“EFECTO DEL ALMACENAMIENTO DE OOCITOS EN SU FERTILIDAD Y SIMETRÍA DE LOS PRIMEROS BLASTÓMEROS DE SALMÓN COHO (Oncorhynchus kisutch)”
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UNIVERSIDAD CATÓLICA DE TEMUCO
FACULTAD DE RECURSOS NATURALES
ESCUELA DE ACUICULTURA
“EFECTO DEL ALMACENAMIENTO DE OOCITOS EN SU FERTILIDAD Y
SIMETRÍA DE LOS PRIMEROS BLASTÓMEROS DE SALMÓN COHO
(Oncorhynchus kisutch)”
Trabajo de titulación presentado como
parte de los requisitos para optar al grado
de Licenciado en Ciencias de la Acuicultura.
CÉSAR FUENTES GAMBOA
CLAUDIA GONZÁLEZ WEBER
CARLOS ROLDÁN MILLAHUAL
TEMUCO–CHILE
2011
I
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios por demostrarme con experiencias cuán importante es la familia en la
Agradezco a Dios por demostrarme con experiencias cuán importante es la
familia en la vida. A mis padres, que me entregaron las bases para llevar esta
vida a gusto y feliz. A mi madre por su infinito amor, el pilar de mi vida, mi
todo, la que con su esfuerzo y entrega me enseñó que frente al más gran
dilema se puede salir adelante. A ti papá que ves todo lo que hago desde un
plano celestial, desde pequeña me enseñaste a entregar amor y disfrutar
cada momento como si fuese el último. A mis hermanos de la vida por tantos
momentos compartidos que espero jamás culminen. A mi abuela, tíos, primos
y amigos que le dan alegría a mis días.
A todos ustedes un abrazo y gracias por apoyarme en el término de etapa.
Claudia González Weber.
Este trabajo está dedicado a mis padres, a quienes le agradezco de todo
corazón por su amor, apoyo, cariñó y comprensión. En todo momento los llevo
conmigo. Agradezco a mis hermanas y a mi abuela por la compañía y el
apoyo que me brindan. Sé que cuento con ellas siempre.
Agradezco a Dios por llenar mi vida de dicha y bendiciones. Por haber
encontrado el amor, y junto a ello un hermoso bebe que viene en camino.
Agradezco a los amigos por su confianza y lealtad. Agradezco a mis
profesores por su disposición y ayuda brindadas.
Carlos Roldán Millahual
En esta etapa final quisiera agradecer a Dios porque en su gran inmensidad
que me permitió culminar esta hermosa etapa.
Agradezco a mi familia por la confianza entregada, amor, compañía y ayuda
en todo momento para cumplir uno de mis objetivos en la vida.
Quiero dedicar este trabajo a Dios por estar conmigo cada día y a mi hija por
ser lo más preciado en mi vida. A todas las personas que me han apoyado y
creyeron en mí. De forma muy especial a mi madre y mi padre, a mi hermano
Gabriel y a todos mis familiares y seres queridos que han estado conmigo.
César Fuentes Gamboa.
