“EFECTO DEL ALMACENAMIENTO DE OOCITOS EN SU FERTILIDAD Y SIMETRÍA DE LOS PRIMEROS BLASTÓMEROS DE SALMÓN COHO (Oncorhynchus kisutch)”

UNIVERSIDAD CATÓLICA DE TEMUCO

FACULTAD DE RECURSOS NATURALES

ESCUELA DE ACUICULTURA

“EFECTO DEL ALMACENAMIENTO DE OOCITOS EN SU FERTILIDAD Y

SIMETRÍA DE LOS PRIMEROS BLASTÓMEROS DE SALMÓN COHO

(Oncorhynchus kisutch)”

Trabajo de titulación presentado como

parte de los requisitos para optar al grado

de Licenciado en Ciencias de la Acuicultura.

CÉSAR FUENTES GAMBOA

CLAUDIA GONZÁLEZ WEBER

CARLOS ROLDÁN MILLAHUAL

TEMUCO–CHILE

2011

I

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a Dios por demostrarme con experiencias cuán importante es la familia en la

Agradezco a Dios por demostrarme con experiencias cuán importante es la

familia en la vida. A mis padres, que me entregaron las bases para llevar esta

vida a gusto y feliz. A mi madre por su infinito amor, el pilar de mi vida, mi

todo, la que con su esfuerzo y entrega me enseñó que frente al más gran

dilema se puede salir adelante. A ti papá que ves todo lo que hago desde un

plano celestial, desde pequeña me enseñaste a entregar amor y disfrutar

cada momento como si fuese el último. A mis hermanos de la vida por tantos

momentos compartidos que espero jamás culminen. A mi abuela, tíos, primos

y amigos que le dan alegría a mis días.

A todos ustedes un abrazo y gracias por apoyarme en el término de etapa.

Claudia González Weber.

Este trabajo está dedicado a mis padres, a quienes le agradezco de todo

corazón por su amor, apoyo, cariñó y comprensión. En todo momento los llevo

conmigo. Agradezco a mis hermanas y a mi abuela por la compañía y el

apoyo que me brindan. Sé que cuento con ellas siempre.

Agradezco a Dios por llenar mi vida de dicha y bendiciones. Por haber

encontrado el amor, y junto a ello un hermoso bebe que viene en camino.

Agradezco a los amigos por su confianza y lealtad. Agradezco a mis

profesores por su disposición y ayuda brindadas.

Carlos Roldán Millahual

En esta etapa final quisiera agradecer a Dios porque en su gran inmensidad

que me permitió culminar esta hermosa etapa.

Agradezco a mi familia por la confianza entregada, amor, compañía y ayuda

en todo momento para cumplir uno de mis objetivos en la vida.

Quiero dedicar este trabajo a Dios por estar conmigo cada día y a mi hija por

ser lo más preciado en mi vida. A todas las personas que me han apoyado y

creyeron en mí. De forma muy especial a mi madre y mi padre, a mi hermano

Gabriel y a todos mis familiares y seres queridos que han estado conmigo.

César Fuentes Gamboa.

II

ÍNDICE DE CONTENIDOS

Introducción…………………………………………………………….……………..1

Materiales y métodos…………………………………………………………….…..4

Resultados…………………………………………………………………………….6

Discusión………………………………………………………………………….…11

Bibliografía…………………………………………………………………………..15

III

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura N°1. Criterio utilizado para caracterización morfométrica de los primeros

