Transcript
Ak.god. 2011/2012.
Klinička enzimologijakorištenje podataka o aktivnostima enzima
u dijagnostičke svrhe
1.Uroñene greške metabolizma – nasljedne, genetski uvjetovane bolesti (enzimopatije)
2. Stečeni deficit enzima – obično zbog promjene funkcije organa (▼sinteza)
3. Razna patološka stanja – oštećenje stanica i izlazak enzima u izvanstaničnu tekućinu (▲
aktivnost)
Enzimi u stanicama
a) konstitutivni (sintetiziraju se stalnom brzinom – npr. kreatin kinaza,CK proporcionalna masi mišićnih stanica, pojava u serumu uglavnom posljedica nekroze )
b) Inducibilni (sinteza enzima mijenja se u ovisnosti o koncentraciji supstrata; najčešće enzimi koji pregrañuju tvari apsorbirane iz probavnog trakta; npr. glukokinaza)
Enzimi Enzimi u u
serumu/plazmiserumu/plazmi
MiMiššiiććnanaaktivnostaktivnost
Tkivna
Tkivna
sekrec
ij
sekrec
ijaa
Krvne
Krvne stanice
stanice
Obnova
Obnova stanicastanica
Endotel
Endotel
žžilaila
Uzroci oštećenja ili smrti stanice
• Hipoksija (gubitak krvi, anemije,...)
• Kemikalije (živa, olovo, .....)• Fizikalna oštećenja (smrzotine, opekotine, radijacija...)• Mikrobiološki agensi (bakterije, gljivice, virusi...)• Imunološki mehanizmi (citotokičnost)• Nutritivni čimbenici (nedostatak proteina, vitamina,
minerala...)
SadrSadržžaj enzima u krvi u svakom aj enzima u krvi u svakom trenutku uzimanja uzorka krvi trenutku uzimanja uzorka krvi
rezultat je:rezultat je:
�� oslobañanja iz stanicaoslobañanja iz stanica
nanaččina ulaska u cirkulacijuina ulaska u cirkulaciju
nanaččina eliminacije iz cirkulacijeina eliminacije iz cirkulacije
StaniStaniččni enzimi dospijevajuni enzimi dospijevajuu plazmu kao posljedica u plazmu kao posljedica obnove stanicaobnove stanica
StaniStaniččni enzimi pojani enzimi pojaččanoanodospijevaju u plazmu kao dospijevaju u plazmu kao posljedica oposljedica oššteteććenja ilienja iliproliferacije stanicaproliferacije stanica
�� oslobañanje iz stanicaoslobañanje iz stanica
Plazma membrana (ALP, GGT)Plazma membrana (ALP, GGT)
CitoplazmaCitoplazma (ALT, AST, LD, CK)(ALT, AST, LD, CK)
Mitohondrij (GLD, AST, CK)Mitohondrij (GLD, AST, CK)
Lizosom (ACP, NAGLizosom (ACP, NAG))
Mikrosomi (GGT)Mikrosomi (GGT)
SadrSadržžaj enzima u krvi u svakom aj enzima u krvi u svakom trenutku uzimanja trenutku uzimanja uzorkauzorka rezultat je:rezultat je:
oslobañanja iz stanicaoslobañanja iz stanica
�� nanaččina ulaska u cirkulacijuina ulaska u cirkulaciju(Mr, stupanj sinteze,stupanj o(Mr, stupanj sinteze,stupanj oššteteććenja stanice)enja stanice)
nanaččina eliminacije iz cirkulacijeina eliminacije iz cirkulacije
Mr dijagnostički važnih enzima
