Enzimi Za Kloniranje
Post on 20-Oct-2015
60 Views
Preview:
DESCRIPTION
Transcript
GMGM20052005
Kolegij Genetičko inženjerstvo
Program
enzimi, vektori, domaćini dobivanje, modifikacija, obilježavanje DNAstrategije kloniranja proizvodnja rekombinantnih proteinagenske knjižnice mutageneza inaktivacija gena
transgenične životinje i biljke, GMO kloniranje čitavih organizamagenetičko inženjerstvo u biotehnološkoj proizvodnji bioterapeutikatransgenska tehnologija u funkcijskoj genomici
GMGM20052005
Kolegij Genetičko inženjerstvo
Literatura
G. Maravić. CD s predavanjima.Desmond S. T. Nicholl, An introduction to genetic engineering, 2nd ed., Cambridge Univeristy Press, 2003. ISBN: 0-521-00471-3. (Algoritam – 220 kn)S. B. Primrose, R. M. Twyman, R. W. Old, Principles of gene manipulation, 6th ed., Blackwell Science, ISBN: 0-632-05954-0.(Algoritam - 360 kn)
GMGM20052005
Kolegij Genetičko inženjerstvo
Enzimi za molekularno kloniranjedoc. dr. sc. Gordana Maravić
Zavod za biokemiju i molekularnu biologijuFarmaceutsko-biokemijskog fakulteta
GMGM20052005
Genetičko inženjerstvoje poznato i kao
tehnologija
koja uključuje
kidanje, mijenjanje i združivanje
molekula DNA
pomoću
enzima
kao što su
Restrikcijske endonukleaze
DNA ligaza
jest zahtijeva četiri osnovna koraka
stvaranje fragmenata DNA
združivanje s molekulom
nosačem (vektor)
• kloniranje gena• tehnologija
rekombinantne DNA• molekularno kloniranje
primjenjuje se u
znanosti
biotehnologiji
medicini i farmaciji
proizašlo je iz
mikrobne i molekularne
genetike
1972. na sveučilištu Stanford
pravna i etička pitanja
ali postavlja i neka
prvi je put ostvareno
može se koristiti za
koristi se za
unošenje u stanicu domaćina
odabir željenog slijeda
GMGM20052005
Razvoj genetičkog inženjerstva
MENDELOVA ILI KLASIČNA GENETIKA 1958.1962.1965.1968.1969.1975.1978.1980.1993.
1900
1910
1920
1930
1940
1950
1960
1970
1980
1990
2000
Genetičko Mapiranje
Transformacija
MIKROBNA GENETIKA
Molekularna genetika
GENSKA MANIPULACIJA
Razvoj tehnika
Primjene
GMGM20052005
Temeljna otkrića – Nobelove nagrade
1958. J. Lederberg, G. W. Beadle, E. Tatum genska rekombinacija u bakerija, djelovanje gena
1962. F. H. C. Crick, J. D. Watson, M. H. F. Wilkins3D struktura DNA
1965. F. Jacob, A. M. Lwoff, J. L. Monodoperonska teorija za gensku ekspresiju u bakterija
1968. H. G. Khorana, R. W. Holleyotkriće genetičkog koda i njegova uloga u sintezi proteina
1969. M. Delbrück, A. D. Hershey, S. E. Luriastruktura i replikacija virusa
1975. D. Baltimore, R. Dulbecco, H. M. Teminreverzna transkriptaza i tumorski virusi
1980. P. Berg, W. Gilbert, F. Sangertehnologija rekombinantne DNA, sekvenciranje DNA
1993. K. B. Mullis, M. SMithPCR, ciljana mutageneza
GMGM20052005
Primjena genetičkog inženjerstva u farmaciji i medicini
FARMACIJA I MEDICINA
farmakogenomikadijagnostičke n.k.
terapeutske n.k.
vakcineterapeutski proteinidijagnostički
proteini
male terapeutske
molekule
životinjski modeli bolesti
profiliranje klonirani P450 genetičke bolesti
infektivne bolesti
popravak gena
protusmislene n.k.