cuatro blastómeros de salmón coho (Oncorhynchus kisutch), donde “L” indica

el largo y ”A” el ancho………………………………………………………………….5

Figura N°2. Blastodiscos de salmón coho (Oncorhynchus kisutch), obtenidos de

ovas almacenadas por 4h a 4±0,2°C. No fecundado (A), simétrico con un clivaje

(B), simétricos con dos clivajes (C), simétrico con tres clivajes (D) (barra

horizontal 300 µm, aumento de 56X)……………….……………………….……….6

Figura Nº3. Porcentaje de fecundación y porcentaje de embriones

morfológicamente simétricos (promedio ± desviación estándar) de salmón coho

(Oncorhynchus kitsuch), obtenidos de ovas almacenadas desde 4 a 96 horas,

con 20 horas de incubación a 4±0,2°C …………………………………….………..6

Figura Nº 4. Blastodiscos no fecundados de salmón coho (Oncorhynchus

kisutch), obtenidos de ovas almacenadas a 4±0,2°C. Por 48 h (A), 72 h (B) y

96 (C) horas (barra horizontal 300 µm, aumento de

56X)………………………………………………………………………………….…..7

Figura Nº5. Anormalidades en blastodiscos embrionarios de salmón coho

(Oncorhynchus kisutch). Número impar de blastómeros (A), blastómeros no

definidos (B), células aplanadas (C), distribución espacial desorganizada (D),

embriones asimétricos (E, F, G) (Barra horizontal 300 µm, aumento de

56X)…………………………………….………………………………………….…….7

Figura Nº6. Disperción de las proporciones entre largos (a), anchos (b) y

entre anchos y largos (c) de los primeros blastómeros de salmón coho

(Oncorhynchus kisutch). Donde valores menores a 0,9 y mayores a 1,1 son

significativamente distintos de 1 (p<0,05) la línea roja indica el límite de simetría

entre las proporciones…...…………………………………………………………..10

IV

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla Nº1. Largo y ancho de los primeros cuatro blastómeros de salmón coho

(Oncorhynchus kisutch) (promedio ± desviación estándar)…………………..…...8

Tabla 2. Proporción entre largos, anchos y anchos y largos de los cuatro

primeros blastómeros en salmón coho (Oncorhynchus kisutch) (n=12

blastodiscos por hora de almacenamiento)…………………………………………9

Tabla 3. Tiempo de almacenamiento (horas) y porcentaje de fertilidad para

distintas temperaturas y en diferentes especies de

salmónidos.……………………………………………………………………………12

V

RESUMEN

En la presente investigación se almacenaron “In vitro” oocitos de salmón coho

(Oncorhynchus kisutch) por 4, 24, 48, 72 y 96 horas a 4±0,2°C en líquido

celómico. Para luego ser fecundados con métodos estándares para

salmonicultura. Se incubó embriones a 4±0,2°C por 20 horas y posteriormente

se fijó en solución de “Stockard” (Costello et al., 1957). Luego de descorionizar

los embriones, se extrajo los discos embrionarios y se tomó microfotografías

para caracterizarlos morfológicamente en simétrico y asimétrico según criterios

de simetría, tamaño y márgenes de la célula. Posteriormente se caracterizó

morfométricamente los blastodiscos, determinando el largo y ancho de cada

blastómero, luego se determinaron las proporciones entre ancho, largo y ancho

y largo (A/A, L/L y A/L) con el programa “Q Capture Pro 5.0”.

Para los oocitos almacenados por 4 horas se registró un 56,5±4,3% de discos

fecundados y 8,7±8,8% de embriones simétricos. En ovas almacenadas por 24

h se evidenció 68,1±19,6% de fecundación y 13,0±5,7% de embriones

simétricos. Los blastodiscos registraron un diámetro promedio de

820,83±41,7 µm. En embriones de 4 células midieron en promedio

399,4±34,2 µm de largo y 421,4±47,3 µm de ancho. Las ovas almacenadas por

48, 72 y 96 horas, presentaron 0% de fertilidad.

La caracterización morfométrica entre A/A, L/L y A/L de los cuatro primeros

blastómeros mostró que las proporciones entre las medidas de anchos y largos

(A/L) (0,95±0,11 y 0,97±0,11 para ovas almacenadas por 4 y 24 horas

respectivamente), no presentaron diferencias significativas frente al valor control

1 (p<0,05). Las proporciones entre los valores de anchos (A/A) y largos (L/L)

mostraron diferencias significativas frente al valor control (p<0,05).

Palabras claves: desarrollo embrionario, clivaje, blastodisco, blastómero,

envejecimiento y simetría embrionaria.

