

90%  

100%  

Produit  1   Produit  1  PMA   Produit  2   Produit  2  PMA   Produit  3   Produit  3  PMA  

Streptococcus  thermophilus  

Streptococcus  salivarius  

Lactobacillus  zeae  

Lactobacillus  gallinarum  

Lactobacillus  casei  

Lactobacillus  brevis  

Lactobacillus  acidophilus  

unclassified  unclassified  

3  probio(ques  différents    Dis(nc(on  entre  bactéries  vivantes  et  mortes    

Conclusions

•  Technologie  de  rupture  dans  l’iden(fica(on  et  la    quan(fica(on  

•  Applica(ons  nombreuses  et  variées  –  Iden(fica(on  des  microorganismes  d’altéra(on  –  Améliora(on  des  recebes  –  Iden(fica(on  de  la  flore  durant  la  durée  de  vie  d’un  produit  –  Augmenta(on  de  la  durée  de  vie  

La  métagénomique:  votre  nouvel  ou(l  de  développement  et  de  contrôle  

Etes  vous  prêt  pour  cebe  rupture  technologique  ?  

Damien le Grand Directeur Tél. : +32 (0)4 264 63 44 Fax : +32 (0)4 264 07 34 www.foodsafetyconsult.com

Laurent Delhalle Tél. + 32 (0)4 240 75 00 Fax + 32 (0)4 240 75 10 www.quality-partner.be laurent.delhalle@quality-partner.be

Merci de votre attention