II
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Introducción…………………………………………………………….……………..1
Materiales y métodos…………………………………………………………….…..4
Resultados…………………………………………………………………………….6
Discusión………………………………………………………………………….…11
Bibliografía…………………………………………………………………………..15
III
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura N°1. Criterio utilizado para caracterización morfométrica de los primeros
cuatro blastómeros de salmón coho (Oncorhynchus kisutch), donde “L” indica
el largo y ”A” el ancho………………………………………………………………….5
Figura N°2. Blastodiscos de salmón coho (Oncorhynchus kisutch), obtenidos de
ovas almacenadas por 4h a 4±0,2°C. No fecundado (A), simétrico con un clivaje
(B), simétricos con dos clivajes (C), simétrico con tres clivajes (D) (barra
horizontal 300 µm, aumento de 56X)……………….……………………….……….6
Figura Nº3. Porcentaje de fecundación y porcentaje de embriones
morfológicamente simétricos (promedio ± desviación estándar) de salmón coho
(Oncorhynchus kitsuch), obtenidos de ovas almacenadas desde 4 a 96 horas,
con 20 horas de incubación a 4±0,2°C …………………………………….………..6
Figura Nº 4. Blastodiscos no fecundados de salmón coho (Oncorhynchus
kisutch), obtenidos de ovas almacenadas a 4±0,2°C. Por 48 h (A), 72 h (B) y
96 (C) horas (barra horizontal 300 µm, aumento de
56X)………………………………………………………………………………….…..7
Figura Nº5. Anormalidades en blastodiscos embrionarios de salmón coho
(Oncorhynchus kisutch). Número impar de blastómeros (A), blastómeros no
definidos (B), células aplanadas (C), distribución espacial desorganizada (D),
embriones asimétricos (E, F, G) (Barra horizontal 300 µm, aumento de
56X)…………………………………….………………………………………….…….7
Figura Nº6. Disperción de las proporciones entre largos (a), anchos (b) y
entre anchos y largos (c) de los primeros blastómeros de salmón coho
(Oncorhynchus kisutch). Donde valores menores a 0,9 y mayores a 1,1 son
significativamente distintos de 1 (p<0,05) la línea roja indica el límite de simetría
entre las proporciones…...…………………………………………………………..10
IV
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla Nº1. Largo y ancho de los primeros cuatro blastómeros de salmón coho
(Oncorhynchus kisutch) (promedio ± desviación estándar)…………………..…...8
Tabla 2. Proporción entre largos, anchos y anchos y largos de los cuatro
primeros blastómeros en salmón coho (Oncorhynchus kisutch) (n=12
blastodiscos por hora de almacenamiento)…………………………………………9
Tabla 3. Tiempo de almacenamiento (horas) y porcentaje de fertilidad para
distintas temperaturas y en diferentes especies de
salmónidos.……………………………………………………………………………12
V
RESUMEN
En la presente investigación se almacenaron “In vitro” oocitos de salmón coho
(Oncorhynchus kisutch) por 4, 24, 48, 72 y 96 horas a 4±0,2°C en líquido
celómico. Para luego ser fecundados con métodos estándares para
salmonicultura. Se incubó embriones a 4±0,2°C por 20 horas y posteriormente
se fijó en solución de “Stockard” (Costello et al., 1957). Luego de descorionizar
los embriones, se extrajo los discos embrionarios y se tomó microfotografías
para caracterizarlos morfológicamente en simétrico y asimétrico según criterios
de simetría, tamaño y márgenes de la célula. Posteriormente se caracterizó
morfométricamente los blastodiscos, determinando el largo y ancho de cada
blastómero, luego se determinaron las proporciones entre ancho, largo y ancho
y largo (A/A, L/L y A/L) con el programa “Q Capture Pro 5.0”.
Para los oocitos almacenados por 4 horas se registró un 56,5±4,3% de discos
fecundados y 8,7±8,8% de embriones simétricos. En ovas almacenadas por 24
h se evidenció 68,1±19,6% de fecundación y 13,0±5,7% de embriones
simétricos. Los blastodiscos registraron un diámetro promedio de
820,83±41,7 µm. En embriones de 4 células midieron en promedio
399,4±34,2 µm de largo y 421,4±47,3 µm de ancho. Las ovas almacenadas por
48, 72 y 96 horas, presentaron 0% de fertilidad.
La caracterización morfométrica entre A/A, L/L y A/L de los cuatro primeros
blastómeros mostró que las proporciones entre las medidas de anchos y largos
(A/L) (0,95±0,11 y 0,97±0,11 para ovas almacenadas por 4 y 24 horas
respectivamente), no presentaron diferencias significativas frente al valor control
1 (p<0,05). Las proporciones entre los valores de anchos (A/A) y largos (L/L)
mostraron diferencias significativas frente al valor control (p<0,05).
Palabras claves: desarrollo embrionario, clivaje, blastodisco, blastómero,
envejecimiento y simetría embrionaria.