VI

ABSTRACT

In the present study In vitro" oocytes of coho salmon (Oncorhynchus kisutch

were stored during 4, 24, 48, 72 and 96 hours at 4±0,2°C in coelomic liquid. The

oocytes were fertilized with the standard methods used for salmon. Embryos

were incubated at 4±0,2°C for 20 hours and then fixed in "Stockard" solution

(Costello et al., 1957). After retiring the chorion from embryos, embryonic discs

were removed and photomicrographs were taken to characterize the symmetric

and asymmetric morphology according to symmetry criteria, size and margins of

the cell. Subsequently, the blastodisc was characterized morphometrically by

determining the length and width of each blastomere, then the proportions of

width, length and relation width/ length (W/W, L/L and W/L) were established

with the program "Q Capture Pro 5.0 ".

Eggs stored during 4 hours showed the following results: 56,5±4,3% fertilized

and 8,7±8,8% symmetrical embryos. In eggs stored during 24 h showed

68,1±19,6 fertilization and 13,0±5,7% of symmetrical embryo. The blastodisc

recorded an average diameter of 820.83 ± 41.69 µm. 4-cell embryos presented

an average length of 399,4±34,2 µm and 421,4±47,3 µm wide. The eggs stored

for 48, 72 and 96 hours, showed 0% fertility.

Morphometric characterization between W/W, L/L and W/L of the first four

blastomeres showed that the proportions between the width and length

measurements (W/L) (0,95±0,11 and 0.97±0,11 for eggs stored for 4 and 24

hours respectively), did not show significant differences compared to the value

of 1 used as control 1 (p<0,05). The ratios between the values of width (W/W)

and length (L/L) showed significant differences compared to the control value

(p<0,05).

Keywords: embryonic development, cleavage, blastodisc, blastomere, aging and

embryonic symmetry.

VII

INTRODUCCIÓN

En Chile se destaca el importante cambio regulatorio que rige la operación de la

industria acuícola y que afecta fuertemente el nivel de riesgo sanitario en que se

desempeña. Es por esto que para prevenir futuras crisis de riesgo sanitario-

ambiental el Estado instauró una serie de normas por medio del “Reglamento

de medidas de protección, control y erradicación de enfermedades de alto

riesgo para las especies hidrobiológicas”. Entre los efectos en el área de

reproducción de especies hidrobiológicas, las normas retrasan la fecundación

de ovas por al menos 24 horas que es el tiempo que tardan los exámenes

ictiopatológicos para diagnosticar ISAv, IPNv y BKD. Este tiempo en que las

ovas deben ser almacenadas “in Vitro” en fluido celómico, producen

envejecimiento célular reflejado en una rápida disminución de la fertilidad de los

gametos o una deficiencia en la calidad de la progenie (Withler & Morley, 1968;

Billard & Gillet, 1981; Tarín et al., 2000; Bonnet et al., 2003; KjØrsvik et al.,

2003; Sohrabnezhad et al., 2006; Niksirat et al., 2007; Komrakova & Hotz,

2009). Sin embargo, ovas de trucha arcoiris se pueden mantener a 12°C en

medio artificial por 48 horas, sin pérdida significativa de fertilidad (Goetz &

Coffman, 2000; Bonnet et al., 2003).

Los blastómeros son células originadas de rápidas y numerosas divisiones

celulares del cigoto. En contraste con la mayoría de los ciclos celulares, no hay

aumento citoplasmático en las primeras segmentaciones. En consecuencia, los

blastómeros disminuyen su tamaño a medida que se duplican. En los huevos

telolecíticos de peces, el volumen del vitelo es alto y restringe al citoplasma a