• Lipaza 48 000• Amilaza 50 000• Kreatin kinaza,CK 80 000• Aspartat-aminotransferaza, AST 90 000• Alanin-aminotransferaza, ALT 180 000• Kisela fosfataza, ACP 100 000• Laktat-dehidrogenaza, LDH 140 000• Alkalna fosfataza, ALP 140 000• γ-glutamil transferaza, GGT 82 000, 300 000,
1 000 000»
SadrSadržžaj enzima u krvi u svakom aj enzima u krvi u svakom trenutku uzimanja uzorka rezultat je:trenutku uzimanja uzorka rezultat je:
oslobañanja iz stanicaoslobañanja iz stanica
nanaččina ulaska u cirkulacijuina ulaska u cirkulaciju
→→ nanaččina eliminacije iz cirkulacije;ina eliminacije iz cirkulacije;(RES, eliminacija bubrezima(RES, eliminacija bubrezima--manje znamanje značčajna)ajna)
Poluživot enzima u plazmi
LD1 53 – 173 sataLD5 8 – 12 sata
CK 15 sati
AST 12 – 22 sata
ALT 37 – 57 sata
ALP 3 –7 dana
GGT 3 –7 dana
Enzimi kao tkivni biljezi
• Osjetljivost: proizlazi iz odnosa aktivnosti enzima u plazmi i pojedinim stanicama, odnosno tkivima
• Specifičnost: organ-specifični enzimi (i izoenzimi) /organ nespecifični enzimi
�� enzimi kao tkivni biljezienzimi kao tkivni biljezi
ASTASTALTALTLDLDCKCK
SerumSerum EritrocitiEritrociti JetraJetra SrceSrce MiMiššiićć
Tkivna osjetljivostTkivna osjetljivost Tkivna specifiTkivna specifiččnostnost
Enzimski profilEnzimski profil
Enzimi u plazmiEnzimi u plazmi
Enzimi iz jetreEnzimi iz jetreUloga u cirkulacijiUloga u cirkulaciji
Plazma specifiPlazma specifiččni enzimini enzimi Plazma nespecifiPlazma nespecifiččni enzimini enzimi
Serin proteaze:Serin proteaze:trombin, faktor XIItrombin, faktor XIIFibrinolitiFibrinolitiččki enzimiki enzimiLipoprotein lipazaLipoprotein lipaza
Enzimi sekrecijeEnzimi sekrecijeLipazaLipaza
AmilazaAmilaza
ProstatiProstatiččna kisela fosfatazana kisela fosfataza
StaniStaniččni enzimini enzimiLD, AST, ALTLD, AST, ALT
Plazma specifični enzimi
• Djeluju u plazmi• Sintetiziraju se u jetri• U plazmi su prisutni u većim koncentracijama nego u tkivu
• Klinički značajna: aktivnost• Promjene – pokazatelj funkcije jetre
Plazma nespecifični enzimi(aktivnosti manje u plazmi nego u tkivima)
a) enzimi sekrecije – egzokrine žljezde (pankreas, prostata, mukoza želudca);
klinički značajno: , zbog pojačane sinteze ili otežane eliminacije)
Klinički značajno: (stanice oštećene ili nekrotične)
b) Enzimi intermedijarnog metabolizma – koncentracije u tkivima vrlo visoke; oštećenje ili nekroza stanica omogućuje “bijeg”enzima u plazmu (CK, LD, AST, ALT....)
�� Referentni intervali za enzimeReferentni intervali za enzime
�� vrijeme uzimanja uzorka krvi vrijeme uzimanja uzorka krvi
�� dobdob
�� spolspol
�� rasarasa
�� fizifiziččka aktivnost, trudnoka aktivnost, trudnoćća, ciklia, cikliččke ke varijacije, lijekovi..varijacije, lijekovi..
Izražavanje aktivnosti: U/L; katal (?)