VI
ABSTRACT
In the present study In vitro" oocytes of coho salmon (Oncorhynchus kisutch
were stored during 4, 24, 48, 72 and 96 hours at 4±0,2°C in coelomic liquid. The
oocytes were fertilized with the standard methods used for salmon. Embryos
were incubated at 4±0,2°C for 20 hours and then fixed in "Stockard" solution
(Costello et al., 1957). After retiring the chorion from embryos, embryonic discs
were removed and photomicrographs were taken to characterize the symmetric
and asymmetric morphology according to symmetry criteria, size and margins of
the cell. Subsequently, the blastodisc was characterized morphometrically by
determining the length and width of each blastomere, then the proportions of
width, length and relation width/ length (W/W, L/L and W/L) were established
with the program "Q Capture Pro 5.0 ".
Eggs stored during 4 hours showed the following results: 56,5±4,3% fertilized
and 8,7±8,8% symmetrical embryos. In eggs stored during 24 h showed
68,1±19,6 fertilization and 13,0±5,7% of symmetrical embryo. The blastodisc
recorded an average diameter of 820.83 ± 41.69 µm. 4-cell embryos presented
an average length of 399,4±34,2 µm and 421,4±47,3 µm wide. The eggs stored
for 48, 72 and 96 hours, showed 0% fertility.
Morphometric characterization between W/W, L/L and W/L of the first four
blastomeres showed that the proportions between the width and length
measurements (W/L) (0,95±0,11 and 0.97±0,11 for eggs stored for 4 and 24
hours respectively), did not show significant differences compared to the value
of 1 used as control 1 (p<0,05). The ratios between the values of width (W/W)
and length (L/L) showed significant differences compared to the control value
(p<0,05).
Keywords: embryonic development, cleavage, blastodisc, blastomere, aging and
embryonic symmetry.
VII
INTRODUCCIÓN
En Chile se destaca el importante cambio regulatorio que rige la operación de la
industria acuícola y que afecta fuertemente el nivel de riesgo sanitario en que se
desempeña. Es por esto que para prevenir futuras crisis de riesgo sanitario-
ambiental el Estado instauró una serie de normas por medio del “Reglamento
de medidas de protección, control y erradicación de enfermedades de alto
riesgo para las especies hidrobiológicas”. Entre los efectos en el área de
reproducción de especies hidrobiológicas, las normas retrasan la fecundación
de ovas por al menos 24 horas que es el tiempo que tardan los exámenes
ictiopatológicos para diagnosticar ISAv, IPNv y BKD. Este tiempo en que las
ovas deben ser almacenadas “in Vitro” en fluido celómico, producen
envejecimiento célular reflejado en una rápida disminución de la fertilidad de los
gametos o una deficiencia en la calidad de la progenie (Withler & Morley, 1968;
Billard & Gillet, 1981; Tarín et al., 2000; Bonnet et al., 2003; KjØrsvik et al.,
2003; Sohrabnezhad et al., 2006; Niksirat et al., 2007; Komrakova & Hotz,
2009). Sin embargo, ovas de trucha arcoiris se pueden mantener a 12°C en
medio artificial por 48 horas, sin pérdida significativa de fertilidad (Goetz &
Coffman, 2000; Bonnet et al., 2003).
Los blastómeros son células originadas de rápidas y numerosas divisiones
celulares del cigoto. En contraste con la mayoría de los ciclos celulares, no hay
aumento citoplasmático en las primeras segmentaciones. En consecuencia, los
blastómeros disminuyen su tamaño a medida que se duplican. En los huevos
telolecíticos de peces, el volumen del vitelo es alto y restringe al citoplasma a
una pequeña área en el polo animal. Debido a su desplazamiento periférico, los
primeros blastómeros son fácilmente visibles en los huevos de corion
transparente como en halibut del Atlántico (Hippoglossus hippoglossus) (Shields
et al., 1997), bacalao del Atlántico (Gadus morua) (Avery et al., 2009), merluza
austral (Merluccius Australis) (Bustos & Landaeta, 2005), corocoro rayao
(Haemulon bonariense) (Cuartas et al., 2003), dorada (Seriola lalandi) (Moran et
al., 2007), (Zebrasomma scopas) (Pavlov & Emel, 2008), bagre del Atlántico
