Effetti endocrini delle micotossine - old.iss.itold.iss.it/binary/inte/cont/4Colacci et al. - Micotossine come IE... · Sviluppo di strumenti diagnostici innovativi per la rapida

Effetti endocrini delle Effetti endocrini delle micotossinemicotossineAnnamaria Colacci, Monica Vaccari, Maria Grazia Mascolo, Stefania Perdichizzi, Elena Morandi, Francesca Rotondo, Paola Silingardi Eccellenza Cancerogenesi AmbientaleAgenzia Regionale Prevenzione e Ambiente – Emilia Romagna

Inquadramento del problemaInquadramento del problemaIncremento dei ritrovamenti◦ Variazioni climatiche◦ Non conformita’ dei prodotti di importazione

da Paesi non UEDiminuzione dei limiti ammessi◦ REG CE N. 1126/2007 del 28/09/07

(modifica il REG CE N. 1881/2006)◦ Necessita’ di strumenti piu’ sensibili per

l’identificazione◦ Maggiori informazioni per una stima piu’

puntuale dei rischi

Effetti tossici delle Effetti tossici delle micotossinemicotossine

Micotossina Effetto

Aflatossina B1 Epatotossico, iperplasia del dotto biliare, emoraggia renale e intestinale, tumore del fegato (IARC Gruppo 1

Aflatossina M1 peobabile cancerogeno (IARC Gruppo 2B)

Ocratossina A Nefrotossico, teratogeno, immunosoppressore, cancerogeno renale

Fumonisina B1 Epatotossico, nefrotossico, probabile tumore del fegato e dell’esofago (?) (IARC Gruppo 2B)

Patulina Emorragia polmonare, convulsione, edema cerebrale, mutagena, embriotossica, immunotossica

Tricoteceni Vomito, diarrea, sanguinamento, dispnea, prurito, allergia, possibile cancerogeno (IARC Gruppo 3)

Zearalenone Estrogenosimile

Ergotina Neurotossico

Sviluppo di strumenti diagnostici innovativi per la rapida identificazione di classi di contaminanti in matrici alimentari

FumonisineFumonisineLa fumonisina B1 ◦ 1,2,3-

propanetricarboxylic acid

◦ una struttura molecolare molto simile a quella dello scheletro degli sfingolipidi, il che fa sìche questa micotossina agisca come inibitore dell’enzima ceramide sintasi, meccanismo che sembra essere cruciale per la tossicitàe cancerogenicitàindotta da fumonisina B1.

Fumonisine B1+B2Fumonisine B1+B2

Prodotti alimentari Tenori massimi in µg/kg

Granoturco non trasformato ad eccezione di quello destinato alla molitura ad umido

4000*

Granoturco destinato al consumo umano diretto, prodotti a base di granoturco destinati al consumo umano diretto, eccetto i quelli indicati successivamente

1000*

Cereali da colazione e merende a base di granoturco 800*

Alimenti a base di granoturco ed altri alimenti destinati ai lattanti e ai bambini

200*

Frazioni della molitura del granoturco di dimensioni > 500 micron………………..

1400*

Frazioni della molitura del granoturco di dimensioni < 500 micron………………..

2000*

*si applica dal 01/10/07

REG CE N. 1126/2007 del 28/09/07 (modifica il REG CE N. 1881/2006)

cortesia Cecilia Bergamini ARPA-ER

Livelli di contaminazione da Livelli di contaminazione da fumonisine nei diversi Paesi UEfumonisine nei diversi Paesi UE

Final Report SCOOP 2003

35 campioni di farina di mais, 1 granella di mais(5 campioni presentano contaminazione superiore al limite 2000 µg/kg, la granella è conforme perché < 5000 µg/kg)

> 2000 µg/kg < LDR

< 1000 µg/kg

da 1000 a 2000 µg/kg

16%

16%63%

5%

Le fumonisine sono state determinate anche in 1 campione di olio di mais, 1 campione di miglio biologico e in 2 campioni di farina di grano tenero (risultati positivi circa 70 µg/kg tot)