pH, vrste i ionske jakosti puferapH, vrste i ionske jakosti pufera
temperaturetemperature
koncentracije supstratakoncentracije supstrata
koncentracije aktivatorakoncentracije aktivatora
koncentracije inhibitorakoncentracije inhibitora
Metode Metode kontinuiranog kontinuiranog
mjerenjamjerenja
Metode Metode diskontinuiranog diskontinuiranog
mjerenjamjerenja
��Metode za odreñivanje katalitiMetode za odreñivanje katalitiččke aktivnosti enzimake aktivnosti enzima
1 (enzimska) U (aktivnost enzima koja u jednoj minutikatalizira promjenu 1 µmola supstrata (na/ L seruma)
1 katal (aktivnost enzima koja u jednoj sekundikatalizira promjenu 1 mola supstrata (na/ L seruma)
1U=16,67nkatal
Metode Metode kontinuiranog kontinuiranog
mjerenjamjerenja
Metode Metode diskontinuiranog diskontinuiranog
mjerenjamjerenjaMetode Metode
jedne ili (dvije) tojedne ili (dvije) toččkeke
OptiOptiččki testki test
Metode s umjetnim supstratimaMetode s umjetnim supstratima
�� Metode za odreñivanje katalitiMetode za odreñivanje katalitiččke aktivnosti enzimake aktivnosti enzima
Metode Metode kontinuiranog kontinuiranog
mjerenjamjerenja
OptiOptiččki testki test
Metode s umjetnim supstratimaMetode s umjetnim supstratima
OptiOptiččki test 1. stupnjaki test 1. stupnja
OptiOptiččki test 2. stupnjaki test 2. stupnja
OptiOptiččki test 3. stupnjaki test 3. stupnja
�� Metode za odreñivanje katalitiMetode za odreñivanje katalitiččke aktivnosti enzimake aktivnosti enzima
• A) Primarna reakcija:• Laktat + NAD →(LD)→piruvat + NADH +H+
• B) Primarna i indikatorska reakcija:• Aspartat + alfa-ketoglutarat →(AST) →oksalacetat +
glutamatOksalacetat + NADH + H+ (MDH) malat+ NAD
C) Primarna, pomoćna i indikatorska reakcija:• Kreatin-P + ADP→ (CK)→ kreatin + ATP
ATP + glukoza→ (HK)→ glukoza-6-P + ADPGlukoza-6-P + NADP+→ (G6PD) →6-fosfoglukonat + NADPH + H+
Promjene katalitičke aktivnosti enzima u serumu
Pojačana sintezaPoremećaj propusnosti stanične membrane
Nekroza staniceSmetnje u izlučivanju
Smanjena sintezaPojačana eliminacija uz normalnu sintezu
LAKTAT DEHIDROGENAZA (LD)LAKTAT DEHIDROGENAZA (LD)EC 1.1.1.27.EC 1.1.1.27. LL--laktat: NADlaktat: NAD++ oksidoreduktazaoksidoreduktaza
CH3
HCOHCOOH
+ NAD+↔ LD ↔
CH3C = OCOOH
+ NADH+H+
• infarkt miokardainfarkt miokarda·· megaloblastimegaloblastiččka anemijaka anemija·· akutno oboljenje jetreakutno oboljenje jetre·· akutno oboljenje bubrega (mokraakutno oboljenje bubrega (mokraćća)a)·· infarkt pluinfarkt pluććaa·· razlirazliččiti tipovi oboljenja miiti tipovi oboljenja miššiiććaa·· maligna oboljenjamaligna oboljenja
HH44 HH33MM HH22MM22 HH11MM33 MM44
LDLD11 LDLD22 LDLD33 LDLD44 LDLD55
Enzim se sastoji od 4 polipeptidna lanca koji Enzim se sastoji od 4 polipeptidna lanca koji pripadaju tipu H (pripadaju tipu H (heartheart--srce) i M (srce) i M (musclemuscle--mimiššiićć))
5 izoenzima5 izoenzima--organ specifiorgan specifiččni izoenzimini izoenzimi
ASPARTAT AMINOTRANSFERAZA (AST)ASPARTAT AMINOTRANSFERAZA (AST)EC 2.6.1.1.EC 2.6.1.1. LL--aspartataspartat--22--oksoglutarat aminotransferazaoksoglutarat aminotransferaza
UuUunutar stanice nalazi se u citoplazmi (izoenzim C; AST I; 35%) i nutar stanice nalazi se u citoplazmi (izoenzim C; AST I; 35%) i mitohondrijima (izoenzim M; AST II; 65%)mitohondrijima (izoenzim M; AST II; 65%)
·· infarkt miokardainfarkt miokarda·· virusni hepatitisvirusni hepatitis·· infektivni hepatitisinfektivni hepatitis·· toksitoksiččki hepatitiski hepatitis·· cirozaciroza·· primarni i metastatski tumori jetreprimarni i metastatski tumori jetre·· muskularna distrofijamuskularna distrofija··
LL--aspartat + aspartat + αααααααα--ketoglutarat ketoglutarat ↔↔ AST AST ↔↔ ooksalacetat + Lksalacetat + L--glutamatglutamatreverzibilna reakcija !!!reverzibilna reakcija !!!