1
(Anarhichas lupus L.) (Pavlov, 1992; Pavlov & Monkness, 1994) y turbot
(Scophthalmus maximus L.) (KjØrsvik et al., 2003). En halibut del Atlántico
(Hippoglossus hippoglossus) (Shields et al., 1997), bacalao del Atlántico (Gadus
morua) (Avery et al., 2009), merluza austral (Merluccius Australis) (Bustos &
Landaeta, 2005), corocoro rayao (Haemulon bonariense) (Cuartas et al., 2003),
dorada (Seriola lalandi) (Moran et al., 2007), (Zebrasomma scopas) (Pavlov &
Emel, 2008), trucha (Salmo trutta) (Killen et al., 1999) y trucha arco iris
(Oncorhynchus mykiss) (Ballard, 1973) lo «normal» es que los primeros
blastómeros sean de tamaño y forma regular (simétricos). Sin embargo, los
huevos de bagre del Atlántico (Anarhichas lupus L.), tienen blastómeros
desiguales durante las primeras divisiones (Pavlov, 1992). Han sido registrados
blastómeros desiguales en peces, en su mayoría a causa de contaminantes
(Bobe & Labbé, 2010). Estudios toxicológicos han demostrado que los huevos
con blastómeros desiguales, incluyendo embriones en etapa de blástula, no
completan la embriogénesis (Von Westernhagen, 1988). Lo que se debe a una
mala disposición de los centrómeros o un retraso en su posicionamiento en la
célula, generando asimetría en el clivaje (Rappaport, 1961). También se
encontraron diferencias significativas en mortalidades de embriones con
clivajes anormales (blastómeros desiguales) en comparación a las obtenidas
de embriones normales (blastómeros iguales) (Westernhagen, 1988),
señalando que la industria acuícola obtendría una buena herramienta de
evaluación de calidad de gametos en fases tempranas de desarrollo con la
que podría disminuir los costos de producción e instalaciones (Avery et al.,
2009). Peces teleósteos que poseen un corion transparente facilita la
investigación y seguimiento de las diferentes etapas del desarrollo embrionario
sin tener que sacrificar el embrión (Kunz, 2004). Sin embargo, en salmónidos el
corion del huevo es opaco y se debe sacrificar al embrión para realizar la
evaluación. Por esto, los estudios sobre el desarrollo embrionario en
salmónidos son escasos (Sánchez, 2010), destacando los trabajos de Shields
et al., 1997; KjØrsvik et al., 2003; Pavlov & Emel, 2008; Sánchez, 2010; entre
otros.
2
La presente investigación pretende evaluar el efecto del almacenamiento en frio
en la calidad de ovocitos de salmón coho (Oncorhynchus kisutch) almacenados
“in Vitro” por 4, 24, 48, 72 y 96 horas en fluido celómico a 4,0±0,2°C. además,
de determinar fertilidad y realizar una caracterización morfométrica de los
cuatro primeros blastómeros, lo cual servirá como herramienta de evaluación
de calidad de gametos y embriones en especies salmonídeas.
3
MATERIALES Y MÉTODOS
En el experimento se utilizó oocitos de una hembra madura de dos años de
edad de salmón Coho (Oncorhynchus kisutch), cultivada en la piscicultura Belén
del sur, ubicada en el km 22 camino Conguillío, sector la playa, comuna de
Curacautín (38°26’58’’ Latitud Sur, 71°48’33’’ Latitud Oeste), Región de la
Araucanía, Chile. Las ovas antes de ser fecundadas fueron separadas en cinco
grupos con distintos tiempos de almacenamiento a 4, 24, 48, 72 y 96 horas.
Estas se almacenaron “in Vitro” en líquido celómico a 4,0±0,2°C sin luz en una
cámara incubadora ZHICHENG modelo ZSD-A1160. Cada grupo lo formaban
tres réplicas con veintitrés oocitos cada uno, (n=69, cada grupo). Cada réplica
se fecundó con 100 µL de semen de máxima motilidad (nivel 5), según la escala
de Sánchez-Rodríguez & Billard (1967). Luego de ser fecundadas se
desarrollaron por 20 horas en la misma incubadora antes mencionada, a una
temperatura de 4±0,2°C. Posteriormente, fueron fijadas en solución de
“Stockard” (Costello et al., 1957) por una semana. Luego fueron mantenidos en
“PBS” (Buffer salino) por veinticuatro horas y se les extrajo el blastodisco
cortando el corion con micropinzas para luego fotografiar bajo una lupa
estereoscópica marca Olympus SZX7 y cámara fotográfica marca Q Imaging
MicroPublisher 3.3.