Analisi FUMONISINE B1 e B2 nel maisAnalisi FUMONISINE B1 e B2 nel mais

cortesia Cecilia Bergamini ARPA-ER

ZearalenoeZearalenoe◦ Zearalenone (ZEA),

noto anche come RAL e micotossina F-2

è un potente metabolita ad azione estrogenica prodotto da alcune specie di Fusarium. ed in particolare F. graminearum, F. culmorum e F. equiseti,Lo zearalenone, chimicamente è il lattone dell’acido resorciclico , e i suoi principali metaboliti sono l’alfa ed il beta Zearalenolo

Prodotti alimentari Tenori massimi in µg/kg

Cereali non trasformati diversi dal granoturco 100Granoturco non trasformato ad eccezione di quello destinato a molitura

ad umido350*

Cerali destinati al consumo umano diretto, farina di cereali,crusca e germe destinati al consumo umano diretto, eccetto i quelli indicati successivamente

75

Olio di granoturco raffinato 400*Pane, prodotti da forno e cereali da colazione esclusi quelli a base

granoturco50

Granoturco destinato al consumo umano diretto, merende a base digranoturco e cereali da colazione a base di granoturco

100*

Alimenti a base di cereali trasformati destinati ai lattanti e ai bambini 20Alimenti a base di granoturco destinati ai lattanti e ai bambini 20*

*si applica dal 01/07/07

ZearalenoneZearalenoneREG CE N. 1126/2007 del 28/09/07 (modifica il REG CE N. 1881/2006)

ZearalenoneZearalenone

N° reg Campione diZearalenone

µg/kgDONµg/kg

Afla B1 e tot µg/kg

12409 Creackers integrali < 4 168,5 < 0.5

12414 Bastoncini crusca < 4 < 80 < 0.5

12441 Fette biscottate < 4 < 80 < 0.5

12514 Cereali 1a colazione < 4 < 80

12533 Cornflakes 44,9 385,6 < 0.5

12534 Fiocchi frumento integrale < 4 < 80 < 0.5

23397 Farina di mais < 4 < 0.5

23398 Farina integrale < 4 < 0.5

13434 Fiocchi di riso e frumento < 4 < 0.5

13435 Mix cereali < 4 < 0.5

13436 Fiocchi di riso < 4 < 0.5

13488 Farina di farro biologica < 4 < 0.5

13489 Farina di farro biologica < 4 < 0.5

cortesia Cecilia Bergamini ARPA-ER

EFFETTI CITOTOSSICI E TRASFORMANTI EFFETTI CITOTOSSICI E TRASFORMANTI IN CELLULE BALB/c 3T3IN CELLULE BALB/c 3T3

ENDPOINT

Citotossicità Trasformazione Composto Dose saggiata Dose minima

efficace (a) Dose saggiata Dose minima

efficace (a) A1260 0.1 – 20 µM 0.5 µM 0.5 - 20 20 µM PCB-Mix 0.1 – 20 µM 0.1µM 0.5 - 20 20 µM Fumonisina 0.1 – 60 µM 30 µM ND ND Zearalenone 10 nM – 40 µM NS NS NS Penconazolo 0.1 – 500 µM 100 µM NS NS (a) Dose minima che indotto effetti significativi. NS = nessun effetto significativo; ND = non determinato

FUMONISINA B1Non trasformante fino a 1.36 mM

PROCIMIDONETrasformante in BALB/c 3T3

AFLATOSSINA M1Potenza cancerogena inferiore di un ordine di grandezza rispetto a AFB1

SAGGIO DI VITALITASAGGIO DI VITALITA’’-- LINEE LINEE CELLULARICELLULARI

Linea cellulare Caratteristiche Tempo di

raddoppiamento (hr)

Assetto recettoriale

MCF-7 Adenocarcinoma mammario, Differenziate, Non metastatiche

61

Risposta funzionale agli estrogeni positiva; mRNA per ER α mRNA per ER β

HepG2 Carcinoma epatocellulare 35 Recettori per l’insulina

e per l’IGF II

T47D Adenocarcinoma mammario, metastatiche

32

Recettori per gli androgeni, gli estrogeni,progesterone e recettore Ah

SAGGIO DI VITALITASAGGIO DI VITALITA’’-- CALCOLO DELLA CALCOLO DELLA GI50GI50

Modello Cellulare

MCF7 T47D HepG2

Composto 24h 48h 72h 6g 24h 48h 72h 6g 24h 48h 72h 6g A1260 (0.001 - 100 µM) 2 10 5 4 12 18 19 17