AALANINLANIN AMINOTRANSFERAZA (AAMINOTRANSFERAZA (ALLT)T)EC 2.6.1.EC 2.6.1.22.. LL--alaninalanin--22--oksoglutarat aminotransferazaoksoglutarat aminotransferaza
UuUunutar stanice nalazi se u citoplazmi nutar stanice nalazi se u citoplazmi
·· virusni hepatitisvirusni hepatitis·· infektivni hepatitisinfektivni hepatitis·· toksitoksiččki hepatitiski hepatitis·· cirozaciroza·· ““komplikacijekomplikacije”” nakon infarktanakon infarkta·· akutni pankreatitisakutni pankreatitis
LL--alaninalanin + + αααααααα--ketoglutarat ketoglutarat ⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒ AALLT T ⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒⇒ piruvatpiruvat + L+ L--glutamatglutamatreverzibilna reakcija !reverzibilna reakcija !
KREATIN KINAZA (CKKREATIN KINAZA (CK))EC 2.7.3.2.EC 2.7.3.2. ATPATP--kreatin Nkreatin N--fosfotransferazafosfotransferaza
Enzim u citoplazmi stanica je aktivan kao dimer Enzim u citoplazmi stanica je aktivan kao dimer polipeptidpolipeptidaa tipa M (tipa M (musclemuscle) i ) i polipeptida polipeptida tipa B (tipa B (brainbrain))
3 izoenzima3 izoenzima
CKCK--BB, CKBB, CK--MB i CKMB i CK--MMMM
KliniKliniččki je znaki je značčajna razliajna različčita raspodjela izoenzima u ita raspodjela izoenzima u skeletnim i skeletnim i srsrččanom mianom miššiićću (CKu (CK--MB)MB)
KREATIN KINAZA, CK
• Kreatin + ATP → pH 9 → kreatin-P + ADP← pH 6,7 ←
bolesti skeletnih mišićabolesti srcatraume centralnog nervnog sustava,CNStumori pluća, prostate, mjehura, dojke
reverzibilna reakcija !
ALKALNA FOSFATAZA (ALP)ALKALNA FOSFATAZA (ALP)EC 3.1.3.1.EC 3.1.3.1.oortofosfat monoester fosfohidrolazartofosfat monoester fosfohidrolaza
Alkalne fosfataze su skupina glikoproteina smjeAlkalne fosfataze su skupina glikoproteina smješštena tena uglavnom unutar staniuglavnom unutar staniččne membranene membrane.
osteoblasti kostijuosteoblasti kostijustanicstanicee hepatobilijarnog traktahepatobilijarnog trakta
stijenstijenkaka crijevacrijevatubuli bubregatubuli bubrega
placentplacentaa.
Bolesti kostijuBolesti kostiju(rahitis, Paget)(rahitis, Paget)
Bolesti jetreBolesti jetre(opstruktivne)(opstruktivne)
Maligne bolesti Maligne bolesti
Kisela fosfataza, ACPEC 3.1.3.2; ortofosfat monoester fosfohidrolaza
• Fosfataze s optimalnim pH<7,0• Lizosomi stanica (prostata, jetra, slezena, eritrociti,
trombociti, koštana srž )
• Karcinom prostate (!! 75% ima povećanu aktivnost 40-50x)• Upale, traume, nekroza prostate• Bolesti kostiju• Gaucher (sfingolipidoza)
γγγγγγγγ GLUTAMIL TRANSFERAZA (GLUTAMIL TRANSFERAZA (γγγγγγγγ--GT)GT)EC 2.3.2.2.EC 2.3.2.2. γγγγγγγγ--glutamilglutamil--peptid:aminokiselina peptid:aminokiselina γγγγγγγγ--glutamiltransferazaglutamiltransferaza
γγγγγγγγ--GT najviGT najvišše se nalazi ue se nalazi u bubregu, jetri, pankreasu i bubregu, jetri, pankreasu i bilijarnom traktubilijarnom traktu
KliniKliniččki znaki značčajno je odreajno je odreññivanje u serumu bolesnika:ivanje u serumu bolesnika:·· oboljenja jetreoboljenja jetre·· lijekovi, alkohol (indukcija enzimalijekovi, alkohol (indukcija enzima !!))··
AMILAZAAMILAZAEC 3.2.1.1.EC 3.2.1.1. αααααααα--1,41,4--glukan,4glukan,4--glukano hidrolazaglukano hidrolaza
Amilaza u serumu uglavnom potjeAmilaza u serumu uglavnom potječče iz acinarnih e iz acinarnih stanica stanica guguššterateračče, e, žžlijezda slinovnicalijezda slinovnica, testisa, ovarija, , testisa, ovarija,
pluplućća i masnog tkivaa i masnog tkiva
Amilaza ima malu molekulsku masu pa je jedan od enzima Amilaza ima malu molekulsku masu pa je jedan od enzima iz seruma koji se normalno nalazi u mokraiz seruma koji se normalno nalazi u mokraććii
αααααααα--amilaza (endoamilaza) hidrolizira linearne ili amilaza (endoamilaza) hidrolizira linearne ili razgranate ugljikohidrate sastavljene od razgranate ugljikohidrate sastavljene od αααααααα--D glukoze D glukoze bilo gdje u lancu stvarajubilo gdje u lancu stvarajućći brzo smjesu dekstrina, i brzo smjesu dekstrina,
maltoze i glukoze.maltoze i glukoze.