Para determinar la simetría morfológica se fijó los siguientes criterios:
1) Simetría: simetría bilateral respecto a los ejes de los cuatro blastómeros.
2) Tamaño de las células: tamaño uniforme entre los 4 blastómeros.
3) Márgenes: diferenciación clara de los márgenes entre células y con el vitelo.
Para el análisis morfométrico se tomaron sólo blastodiscos con cuatro
blastómeros, obteniendo un total de doce blastodiscos por cada hora de
almacenamiento. Estos blastodiscos se midieron con el programa “Q Capture
Pro 5.0” en ancho (A) y largo (L) de cada blastómero, donde el ancho siempre
fue medido en sentido horizontal y largo en sentido vertical, sin importar que la
4
medida del ancho fuese mayor a la del largo (figura Nº1). Para el análisis de
simetría se hizo una relación de A/A, L/L y A/L entre todos lo blastómeros de
cada blastodisco. Se utilizó como control el valor 1, siendo este el resultado
esperado para proporciones entre blastómeros simétricos.
Los resultados de la proporción fueron analizados con el programa estadístico
GraphPad Prisma® versión 5.0 (GraphPad Software, San Diego CA). Se utilizó
una ANOVA de una vía para muestras no paramétricas. Además, se realizó en
paralelo el test de comparaciones múltiples Dunnett's para evaluar las
diferencias estadísticamente significativas entre proporciones de largos, anchos
y anchos y largos de los blastodiscos con el grupo control. El nivel de
significancia se fijó en p< 0,05 (n=69).
Figura Nº 1. Criterio utilizado para caracterización morfométrica de los primeros
cuatro blastómeros de salmón coho (Oncorhynchus kisutch), donde “L” indica
el largo y ”A” el ancho.
5
RESULTADOS
Los blastodiscos de salmón coho (Oncorhynchus kisutch), incubados a
4,0±0,2°C por 20 horas tuvieron un diámetro promedio de 820,83 ± 41,69 µm
(figura Nº2. A). Se observó blastodiscos con 2, 4, y 8 blastómeros (figura Nº2.
B, C y D respectivamente). Se registró un 56,5±4,3% de discos fecundados y
8,7±8,8% de embriones simétricos para las ovas almacenadas por 4 horas. En
ovas almacenadas por 24 h se evidenció 68,1±19,6% de fecundación y
13,0±5,7% de embriones simétricos (figura Nº3). Las ovas almacenadas por 48,
72 y 96 horas presentaron 0% de fertilidad (figura Nº3), mostrando blastodiscos
difusos y planos (figura Nº4. A, B, C). Además, se observaron embriones con
número impar de blastómeros (figura Nº5. A), blastómeros no definidos (figura
Nº5. B), células aplanadas (figura Nº5. C), distribución espacial desorganizada
(figura Nº5. D), embriones asimétricos (figura Nº5. E, F, G).
Figura N° 2. Blastodiscos de salmón coho (Oncorhynchus kisutch), obtenidos de
ovas almacenadas por 4h a 4,0±0,2°C. No fecundado (A), simétrico con un
clivaje (B), simétricos con dos clivajes (C), simétrico con tres clivajes (D) (barra
horizontal 300 µm, aumento de 56X).
El porcentaje de ovas almacenadas por 4 y 24 horas que presentaron
embriones con 4 blastómeros fueron 18,8% y 20,3%, respectivamente. Estos
blastómeros midieron en promedio 399,4 ± 34,2 µm de largo y 421,4 ± 47,3
µm de ancho (Tabla 1).
6
Figura N° 3. Porcentaje de fecundación y porcentaje de embriones
morfológicamente simétricos (promedio ± Desviación estándar) de salmón coho
(Oncorhynchus kitsuch), obtenidos de ovas almacenadas desde 4 a 96 horas,
con 20 horas de incubación a 4,0±0,2°C. ab Letras iguales indican que no hay
diferencias estadísticamente significativas. (p>0,005; n=69).
Figura N° 4. Blastodiscos no fecundados de salmón coho (Oncorhynchus
kisutch), obtenidos de ovas almacenadas a 4,0±0,2°C. Por 48 h (A), 72 h (B) y
96 (C) horas (barra horizontal 300 µm, aumento de 56X).