una pequeña área en el polo animal. Debido a su desplazamiento periférico, los

primeros blastómeros son fácilmente visibles en los huevos de corion

transparente como en halibut del Atlántico (Hippoglossus hippoglossus) (Shields

et al., 1997), bacalao del Atlántico (Gadus morua) (Avery et al., 2009), merluza

austral (Merluccius Australis) (Bustos & Landaeta, 2005), corocoro rayao

(Haemulon bonariense) (Cuartas et al., 2003), dorada (Seriola lalandi) (Moran et

al., 2007), (Zebrasomma scopas) (Pavlov & Emel, 2008), bagre del Atlántico

1

(Anarhichas lupus L.) (Pavlov, 1992; Pavlov & Monkness, 1994) y turbot

(Scophthalmus maximus L.) (KjØrsvik et al., 2003). En halibut del Atlántico

(Hippoglossus hippoglossus) (Shields et al., 1997), bacalao del Atlántico (Gadus

morua) (Avery et al., 2009), merluza austral (Merluccius Australis) (Bustos &

Landaeta, 2005), corocoro rayao (Haemulon bonariense) (Cuartas et al., 2003),

dorada (Seriola lalandi) (Moran et al., 2007), (Zebrasomma scopas) (Pavlov &

Emel, 2008), trucha (Salmo trutta) (Killen et al., 1999) y trucha arco iris

(Oncorhynchus mykiss) (Ballard, 1973) lo «normal» es que los primeros

blastómeros sean de tamaño y forma regular (simétricos). Sin embargo, los

huevos de bagre del Atlántico (Anarhichas lupus L.), tienen blastómeros

desiguales durante las primeras divisiones (Pavlov, 1992). Han sido registrados

blastómeros desiguales en peces, en su mayoría a causa de contaminantes

(Bobe & Labbé, 2010). Estudios toxicológicos han demostrado que los huevos

con blastómeros desiguales, incluyendo embriones en etapa de blástula, no

completan la embriogénesis (Von Westernhagen, 1988). Lo que se debe a una

mala disposición de los centrómeros o un retraso en su posicionamiento en la

célula, generando asimetría en el clivaje (Rappaport, 1961). También se

encontraron diferencias significativas en mortalidades de embriones con

clivajes anormales (blastómeros desiguales) en comparación a las obtenidas

de embriones normales (blastómeros iguales) (Westernhagen, 1988),

señalando que la industria acuícola obtendría una buena herramienta de

evaluación de calidad de gametos en fases tempranas de desarrollo con la

que podría disminuir los costos de producción e instalaciones (Avery et al.,

2009). Peces teleósteos que poseen un corion transparente facilita la

investigación y seguimiento de las diferentes etapas del desarrollo embrionario

sin tener que sacrificar el embrión (Kunz, 2004). Sin embargo, en salmónidos el

corion del huevo es opaco y se debe sacrificar al embrión para realizar la

evaluación. Por esto, los estudios sobre el desarrollo embrionario en

salmónidos son escasos (Sánchez, 2010), destacando los trabajos de Shields

et al., 1997; KjØrsvik et al., 2003; Pavlov & Emel, 2008; Sánchez, 2010; entre

otros.

2

La presente investigación pretende evaluar el efecto del almacenamiento en frio

en la calidad de ovocitos de salmón coho (Oncorhynchus kisutch) almacenados

“in Vitro” por 4, 24, 48, 72 y 96 horas en fluido celómico a 4,0±0,2°C. además,

de determinar fertilidad y realizar una caracterización morfométrica de los

cuatro primeros blastómeros, lo cual servirá como herramienta de evaluación

de calidad de gametos y embriones en especies salmonídeas.

3

MATERIALES Y MÉTODOS

En el experimento se utilizó oocitos de una hembra madura de dos años de

edad de salmón Coho (Oncorhynchus kisutch), cultivada en la piscicultura Belén

del sur, ubicada en el km 22 camino Conguillío, sector la playa, comuna de

Curacautín (38°26’58’’ Latitud Sur, 71°48’33’’ Latitud Oeste), Región de la

Araucanía, Chile. Las ovas antes de ser fecundadas fueron separadas en cinco

grupos con distintos tiempos de almacenamiento a 4, 24, 48, 72 y 96 horas.

Estas se almacenaron “in Vitro” en líquido celómico a 4,0±0,2°C sin luz en una

cámara incubadora ZHICHENG modelo ZSD-A1160. Cada grupo lo formaban

tres réplicas con veintitrés oocitos cada uno, (n=69, cada grupo). Cada réplica

se fecundó con 100 µL de semen de máxima motilidad (nivel 5), según la escala

de Sánchez-Rodríguez & Billard (1967). Luego de ser fecundadas se

desarrollaron por 20 horas en la misma incubadora antes mencionada, a una

temperatura de 4±0,2°C. Posteriormente, fueron fijadas en solución de

“Stockard” (Costello et al., 1957) por una semana. Luego fueron mantenidos en

“PBS” (Buffer salino) por veinticuatro horas y se les extrajo el blastodisco

cortando el corion con micropinzas para luego fotografiar bajo una lupa

estereoscópica marca Olympus SZX7 y cámara fotográfica marca Q Imaging

MicroPublisher 3.3.