Kataliziraju istu kemijsku reakciju,ali
imaju različite fizikalno-kemijskeosobine
(izozimi, izoforme, varijante enzima, subfrakcije, podtipovi, podoblici...)
Što su IZOENZIMI ????
Različiti oblici istog enzima
• Izoenzimi (pravi) – mono-ili češće multimerni izoenzimi nastali pod kontrolom gena
• Multipli enzimski oblici-– nastali posttranslacijskim mehanizmima “in vivo” ili “in vitro
Razlike i sličnosti
Pravi izoenzimi Multipli oblici
Različiti po katalitičkim i imunokemijskim, Nema razlika u katalitičkimsvojstvima, stabilnosti, naboju, svojstvima, imunokemijski suvrlo male razlike u Mr slični, male razlike u
stabilnosti, razlike u naboju,velike razlike u Mr
Kovalentne/nekovalentne modifikacije (u organizmu, tijekom pročišćavanja, izolacije, pohranjivanja..)
• Deamidacija• Djelomično cijepanje polipeptidnog lanca• Promjenjena fosforilacija• Acilacija• Promjene u ugljikohidratnom dijelu lanca• Agregacija• Povezivanje s drugim biomolekulama (makroenzimi)
Metode analize izoenzima
• Elektroforeza • Kromatografija• Imunoinhibicija• Temperaturna stabilnost• Katalitička inhibicija• Specifičnost prema supstratu...
Izoenzimi u kliničkoj praksi (?)
• Kreatin kinaza (CK)• Laktat dehidrogenaza (LD)• Alkalna fosfataza (ALP)• Kisela fofataza*(ACP)• Amilaza• Kolinesteraza• Glukoza-6-fosfat dehidrogenaza*• N-acetil-beta-D-glukozaminidaza• Fosfoglukomutaza*• Aspartat aminotransferaza• Gama-glutamiltransferaza• Adenozin deaminaza*....• ...........• __________________________• * sudska medicina
Laktat dehidrogenaza-izoenzimi (LD 1-5)
▲▲▲ - akutni infarkt miokarda, hemolitičke bolesti, toksični hepatitis
▲ - virusni hepatitis, progresivna mišićna distrofija, infektivna mononukleoza, maligne bolesti
akutni infarkt miokarda (LD1)bolesti jetre (LDH4 i LDH5)
progresivna mišićna distrofija (LD5)maligne bolesti (LD5/LD1 < 1,3)
Kreatin kinaza (3 izoenzima)
Mr 80 000
CK-MM* → CK-MM1, CK-MM2, CK-MM3CKMB* → CK-MB1, CK-MB2CK-BB → CK-BB, (pseudo-MB)
Mr > 200 000
a) CK-imunoglobulini → makroCK tip 1 (autoimune bolesti)b) CK-MiMi → makroCK tip 2 (maligne bolesti)
(dimer) (oligomer)
�� enzimi kao tkivni biljezienzimi kao tkivni biljezi
Karakteristike profila promjene aktivnosti enzima uinfarktu miokarda (alfa-HBDH=LD-1)
satisati danidani
Alkalna fosfataza izoenzimi
• izoE genetska kontrola Mr___________________________________________________Placenta odvojeni gen 74000
intestinalna odvojeni gen 92000
koštana/ 94000jetrena/ 92400bubrežna zajednički gen 95800_____________________________________________________! Samo u slučaju placentarnog izoE- alelne varijacije; kod ostalih,heterogenost je posljedica posttranslacijskih modifikacija enzimske molekule
-
Alkalna fosfataza izoenzimi
Starost ALP izoenzimi (%)kost jetra ostali (intestinalni)
____________________________________________________________Djeca 85 5 < 10
Odrasli 45 45 < 10
Starije osobe 30 60 < 10___________________________________________________________normalna raspodjela
Slučaj 1.