La proporción entre las medidas de los largos de los cuatro blastómeros para
ovas almacenadas por 4 horas fue 0,89 ± 0,06 con un mínimo de 0,775 y
máximo de 0,965. Para ovas almacenadas por 24 horas la proporción entre las
7
Figura N° 5. Anormalidades en blastodiscos embrionarios de salmón coho
(Oncorhynchus kisutch). Número impar de blastómeros (A), blastómeros no
definidos (B), células aplanadas (C), distribución espacial desorganizada (D),
embriones asimétricos (E, F, G) (Barra horizontal 300 µm, aumento de 56X).
Tabla N° 1. Largo y ancho de los primeros cuatro blastómeros de salmón coho
(Oncorhynchus kisutch) (promedio ± desviación estándar).
Horas de al- macenamiento
(nº réplicas)
Blastómero 1 Blastómero 2
Largo (μm) Ancho (μm) Largo (μm) Ancho (μm)
4 (3) 400,0 ± 44,2 444,5 ± 116,6 386,6 ± 59,3 394,9 ± 100
24 (3) 403,5 ± 66,9 436,4 ± 93,4 412,4 ± 50,3 394,4± 52,0
Horas de al-macenamiento
(nº réplicas)
Blastómero 3 Blastómero 4
Largo (μm) Ancho (μm) Largo (μm) Ancho (μm)
4 (3) 406,2 ± 57,3 418,0 ± 75,7 391,0 ± 66,3 405,3 ± 58,1
24 (3) 382,9 ± 50,6 417,1 ± 62,1 402,1 ± 45,4 429,3 ± 68,2
8
medidas de los largos de los cuatro blastómeros fue 0,88 ± 0,07 con un mínimo
de 0,751 y máximo de 0,955. La proporción entre los valores de los anchos de
los cuatro blastómeros para ovas almacenadas por 4 horas fue de 0,84 ± 0,09
con un mínimo de 0,708 y máximo de 0,960. Para ovas almacenadas por 24
horas, la proporción entre las medidas de los anchos de los cuatro blastómeros
fue 0,85 ± 0,08 con un mínimo de 0,730 y máximo de 0,958. La proporción entre
los valores de los anchos y los largos de los cuatro blastómeros para ovas
almacenadas por 4 horas fue de 0,95 ± 0,11 encontrándose un valor mínimo de
0,742 y máximo de 1,156. Para ovas almacenadas por 24 horas la proporción
entre las medidas de los anchos y los largos fue 0,97 ± 0,11 con un mínimo de
0,771 y máximo de 1,220, (Figura Nº6) (Tabla N°2). Se registró menor
variabilidad entre las proporciones A/L de ovas almacenadas por 4 y 24 horas.
Tabla N° 2. Proporción entre largos, anchos y anchos y largos de los cuatro
primeros blastómeros en salmón coho (Oncorhynchus kisutch) (n=12
blastodiscos por hora de almacenamiento).
Horas de almacenamiento
(nº réplicas)
Proporción
L / L A / A A / L
4 (3) 0,890 ± 0,06 0,837 ± 0,09 0,947 ± 0,11
24 (3) 0,880 ± 0,07 0,845 ± 0,08 0,966 ± 0,11
Los valores de las proporciones entre largos mostraron un 50 porciento de
embriones significativamente distintos de 1 (p<0,05), para ovas almacenadas
por 4 y 24 h (Figura Nº6. A). Un 75 y 61 % de embriones mostraron diferencias
estadísticamente significativas frente al valor control (p<0,05), para las
proporciones entre los valores de los anchos de ovas almacenadas por 4 y 24
horas, respectivamente (Figura Nº6. B). Mientras que los valores de las
proporciones entre anchos y largos mostraron un 1% de embriones
significativamente distintos de 1 (p<0,05), para ovas almacenadas por 4 y 24 h
(figura Nº6. C).
9
Figura N° 6. Disperción de las proporciones entre largos (a), anchos (b) y
entre anchos y largos (c) de los primeros blastómeros de salmón coho
(Oncorhynchus kisutch). Donde valores menores a 0,9 y mayores a 1,1 son
significativamente distintos de 1 (p<0,05; n = 69 ), la línea roja indica el límite de
simetría entre las proporciones.