DNA vakcine
mikrobibiljke
mikrobi životinje
biljke
mikrobigenska terapija
GMGM20052005
Razlike u genskoj ekspresiji između prokariota i eukariota
Prokariotitranskripcija i translacija odvijaju se u citosolu i usko su povezanemRNA je policistronska - kodira za nekoliko polipeptida
Eukariotigeni sadrže introne i eksonetranskripcija se odvija u jezgri, a translacija u citoplazminezrele molekule RNA podliježu sazrijevanjumRNA je monocistronska - kodira za jedan polipeptid
GMGM20052005
Kontrola transkripcije kod
prokariota
represija iliindukcijalac operon
GMGM20052005
Enzimi za molekularno kloniranje
Restrikcijske endonukleazeDruge nukleaze Metil-transferazePolimerazeEnzimi koji modificiraju krajeve DNADNA ligaza
GMGM20052005
Restrikcijske endonukleaze
Dio restrikcijsko-modifikacijskog sustava bakterijaendonukleaza i metilaza dijele isto mjesto prepoznavanjametilaza metilira vlastitu DNA za zaštitu od djelovanja RE koja kida nemodificiranu stranu DNA
enzimi koji prepoznaju točno određeni slijed nukleotidaod 4 do 8 baza u dvolančanoj DNA i kidaju oba lancadvostruke uzvojnice
TIP I - kidaju DNA >1000 pb dalje od mjesta prepoznavanjaTIP III - kidaju DNA 24 do 26 pb nizvodno od mjestaprepoznavanjaTIP II - kidaju DNA unutar samog mjesta prepoznavanjakoje ima dvostruku rotacijsku simetriju (palindrom)
GMGM20052005
Restrikcijske endonukleaze
do sada je otkriveno oko 3000 RE koji prepoznaju preko 200 različitih sljedova (IZOSHIZOMERI – prepoznaju isti slijed)nomenklatura: EcoRI: Escherichia coli RYI3; I - prva izolirana RE
EcoRVEcoRI
GMGM20052005
Mjesta prepoznavanja RE
HaeIII PstI EcoRI5’-GGCC-3’ 5’-CTGCAG-3’ 5’-GAATTC-3’
GGCCCCGG
CTGCAGGACGTC
GAATTCCTTAAG
tupi krajevi ljepljivi krajevi
3’- izbočeni 5’- izbočeni
GMGM20052005
Varijacije restrikcijskih mjesta
mnogi različiti RE proizvode kompatibilne ljepljive krajeve
AgeI (A/CCGGT) i AvaI (C/CCGGG) proizvode kompatibilne 5’ krajeve
ljepljivi krajevi mogu se spojiti ligazom –dobiveni hibridni slijed često mogu kidati RE koji prepoznaju 4 pb:
hibridni slijed ACCGGG prepoznaju:HpaII (C/CGG), NciI (CC/GGG), ScrFI (CC/NGG)
GMGM20052005
Kreiranje novih restrikcijskih mjesta
GAATTCCTTAAG
G AATTCCTTAA G
GAATT AATTCCTTAA TTAAG
EcoRI
DNA polimeraza
GAATTAATTCCTTAATTAAG
GAATT AATTCCTTAA TTAAG
GAAT TAATTCCTTAAT TAAG
G AATTCCTTAA G
XmnI (GAANN/NNTTC)
Tsp09I (/AATT)
AseI (AT/TAAT)
ili MseI (T/TAA)
isto kao i EcoRIDNA
ligaza
GAATTAATTCCTTAATTAAG
GMGM20052005
Aktivnost restrikcijskih enzima
ovisi o:pH (7.2- 8.5)Mg2+ ionima (5-30 mM)koncentraciji soli (mnoge RE 50-150 mM NaCl ili KCl)BSA – stabilizira RE, štiti od razgradnje proteazama, nespecifične adsorpcije ili štetnih faktora okoliša (toplina, površinska napetost)glicerolu – zaštita od smrzavanja na -20ºC; do 5-10%temperaturi – većina RE ima optimalnu aktivnost na 37ºC, neki na 25ºCvolumenu reakcijske smjese
viskozna otopina DNA inhibira difuziju RE i smanjuje aktivnostrazrijeđene otopine s koncentracijom DNA ispod Km smanjuju aktivnost REpreporuča se volumen 10- 50 µL po µg DNA
GMGM20052005
Aktivnost restrikcijskih enzima
“Star activity” – neželjeno kidanje DNA na mjestima koja su slična mjestu prepoznavanja u uvjetima koji nisu optimalni za aktivnost RE:
neprikladan pH ili ionska jakostneprikladan tip iona kofaktora (Mn2 + naspram Mg2+)povećana koncentracija glicerola, etilen-glikola
izražava se u jedinicama1U je količina RE koja će potpuno razgraditi 1 µg DNA za 1 h na optimalnoj temperaturi
GMGM20052005
Izrada restrikcijske karte
određivanje položaja restrikcijskih mjesta unutar fragmenta DNA kidanjem različitim restrikcijskim enzimima pojedinačno i u kombinaciji
Zadatak:Razgradnja fragmenta DNA veličine 15 kb trima restrikcijskim enzimima daje fragmente veličina navedenih u tablici. Odredite položaj restrikcijskih mjesta u fragmentu DNA!