65 godišnji muškarac dolazi u ambulantu s vidljivom žuticom kojaje intenzivne boje. Nema bolova ali je zamijetio da gubi težinu ida je njegova stolica blijeda. On umjereno pije i nije na nikakvojterapiji lijekovima. Njegovi funkcijski jetreni testovi su:
• Bilirubin 250 µmol/L (3-20 µmol/L)• AST 87 U/L (11-38)• ALT 92 U/L (12-48)• ALP 850 U/L (60-142)
• Što bi bila diferencijalna dijagnoza?• Koja druga ispitivanja bi bila od pomoći za postaviti dijagnozu?
ODGOVOR:
U ovom slučaju najvjerojatnija dijagnoza je karcinomglave pankreasa koji opstruira zajednički žučni kanal.To rezultira, obično bezbolnom žuticom s bilirubinom odoko 250 umol/L. To je nekomplicirana opstruktivnažutica koja je karakterizirana aktivnošću ALP koja jeviše nego tri puta iznad gornje granice ref.intervala.AST i ALT ne pokazuju teško hepatocelularno oštećenje.
Daljnja korisna ispitivanja uključuju slikanjestruktura u blizini glave pankreasa i zajedničkog žučnogkanala da se vidi uzrok opstrukcije.
Slučaj 2.
54-godišnja žena primljena je je u hitnuslužbu s akutnom abdominalnom boli utrajanju od 4 sata. Bol je epigastrična i širi seu leña. Kod ispitivanja bolesnica je bolna ihipotenzivna, postoji epigastrična mekoća.Ispitivanja pokazuju da je amilaza u serumu6 500 U/L (23-91 U/L). Koja je najvjerojatnijadijagnoza?
ODGOVOR:
Postoje mnogi uzroci povećanja serumske amilaze, alivrijednosti 10x veće od gornje granice normale sugotovo uvijek uzrokovane akutnim pankreatitisom, paje klinička slika u ovom slučaju sukladna ovoj dijagnozi.
Umjerenije povećanje (>5x) može biti uzrokovanopankreatitisom ali i drugim uzrocima abdominalne boli,kao perforiranim peptičkim vrijedom. Blago povećanjevidljivo je u bubrežnom poremećaju, budući se amilazačisti bubrezima.
Mira Grudić...ima 54 god. Primljena je u bolnicu prije 4 dana, 5sati nakon što je osjećala bolove u grudima.Liječnik u hitnoj službi uzeo je uzorak krvi zaodreñivanje koncentracije mioglobina, aktivnostiCK, CK-MB i koncentracije srčanog troponina T,cTnT. Rezultati su potvrdili dijagnozu akutnoginfarkta miokarda (AIM) i ona je hospitalizirana. Zbog odreñenih razlika u strukturi sličnih proteinau različitim tkivima (CK-MB, troponin) postavljenaje dijagnoza oštećenja stanica miokarda.
Mira Grudić ima AIM. Dijagnoza se djelom temelji navrijednostima CK-MB, mioglobina i cTnT. Rana dijagnozaje odlučujuća za odreñivanje terapijske intervencije kojaće se primjeniti. Mioglobin zbog svojih karakteristika ima negativnu prediktivnu vrijednost u prvih 2-6 satinakon pojave simptoma. cTnT se pojavljuje u serumurelativno kasno ali je vrlo specifičan za oštećenjemiokarda. U slučaju AIM najčešće se otkriva 3-5 satinakon pojave simptoma, pozitivan je u većini slučajevanakon 8 sati, a približava se osjetljivosti od 100% poslije10-12 sati Vrijednost ostaje povišena sljedećih 5-10 dana.
• Hvala na pozornosti !
top related