10
DISCUSIÓN
El diámetro medio de los blastodiscos de Oncorhynchus kisutch fue de 820,83 ±
41,69 µm, similar a lo encontrado por Ballard, (1973) con aproximadamente
1000 µm. en Onchorynchus mykiss y 880 µm en Salvelinus fontinalis y en
Salmo salar 950 µm. Gorolidov, (1983).
La figura Nº3 muestra que las ovas almacenadas por 24 horas presentan una
mayor tasa de fertiidad en comparación con las ovas almacenas por 4 horas.
También, se evidencia el gran deterioro que sufrieron ovas almacenadas por
más tiempo (48, 72 y 96 horas) mostrando 0% de oocitos fecundados, muy
distinto a lo descrito por otros autores, donde fue posible mantener ovas viables
por prolongados tiempos de almacenamiento “in Vitro” (Tabla N°3). Jensen &
Alderdice, (1984), demostraron que ovas de Oncorhynchus keta, aumentan el
periodo que pueden ser almacenadas “in Vitro” con temperaturas relativamente
bajas (Tabla N°3), donde en condiciones de almacenamiento similares a las de
esta investigación, a 3º C consiguieron mantener ovas 233 horas con un 50%
de fertilidad, superior a lo observado en este estudio. El corto tiempo que se
pudo almacenar oocitos de Oncorhynchus kisutch con alta fertilidad, tiene
relación con al envejecimiento de los gametos previo al desove, ya que antes
de desovar la hembra no se tuvo certeza del momento justo de la ovulación. Sin
embargo, esta se puede aproximar usando la grafica de Gordon et al., 1987,
donde señala que oocitos de Oncorhynchus mykiss obtienen mejor porcentaje
de fertilidad 4 días post ovulación (>80 en el día 1 y 100% cercano al día 4), de
este modo se puede determinar que la hembra utilizada estaba ovulada algunos
días antes de ser desovada, considerando que nuestros porcentajes de
fertilidad fueron relativamente bajos. Además, se debe mencionar que oocitos
almacenados por largos periodos fuera de la cavidad celómica de la hembra,
generalmente muestran signos parecidos a la de oocitos sobre maduros como:
mayor turgencia, aparición de pigmentos, mayor diámetro, etc. (Kjorsvik et al.,
1990; Niksirat et al., 2006), y por consiguiente la viabilidad de la ova es más
baja en cuanto aparecen estos signos (Kjorsvik et al., 1990). Los bajos
11
porcentajes y posterior caída de fertilidad sobre 48 horas de almacenamiento
son debido a que la hembra llevaba más de 4 días ovulada, por lo que habían
muchos oocitos sobremaduros, que no fueron fecundados.
Tabla N° 3. Tiempo de almacenamiento (horas) y porcentaje de fertilidad en
distintas temperaturas y en diferentes especies de salmónidos.
Especie Temperatura
(ºC) Almacenamiento
(horas) Fertilidad
(%) Autor
Ocorhynchus kisutch
4 48 68,10% Fuentes et al.,
2011
Oncorhynchus keta
3 233,2 50% Jensen & Alderdice.,
1984
Oncorhynchus keta
6 152,6 50% Jensen & Alderdice.,
1984
Oncorhynchus keta
9 99,9 50% Jensen & Alderdice.,
1984
Oncorhynchus keta
12 65,4 50% Jensen & Alderdice.,
1984
Oncorhynchus keta
15 42,8 50% Jensen & Alderdice.,
1984
Oncorhynchus mykiss
12 - 13 48 60% Goetz & Coffman,
2000
Oncorhynchus mykiss
2 - 3 216 77,50% Niksirat et al., 2007
Salmo trutta 4 72 61 - 90
% Billard et al., 1981
Salmo trutta caspius
2 - 3 48 91% Niksirat et al., 2006
Al comparar la proporción entre los largos y los anchos de los 4 primeros
blastómeros para ovas almacenadas por 4 y 24 horas con el valor control “1”
revela una evidente asimetría siendo, todos los valores significativamente
distintos de 1 (< 0,9 y >1,1 son significativamente distintos de 1 (p<0,05) (Tabla
2). La proporción entre el ancho y el largo de los 4 blastómeros para ovas
almacenadas por 4 y 24 horas fue de 0,947 ± 0,11 y 0,966 ± 0,11
respectivamente, donde se puede inferir la obtención de ocho blastómeros
simétricos en un tercer clivaje. Pavlov & Emel 2008 caracterizan la simetría del
primer clivaje en Z. scopas, identificando algunos embriones asimétricos;
12
desincronización del clivaje, “sincitio” y otras aberraciones en el desarrollo
atribuidas a la sobremadurez de huevos. Avery & Brown 2005 y Avery et al.