BamHI EcoRI PstI BamHIEcoRI
BamHIPstI
EcoRIPstI
BamHIEcoRIPstI
14 12 8 11 8 7 6
1 3 7 3 6 5 5
1 1 3 3
1
GMGM20052005
Izrada restrikcijske karte0 3 6 9 12 15 kb
14 kb 1 kbBamHI
3 kb 12 kb
12 kb 3 kb
EcoRI
BamHIEcoRI
3 kb 11 kb 1 kbEcoRI + BamHI
BamHIEcoRI
3 kb 5 kb 6kb 1 kbEcoRI + BamHI + PstI
PstI
GMGM20052005
Izrada restrikcijske karte
Zadatak: Linearni fragment DNA veličine 100 kb obrađen je polinukleotid-kinazom uz dodatak radioaktivnog ATP. Razgradnja s EcoRI daje fragmente veličina: 8*, 10, 15, 23 i 44* kb. Razgradnja s BamHI daje fragmente veličina: 11*, 14, 16, 24.5 i 34.5* kb. Razgradnja istovjetnog neradioaktivnog fragmenta s oba enzima daje fragmente veličina 3, 4.5, 5.5, 7, 8, 9.5, 10.5, 17.5 i 34.5 kb. Odredite položaj restrikcijskih mjesta u fragmentu DNA!
EcoRI23108 15 44
8 7 4.510.55.517.53 9.5 34.5
16 34.524.511 14
BamHI
GMGM20052005
Druge nukleazeNukleaza Bal 31• 3’- egzonukleaza +
endonukleaza• prisutna u višoj
koncentraciji skraćuje DNA s oba kraja
5’
5’Egzonukleaza III• stvara 5’ istaknute
krajeve
3’
3’Egzonukleaza λ• stvara 3’ istaknute
krajeve
DNaza I• nasumično kida jl ili dl
DNA
Nukleaza S1• kida isključivo jl DNA ili
RNA
RNaza - kida RNA
GMGM20052005
Metil-transferaze
mnogi laboratorijski sojevi E. coli sadrže metil-transferaze Dam (GA*TC) i Dcm (CC*AGG i CC*TGG
ako je DNA izolirana iz takvog soja, bit će otporna na djelovanje nekih RE jer mjesta prepoznavanja sadrže metilirane nukleotide
MboI i Sau3A prepoznaju isti slijed GATC, no MboI ne kida DNA izDam+ i Dcm+ soja
metilacija utječe na učinkovitost transformacijeDNA iz Dam+ soja teže će transformirati Dam- bakteriju
inicijacija replikacije ihibirana je kad je plazmid metiliran na Dam mjestima
Dam-modificirani plazmid može se replicirati samo jednom u Dam-
soju i nakon toga replikacija prestaje
GMGM20052005
DNA ligaza
popravlja jednolančani lom u okosnici šećer-fosfat između dviju susjednih nukleotida u molekuli DNA
T4 DNA ligaza
ATP
PPi
Enzim-AMP Enzim AMP
P P OH P PP
P P P P P
B B B B B B
B B B B B B
P P P P P
P P OH P PP
P
A
B B B B B B
B B B B B B
P P P P P
P P P PP
B B B B B B
B B B B B B
GMGM20052005
DNA ligaza
u molekularnom kloniranju najčešće se koristi DNA ligaza iz bakteriofaga T4 (T4 DNA ligaza)povezivanje krajeva DNA nastalih razgradnjom restrikcijskim enzimimatupi krajevi teže se povezuju od ljepljivih krajevaoptimalna temperatura reakcije je 37ºC, no pri toj su temperaturi vodikove veze između ljepljivih krajeva nestabilne
ljepljivi krajevi – 3 h na 22ºC ili 16 h na 16ºC (moderna varijanta – 5 min. na sobnoj temperaturi u posebnom puferu)tupi krajevi – 4-16 h na 22ºC
GMGM20052005
Tvorba rekombinantne molekule DNA
EcoRI EcoRI
5’-AATTCG
GCTTAA-5’
5’-AATTCG
GCTTAA-5’
GAATTC
CTTAAGGAAT
TCCT
TAAG
DNA ligaza
GMGM20052005
Polimeraze
DNA-polimeraza Ipolimerazna, 3’ 5’ i 5’ 3’ egzonukleazna aktivnost