PCB-Mix (0.001 - 100 µM) 18 25 28 24

Fumonisina (0.1-60 µM) 138 233 214 111 3 499

Zearalenone (0.002-20 µM)

17 3

Aflatossina M1 (0.01-5 µM)

0.16 0.36 0.31 0.15

Procimidone (0.01 - 500 µM) NS NS NS NS NS NS

Penconazolo (0.01 - 500 µM) 36 40 22 13 14

NS = nessun effetto significativo

ATTIVITATTIVITÀÀ ESTROGENICA ESTROGENICA IN CELLULE T47DIN CELLULE T47D

Composto Risultato in E-Screen

Dose minima efficace

A1260 Negativo NS PCB-Mix Negativo NS Fumonisina Negativo NS Zearalenone Positivo 1.8 nM Penconazolo Negativo NS Procimidone Negativo NS

ZEARALENONE RPE = 0.025

VALUTAZIONE DELLA MODULAZIONE VALUTAZIONE DELLA MODULAZIONE TRASCRIZIONALE TRASCRIZIONALE

MARCATORI DI PATHWAY ◦ gene PDZK (pathway degli estrogeni) DOSE◦ Zearalenone 2 nM

CONTROLLO POSITIVO◦ 17 beta estradiolo 10 nM

DURATA DEL TRATTAMENTO ◦ 4 h◦ 16 h

T47D: gene PDZKT47D: gene PDZK

**

*

0

2

4

6

DMSO E2 MetOH Zea

2^-∆∆C

t4 ore16 ore

Studio in microarrayStudio in microarray1. Trattamento della linea MCF-7 con 20 µM ZEA per 72 h

2. Estrazione e purificazione dell’RNA totale

3. Linear amplification e sintesi di cRNA fluorescente

4. Lavaggi e scansione delle slide5. Analisi mediante il software Feature

Extraction6. Elaborazione dati7. Interpretazione biologica

DISEGNO SPERIMENTALEDISEGNO SPERIMENTALE

Marcatura dell’RNA

Slide diretta: controllo marcato con Cy3 trattato marcato con Cy5Replica in dye-swap: scambio dei fluorofori

(controllo-Cy5, trattato-Cy3)

Fluorofori utilizzati: Cy3 (570 nm) e Cy5 (670 nm)verde rosso

ANALISI dellANALISI dell’’RNA ESTRATTORNA ESTRATTO

Campioni: trattato con ZEA e non trattato (controllo)

QUANTIFICAZIONE CONTROLLO QUALITA’

Lettura allo spettrofotometro (260 e 280 nm)

Calcolo della concentrazione (µg/ml)

Analisi al Bionanalyzer Agilent 2100

Profili qualitativi

Controllo Trattato

Dalla LINEAR AMLIFICATION alla scansioneDalla LINEAR AMLIFICATION alla scansione

Materiale di partenza

ProdottiMix dei prodottiIbridazione su slideScansione slide

1) Retrotrascrizione

2) Trascrizione e marcatura con Cy3 e Cy5

3) Purificazione4) Quantificazione

dell’incorporazione di fluorescenza

Piattaforma AgilentPiattaforma AgilentUn laser SHG-YAG (532nm) e un laser a Elio-neon (633nm), per eccitare i fluorocromi Cy3 e Cy5.

Carosello a 48 posizioni

Sistema distintivo di continua messa a fuoco automatica dei laser sul piano esatto del campione durante la scansione

Software di Feature Extraction

SELEZIONE DEI GENISELEZIONE DEI GENI

Match delle due replicheFiltro: P-VALUE < 0,05

Lista di 530 GENI

Tool di interpretazione biologica: GOMINER

GO term mytotic cell cycle.GO term mytotic cell cycle.

GO term apoptosisGO term apoptosis

GO term EGFR activity, AhR binding ed ER GO term EGFR activity, AhR binding ed ER binding.binding.