Para determinar la simetría morfológica se fijó los siguientes criterios:

1) Simetría: simetría bilateral respecto a los ejes de los cuatro blastómeros.

2) Tamaño de las células: tamaño uniforme entre los 4 blastómeros.

3) Márgenes: diferenciación clara de los márgenes entre células y con el vitelo.

Para el análisis morfométrico se tomaron sólo blastodiscos con cuatro

blastómeros, obteniendo un total de doce blastodiscos por cada hora de

almacenamiento. Estos blastodiscos se midieron con el programa “Q Capture

Pro 5.0” en ancho (A) y largo (L) de cada blastómero, donde el ancho siempre

fue medido en sentido horizontal y largo en sentido vertical, sin importar que la

4

medida del ancho fuese mayor a la del largo (figura Nº1). Para el análisis de

simetría se hizo una relación de A/A, L/L y A/L entre todos lo blastómeros de

cada blastodisco. Se utilizó como control el valor 1, siendo este el resultado

esperado para proporciones entre blastómeros simétricos.

Los resultados de la proporción fueron analizados con el programa estadístico

GraphPad Prisma® versión 5.0 (GraphPad Software, San Diego CA). Se utilizó

una ANOVA de una vía para muestras no paramétricas. Además, se realizó en

paralelo el test de comparaciones múltiples Dunnett's para evaluar las

diferencias estadísticamente significativas entre proporciones de largos, anchos

y anchos y largos de los blastodiscos con el grupo control. El nivel de

significancia se fijó en p< 0,05 (n=69).

Figura Nº 1. Criterio utilizado para caracterización morfométrica de los primeros

cuatro blastómeros de salmón coho (Oncorhynchus kisutch), donde “L” indica

el largo y ”A” el ancho.

5

RESULTADOS

Los blastodiscos de salmón coho (Oncorhynchus kisutch), incubados a

4,0±0,2°C por 20 horas tuvieron un diámetro promedio de 820,83 ± 41,69 µm

(figura Nº2. A). Se observó blastodiscos con 2, 4, y 8 blastómeros (figura Nº2.

B, C y D respectivamente). Se registró un 56,5±4,3% de discos fecundados y

8,7±8,8% de embriones simétricos para las ovas almacenadas por 4 horas. En

ovas almacenadas por 24 h se evidenció 68,1±19,6% de fecundación y

13,0±5,7% de embriones simétricos (figura Nº3). Las ovas almacenadas por 48,

72 y 96 horas presentaron 0% de fertilidad (figura Nº3), mostrando blastodiscos

difusos y planos (figura Nº4. A, B, C). Además, se observaron embriones con

número impar de blastómeros (figura Nº5. A), blastómeros no definidos (figura

Nº5. B), células aplanadas (figura Nº5. C), distribución espacial desorganizada

(figura Nº5. D), embriones asimétricos (figura Nº5. E, F, G).

Figura N° 2. Blastodiscos de salmón coho (Oncorhynchus kisutch), obtenidos de

ovas almacenadas por 4h a 4,0±0,2°C. No fecundado (A), simétrico con un

clivaje (B), simétricos con dos clivajes (C), simétrico con tres clivajes (D) (barra

horizontal 300 µm, aumento de 56X).

El porcentaje de ovas almacenadas por 4 y 24 horas que presentaron

embriones con 4 blastómeros fueron 18,8% y 20,3%, respectivamente. Estos

blastómeros midieron en promedio 399,4 ± 34,2 µm de largo y 421,4 ± 47,3

µm de ancho (Tabla 1).