“Nick” translacijalom jednog lanca dl DNA nastaje spontano ili djelovanjem niskih koncentracija DNaze u reakcijskoj smjesiDNA polimeraza I dodaje nove dNTP i razgrađuje lanac 5’ 3’ egzonukleaznom aktivnošću – jl lom (“nick”) tako se pomiče uzduž molekule DNAvisoko obilježena molekula DNA nastaje dodatkom jednog radioaktivno obilježenog dNTP (obično dATP obilježen radioaktivnim fosforom – 32P ili 33P)
GMGM20052005
Obilježavanje DNA “nick” translacijom
jednolančani lom (nick)
Ako je jedan od dNTP u reakcijskoj smjesi radioaktivno obilježen, djelovanjem DNA-polimeraze I nastaje visoko obilježena molekula DNA
DNA-polimeraza I
mjesto jl loma
GMGM20052005
Polimeraze
Klenowljev fragment
dio DNA-polimeraze I kojem nedostaje 5’ 3’egzonukleazna aktivnostu reakcijskim uvjetima 3’ 5’ egzonukleazna aktivnost je suprimiranauporaba pri sekvenciranju Sangerovom dideoksi metodom i za obilježavanje DNA metodom produljenja ishodnice (primer extension, oligolabelling)
GMGM20052005
Obilježavanje DNA metodom produljenja ishodnice
• denaturacija —jednolančana DNA 3’5’
• dodatak ishodnice —slobodan 3’-OH kraj
3’
HO5’
ishodnica5’
• Klenowljev fragment DNA-polimeraze I nastavlja sintezu komplementarnog lanca produžujući ishodnicu –ugradnja radioaktivnog dATP daje obilježenu molekulu s vrlo visokom specifičnom aktivnošću
DNA-polimeraza I (Klenow)
ishodnica
GMGM20052005
Polimeraze
Reverzna transkriptazaRNA-ovisna DNA-polimerazanema egzonukleazne aktivnostikoristi se za dobivanje cDNA iz mRNA
GMGM20052005
Enzimi koji modificiraju krajeve DNA
Alkalna fosfatazabakterijska alkalna fosfataza (BAP)AP iz goveđeg crijeva (CIP – calf intestinal phosphatase)uklanja fosfatnu skupinu s 5’-kraja DNAsprečavanje neželjene ligacije (recirkularizacija plazmida razgrađenog jednim restrikcijskim enzimom)koristi se i prije uporabe polinukleotid kinaze prilikom obilježavanja DNA
GMGM20052005
Enzimi koji modificiraju krajeve DNA
Polinukleotid-kinaza (PNK)prenosi terminalnu fosfatnu skupinu ATP-a na slobodnu OH skupinu na 5’-kraju DNA (DNA se prethodno defosforilira uporabom AP)služi za radioaktivno obilježavanje krajeva DNA (i RNA)
HO OH
OHHO
HO OH
OHHO
ATP
PNK
GMGM20052005
Enzimi koji modificiraju krajeve DNA
Terminalna transferaza (TT)(terminalna deoksinukleotidil-transferaza)
opetovano dodaje nukleotide na slobodan 3’-krajnajbolje radi na istaknutim 3’-krajevima, no reakcijski uvjeti mogu se prilagoditi i za tupe i 3’-uvučene krajeveuglavnom se koristi za dodatak homopolimera na kraj molekule DNA
GMGM20052005
Za kidanje, modifikaciju i združivanje DNA
potrebni su
i
Restrikcijske endonukleaze
specifičnim mjestima
Stvaranje fragmenata
DNA Izradu restrikcijskih
karata
kidaju DNA na
i koriste se za
Nukleaze
DNA pol I Klenow
RT
Polimeraze
Endo- Egzo-
RE DNAza I
S1Bal 31 Exo III Exo λ
Enzimi koji djeluju na krajevima
AP PNK TT
DNA ligaza
tvori rekombinantnu
DNA
Fosfodiesterskih veza
spaja molekule DNA
tvorbom
enzimi koji modificiraju DNA
katalitičke proteinske molekule
različitih tipova stanica
komercijalno dostupni
enzimipročišćeni
izi
3 glavne skupine
GMGM20052005