Modulazione di pathway coinvolti Modulazione di pathway coinvolti nella risposta estrogenicanella risposta estrogenica

modulazione della cascata di segnale mediata da recettori estrogeni (ER)effetto di ZEA sul pathway di aryl hydrocarbon receptor (AhR)Effetto sul pathway di epidermal grow factor recetor (EGFR)

Modulazione di pathway coinvolti Modulazione di pathway coinvolti nella risposta estrogenicanella risposta estrogenica

Significativamente modulata la categoria del legame ai recettori per gli estrogeni◦ NRIP1 (nuclear receptor interacting protein 1)

cofattore attivato dal recettore per gli estrogeni con un ruolo importante nella modulazione negativa dell’ espressione del recettore

◦ RERG (ras-like estrogen regulated growth inhibitor).

inibitore della proliferazione cellulare in linee di carcinoma mammario ER-positive

altri marcatori del pathway di risposta agli estrogeni

PDZK1, HSP27, GREB1 e catepsina D che sono risultati tutti up-regolati.

Vitalità

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

1 2 3 4 5

Giorni

Ass

orba

nza

MTT

NT

MetOH

2 nM

10 nM

25 nM

50 nM

0.1 µM

1 µM

10 µM

20 µM

Inibizione significativa della proliferazione cellulare alla dose 20 µM

Lettura al Multiwell Reader con filtri 540/690 nm

MTT TEST: RISULTATIMTT TEST: RISULTATI

NT

2 nM(IE) 10 nM

N° dosi = 4

ZEARALENONEZEARALENONE

50 nM(≈ LMR)

100 nM

…e le fumonisine?

NT

1 µM 3 µM(≈ LMR)(≈ GI50)

N° dosi = 4

FUMONISINA B1FUMONISINA B1

10 µM 30 µM

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

FB1 22.5 ppm FB1 45 ppm FB1 90 ppm

% e

ffect

Fumonisina B1

Fumo B1+Fumo B2 (22 ppm)

Analisi al microtox della tossicità della fumonisina B2 pura e in combinazione con la fumonisina B1

RingraziamentiRingraziamentiCaratterizzazione micotossine ◦ Cecilia Bergamini

Tossicologia sperimentale◦ Monica Vaccari◦ Stefania Perdichizzi◦ Francesca Rotondo

Tossicogenomica◦ Paola Silingardi◦ Elena Morandi◦ Maria Grazia

Mascolo

1. Analisi al microtox della tossicità acuta della fumonisina B2 pura e in combinazione con la fumonisina B1.

2. Analisi al microtox della tossicità acuta di farine di mais contaminate da fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale

3. Disegno di una slide-microarray per il Vibrio Fischeri.

4. Messa a punto del protocollo di estrazione e marcatura dell’RNA procariotico

Fumonisina B2 Fumonisina B1

Analisi al microtox della tossicità della fumonisina B2 pura e in combinazione con la fumonisina B1

Analisi al microtox della tossicità della fumonisina B2 pura e in combinazione con la fumonisina B1

Analisi al microtox della tossicità della fumonisina B2 pura e in combinazione con la fumonisina B1

EC50 Fumo B2: 93 mg/L

EC50 Fumo B1: 47 mg/L

Analisi al microtox della tossicità della fumonisina B2 pura e in combinazione con la fumonisina B1

Analisi al microtox della tossicitAnalisi al microtox della tossicitàà acute di farine di mais contaminate da acute di farine di mais contaminate da fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal qualefumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale

Tipologia di campione

FB1 (µg/Kg) FB2 (µg/Kg)

Farina di mais 4438 1473

Farina di mais 2106 838

Farina di mais 1168 443

Farina di mais 537 273

Farina di mais 229 85

Farina di mais <32 19

Analisi al microtox della tossicitAnalisi al microtox della tossicitàà acute di farine di mais contaminate da acute di farine di mais contaminate da fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal qualefumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale

Conc. FB1 di partenza

(ppb)

conc testata in microtox

(µg/l)

0 0

229 2.6

537 6.4

1168 14.0

1229 13.9

4438 52.9

Analisi al microtox della tossicitAnalisi al microtox della tossicitàà acute di farine di mais contaminate da acute di farine di mais contaminate da fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale

campioneConc. testata al microtox (90%)

in mg/lbianco 90

bianco 13

bianco 27

bianco 53

bianco 107

bianco 213

bianco 438

bianco 757

bianco 1529

bianco 2664

Analisi al microtox della tossicitAnalisi al microtox della tossicitàà acute di farine di mais contaminate da acute di farine di mais contaminate da fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale

Analisi al microtox della tossicitAnalisi al microtox della tossicitàà acute di farine di mais contaminate da acute di farine di mais contaminate da fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale

Disegno di una slideDisegno di una slide--microarray per il Vibrio Fischerimicroarray per il Vibrio Fischeri ES114ES114

Total Number of all DNA molecules: 3 100.00%

Total Size of all DNA molecules: 4284050 bp 100.00%

Number of Primary Annotation coding bases: 3701728 bp 86.40%

Number of TIGR Annotation coding bases: 3696654 bp 86.28%

Number of G+C bases: 1643110 bp 38.35%

Primary Annotation Summary

Total genes: 3802 100.00%

Protein coding genes: 3802 100.00%

Genes assigned a role category: 3223 84.77%

Genes not assigned a role category: 111 2.91%

Conserved hypothetical genes: 75 1.97%

Hypothetical genes: 393 10.33%

TIGR Automated Annotation Summary

Total genes: 4038 100.00%

Protein coding genes: 3882 96.13%

Genes assigned a role category: 3258 83.92%

Genes not assigned a role category: 115 2.96%

Conserved hypothetical genes: 76 1.95%

Hypothetical genes: 433 11.15%

tRNA genes: 119 2.94%

rRNA genes: 37 0.91%

Disegno di una slideDisegno di una slide--microarray per il Vibrio Fischerimicroarray per il Vibrio Fischeri ES114ES114

Messa a punto del protocollo di estrazione e marcatura dellMessa a punto del protocollo di estrazione e marcatura dell’’RNA procarioticoRNA procariotico

Partendo da 100 ng di RNA tot arriviamo ad ottenere 7.8 µggamma di cRNA marcato con circa 17pmoli di Cy5 CTP incorporato ogni µg di cRNA

NT

50 nM 0.5 µM(≈ LMR)

N° dosi = 4

PENCONAZOLOPENCONAZOLO

5 µM15 µM(≈ GI50)

SCELTA DEL DESIGN SCELTA DEL DESIGN SPERIMENTALESPERIMENTALE

GLI STEP DI LAVORO ◦ I° step

individuazione del pattern di geni che permette di stabilire la presenza o meno di una molecola

◦ II° steptest del pattern di geni con campioni di cui è nota la contaminazione

◦ III° stepapplicazione su matrice ambientale di cui non ènota la contaminazione

Tipo campione Numero di campioni analizzati Percentuale di campioni

positivi

Grano 847 30.0 %

Farine di grano 768 24.0 %

Prodotti a base di grano 285 10.5 %

Mais 824 79.0%

Farine di mais 195 51.0 %

Prodotti a base di mais 246 53.0%

Riso 208 0.0 %

Prodotti a base di riso 134 9.0 %

Orzo 226 4.9 %

Avena 377 20.0%

Segale 84 4.8 %

Baby food 356 23.3 %

Latte 100 3.0 %

Linea cellulare CaratteristicheTempo di

raddoppiamento(hr)

Assetto recettoriale

MCF-7Adenocarcinoma mammario, Differenziate,Non metastatiche

61

Risposta funzionale agli estrogeni positiva;mRNA per ER αmRNA per ER β

HepG2 Carcinoma epatocellulare 35 Recettori per l’insulina

e per l’IGF II

T47DAdenocarcinoma mammario,metastatiche

32

Recettori per gli androgeni, gli estrogeni,progesterone e recettore Ah

ANALISI 1 : M1 vs NT

ANALISI 2 : M1 vs {M2,M3,M4,M5}

II°° STEP: POSSIBILI ANALISISTEP: POSSIBILI ANALISI

Come possiamo individuare il pattern di geni per una certa molecola?Possibili analisi per molecola “Uno”:

LE NOSTRE RISORSELE NOSTRE RISORSE

90 microarray slide (human, 44k)2 protocolli sperimentali ◦ “One Colour”◦ “Two Colour”5 molecole◦ pure◦ da estratto

NT

M1dose 1

M1dose 4

M2dose 1

M2dose 4

M5dose 1

M5dose 4

… … ……….

N° dosi = 4

DESIGN SPERIMENTALE CON DESIGN SPERIMENTALE CON ““TWO TWO COLOURCOLOUR””