6

Figura N° 3. Porcentaje de fecundación y porcentaje de embriones

morfológicamente simétricos (promedio ± Desviación estándar) de salmón coho

(Oncorhynchus kitsuch), obtenidos de ovas almacenadas desde 4 a 96 horas,

con 20 horas de incubación a 4,0±0,2°C. ab Letras iguales indican que no hay

diferencias estadísticamente significativas. (p>0,005; n=69).

Figura N° 4. Blastodiscos no fecundados de salmón coho (Oncorhynchus

kisutch), obtenidos de ovas almacenadas a 4,0±0,2°C. Por 48 h (A), 72 h (B) y

96 (C) horas (barra horizontal 300 µm, aumento de 56X).

La proporción entre las medidas de los largos de los cuatro blastómeros para

ovas almacenadas por 4 horas fue 0,89 ± 0,06 con un mínimo de 0,775 y

máximo de 0,965. Para ovas almacenadas por 24 horas la proporción entre las

7

Figura N° 5. Anormalidades en blastodiscos embrionarios de salmón coho

(Oncorhynchus kisutch). Número impar de blastómeros (A), blastómeros no

definidos (B), células aplanadas (C), distribución espacial desorganizada (D),

embriones asimétricos (E, F, G) (Barra horizontal 300 µm, aumento de 56X).

Tabla N° 1. Largo y ancho de los primeros cuatro blastómeros de salmón coho

(Oncorhynchus kisutch) (promedio ± desviación estándar).

Horas de al- macenamiento

(nº réplicas)

Blastómero 1 Blastómero 2

Largo (μm) Ancho (μm) Largo (μm) Ancho (μm)

4 (3) 400,0 ± 44,2 444,5 ± 116,6 386,6 ± 59,3 394,9 ± 100

24 (3) 403,5 ± 66,9 436,4 ± 93,4 412,4 ± 50,3 394,4± 52,0

Horas de al-macenamiento

(nº réplicas)

Blastómero 3 Blastómero 4

Largo (μm) Ancho (μm) Largo (μm) Ancho (μm)

4 (3) 406,2 ± 57,3 418,0 ± 75,7 391,0 ± 66,3 405,3 ± 58,1

24 (3) 382,9 ± 50,6 417,1 ± 62,1 402,1 ± 45,4 429,3 ± 68,2

8

medidas de los largos de los cuatro blastómeros fue 0,88 ± 0,07 con un mínimo

de 0,751 y máximo de 0,955. La proporción entre los valores de los anchos de

los cuatro blastómeros para ovas almacenadas por 4 horas fue de 0,84 ± 0,09

con un mínimo de 0,708 y máximo de 0,960. Para ovas almacenadas por 24

horas, la proporción entre las medidas de los anchos de los cuatro blastómeros

fue 0,85 ± 0,08 con un mínimo de 0,730 y máximo de 0,958. La proporción entre

los valores de los anchos y los largos de los cuatro blastómeros para ovas

almacenadas por 4 horas fue de 0,95 ± 0,11 encontrándose un valor mínimo de

0,742 y máximo de 1,156. Para ovas almacenadas por 24 horas la proporción

entre las medidas de los anchos y los largos fue 0,97 ± 0,11 con un mínimo de

0,771 y máximo de 1,220, (Figura Nº6) (Tabla N°2). Se registró menor

variabilidad entre las proporciones A/L de ovas almacenadas por 4 y 24 horas.

Tabla N° 2. Proporción entre largos, anchos y anchos y largos de los cuatro

primeros blastómeros en salmón coho (Oncorhynchus kisutch) (n=12

blastodiscos por hora de almacenamiento).

Horas de almacenamiento

(nº réplicas)

Proporción

L / L A / A A / L

4 (3) 0,890 ± 0,06 0,837 ± 0,09 0,947 ± 0,11

24 (3) 0,880 ± 0,07 0,845 ± 0,08 0,966 ± 0,11

Los valores de las proporciones entre largos mostraron un 50 porciento de

embriones significativamente distintos de 1 (p<0,05), para ovas almacenadas

por 4 y 24 h (Figura Nº6. A). Un 75 y 61 % de embriones mostraron diferencias

estadísticamente significativas frente al valor control (p<0,05), para las

proporciones entre los valores de los anchos de ovas almacenadas por 4 y 24

horas, respectivamente (Figura Nº6. B). Mientras que los valores de las

proporciones entre anchos y largos mostraron un 1% de embriones

significativamente distintos de 1 (p<0,05), para ovas almacenadas por 4 y 24 h

(figura Nº6. C).