2009 mencionan una evaluación de calidad de gametos basada en simetría
de los blastómeros realizada solo hasta las 16 células, puesto que después
son demasiadas divisiones y es poco clara la evaluación, mencionando
patrones de anomalía como; marginal, “donut”, triple y tarta, dándose algunos
casos donde el patrón de asimetría es combinado. Proponiendo utilizar los
patrones de segmentación temprana con una buena simetría de los
blastómeros de 8-32 células como herramienta de control de calidad de
gametos correlacionándose con el éxito de incubación, tasa de eclosión,
sobrevivencia de las larvas (Pavlov & Monkness 1994; Shields et al.,
1997KjØrsvik et al., 2003; Avery & Brown 2005; Pavlov & Emel 2008; Avery et
al., 2009). Generalmente las aberraciones, adoptan la forma de las
interacciones espaciales irregulares (asimetría) o anomalías del clivaje:
tamaños desiguales de las células, márgenes de las células incompletas o
incorrecto número de células, (Shields et al, 1997). Blastómeros anormales de
peces han sido registrados en una serie de estudios, en su mayoría sobre los
efectos de los contaminantes en el desarrollo del óvulo, en términos generales
conciernen a la sensibilidad de las ovas a las variables medioambientales
(físicos y químicos) o estudios de "calidad de los ovas".
Se establece que la calidad de gametos puede verse influenciada por la
nutrición de los reproductores, ambiente, manejos y otros (KjØrsvik et al., 1990
& KjØrsvik et al., 2003). Las divisiones celulares anormales en la embriogénesis
temprana se cree que está relacionado con un deterioro del huevo (Kjørsvik et
al, 1990, 2003; Shields et al, 1997). También puede ser que el líquido celómico
influye en la fertilidad de los huevos y esto varía según los reproductores (Goetz
& Coffman, 2000).
Shield et al., 1997, sostienen que en la división celular la evaluación de las
primeras fases del desarrollo es el único indicador fiable de la calidad de los
huevos para el “halibut”. Sin embargo, esto no debería proporcionar una
13
evaluación definitiva, por lo que debe ser acompañado por otros indicadores de
viabilidad. Además, la mayoría de la mortalidad de huevos anormales ocurre
durante el primer tercio de la embriogénesis, lo que sugiere que algunos huevos
pueden someterse a la corrección de la simetría celular durante divisiones
posteriores (Von Westernhagen, 1988). Los resultados actuales muestran que
para Oncorhynchus kisutch la simetría de los blastómeros es un indicador
confiable de viabilidad como ya se sugirió antes, en especial cuando se
considera como el único criterio. La evaluación de simetría y su relación con la
calidad de huevos, son desarrolladas con éxito en peces de aguas marinas,
por esto, es necesario llevar a cabo investigaciones que correlacionen
simetría de blastómeros con sobrevivencia embrionaria y larval (Sánchez,
2010).
Para una mejor evaluación de la simetría de los primeros blastómeros y su
relación con la calidad de gametos, se recomienda llevar a cabo un estudio
posterior donde se incluya un mayor número de hembras, se aumente la
frecuencia de palpajes y así se podrá conocer con mayor certeza el momento
de la ovulación. Además prolongar los periodos de almacenamiento con
evaluación entre intervalos de menor tiempo (desde 12 horas, hasta 48 horas),
correlacionar la simetría de los blastómeros con la sobrevivencia que se
obtenga al cultivar los alevines obtenidos de gametos de las mismas hembras
sometidos a las mismas condiciones de almacenamiento e incubación.
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