Spajanje dvaju fragmenata DNA pomoću homopolimernih repova5’
5’3’3’
5’3’5’ 3’
5’3’A(A)nA5’ A(A)nA3’
5’5’3’3’
5’3’5’ 3’
5’5’ T(T)nT3’
3’T(T)nTA(A)
n A
T(T)n TT(
T) nT
A(A) n
A
Egzonukleaza λ Egzonukleaza λ
Terminalna transferaza + dATP
Terminalna transferaza + dTTP
GMGM20052005
Linkeri (poveznice)
Ukoliko fragment DNA nema prikladnih restrikcijskih mjesta, na krajeve DNA mogu se dodati kratki odsječci DNA sa željenim mjestima koje prepoznaju RE:Linkeri (poveznice)
komplementarni oligomeri tupih krajeva dobiveni kemijskom sintezom
CCGAATTCGGGGCTTAAGCC
CCGAATTCGGGGCTTAAGCC
CCGAATTCGGGGCTTAAGCC
DNA ligaza
EcoRI
CCGGGCTTAA-5’
5’-AATTCGGGCC
GMGM20052005
Adaptori
Adaptorisintetički oligomeri koji s jedne strane imaju tupi kraj kojim se adaptor veže na željenu molekulu DNA, a s druge ljepljivi kraj koji omogućava izravno povezivanje s kompatibilnim ljepljivim krajem vektora (ili neke druge DNA)
CCCGGGGGGCCCCTAG-5’
5’-GATCCCCGGGGGGCCC
DNA ligaza
BamHI adaptor5’-GATCCCCGGGGGGCCC
GMGM20052005
Načini dobivanja fragmenata DNA
mehaničkim kidanjem (soniciranjem)razgradnjom restrikcijskim enzimima (potpuna i djelomična)sintetičkim putem (oligonukleotidi)prevođenjem mRNA u cDNA pomoću reverzne transkriptaze umnažanjem lančanom reakcijom polimeraze
GMGM20052005
PCR u kloniranju: dizajn posebnih ishodnica
dodavanje kratkih odsječaka nekomplementarnih kalupu na 5’-kraj ishodnice
mjesta prepoznavanja REsljedovi za lakše pročišćavanje proteina (6x-His tag)
5’5’ 3’3’
GCGCAAGCTT5’
5’3’
CTTAAGCCGG 5’
3’5’
CTTAAGCCGGGAATTCGGCCGCGCAAGCTT
CGCGTTCGAA
EcoRIHindIII5’3’
GMGM20052005
PCR u kloniranju: dizajn posebnih ishodnica
ako je poznat samo dio a.k. slijeda proteina, a želimo izolirati gen:
za degenerirani kodon sintetizira se miješana ishodnica sa svim kombinacijama nukleotida na 3. mjestu
Phe-Leu-Pro-Ser-Ala-Lys-Trp-Ala-Tyr-Asp-Proa.k. slijed
broj kodona po a.k. 2 6 4 6 4 2 1 4 2 2 4
Sinteza miješane ishodnice Ala Lys Trp Ala Tyr Asp Pro
GCA AAA TGG GCA TAC GAC CCGCT
G GCT
T T
4 X 2 X 1 X 4 X 2 X 2 X 1 = 128broj kombinacija
GMGM20052005
PCR u kloniranju: dizajn posebnih ishodnica
ako je poznat samo dio a.k. slijeda proteina, a želimo izolirati gen:
umjesto 3. mjesta u ishodnicu se ugrađuje inozin koji se jednako dobro sparuje sa svim nukleotidima
Phe-Leu-Pro-Ser-Ala-Lys-Trp-Ala-Tyr-Asp-Proa.k. slijed
broj kodona po a.k. 2 6 4 6 4 2 1 4 2 2 4
Uporaba inozina kao degenerirane baze
Ala Lys Trp Ala Tyr Asp Pro
GCI AAA TGG GCI TAC GAC CCG T T
1 X 2 X 1 X 1 X 2 X 2 X 1 = 8broj kombinacija
GMGM20052005
Polimeraze s mogućnošću popravka ugradnje krive baze
Taq polimeraza nema 3’ 5’ egzonukleaznu aktivnost – ugradnja pogrešnog nukleotida zaustavlja sintezu
standardni PCR ne može učinkovito umnožiti odsječke puno dulje od 3 kbdodatkom “proofreading” polimeraze omogućava se vjerna i učinkovita sinteza duljih fragmenata
Tma (Thermotoga maritima)Deep VentTM (Pyrococcus sp.)Tli (Thermococcus litoralis)Pfu (Pyrococcus furiosus)Pwo (Pyrococcus woesi)
top related