9

Figura N° 6. Disperción de las proporciones entre largos (a), anchos (b) y

entre anchos y largos (c) de los primeros blastómeros de salmón coho

(Oncorhynchus kisutch). Donde valores menores a 0,9 y mayores a 1,1 son

significativamente distintos de 1 (p<0,05; n = 69 ), la línea roja indica el límite de

simetría entre las proporciones.

10

DISCUSIÓN

El diámetro medio de los blastodiscos de Oncorhynchus kisutch fue de 820,83 ±

41,69 µm, similar a lo encontrado por Ballard, (1973) con aproximadamente

1000 µm. en Onchorynchus mykiss y 880 µm en Salvelinus fontinalis y en

Salmo salar 950 µm. Gorolidov, (1983).

La figura Nº3 muestra que las ovas almacenadas por 24 horas presentan una

mayor tasa de fertiidad en comparación con las ovas almacenas por 4 horas.

También, se evidencia el gran deterioro que sufrieron ovas almacenadas por

más tiempo (48, 72 y 96 horas) mostrando 0% de oocitos fecundados, muy

distinto a lo descrito por otros autores, donde fue posible mantener ovas viables

por prolongados tiempos de almacenamiento “in Vitro” (Tabla N°3). Jensen &

Alderdice, (1984), demostraron que ovas de Oncorhynchus keta, aumentan el

periodo que pueden ser almacenadas “in Vitro” con temperaturas relativamente

bajas (Tabla N°3), donde en condiciones de almacenamiento similares a las de

esta investigación, a 3º C consiguieron mantener ovas 233 horas con un 50%

de fertilidad, superior a lo observado en este estudio. El corto tiempo que se

pudo almacenar oocitos de Oncorhynchus kisutch con alta fertilidad, tiene

relación con al envejecimiento de los gametos previo al desove, ya que antes

de desovar la hembra no se tuvo certeza del momento justo de la ovulación. Sin

embargo, esta se puede aproximar usando la grafica de Gordon et al., 1987,

donde señala que oocitos de Oncorhynchus mykiss obtienen mejor porcentaje

de fertilidad 4 días post ovulación (>80 en el día 1 y 100% cercano al día 4), de

este modo se puede determinar que la hembra utilizada estaba ovulada algunos

días antes de ser desovada, considerando que nuestros porcentajes de

fertilidad fueron relativamente bajos. Además, se debe mencionar que oocitos

almacenados por largos periodos fuera de la cavidad celómica de la hembra,

generalmente muestran signos parecidos a la de oocitos sobre maduros como:

mayor turgencia, aparición de pigmentos, mayor diámetro, etc. (Kjorsvik et al.,

1990; Niksirat et al., 2006), y por consiguiente la viabilidad de la ova es más

baja en cuanto aparecen estos signos (Kjorsvik et al., 1990). Los bajos

11

porcentajes y posterior caída de fertilidad sobre 48 horas de almacenamiento

son debido a que la hembra llevaba más de 4 días ovulada, por lo que habían

muchos oocitos sobremaduros, que no fueron fecundados.

Tabla N° 3. Tiempo de almacenamiento (horas) y porcentaje de fertilidad en

distintas temperaturas y en diferentes especies de salmónidos.

Especie Temperatura

(ºC) Almacenamiento

(horas) Fertilidad

(%) Autor

Ocorhynchus kisutch

4 48 68,10% Fuentes et al.,

2011

Oncorhynchus keta

3 233,2 50% Jensen & Alderdice.,

1984

Oncorhynchus keta

6 152,6 50% Jensen & Alderdice.,

1984

Oncorhynchus keta

9 99,9 50% Jensen & Alderdice.,

1984

Oncorhynchus keta

12 65,4 50% Jensen & Alderdice.,

1984

Oncorhynchus keta

15 42,8 50% Jensen & Alderdice.,

1984

Oncorhynchus mykiss

12 - 13 48 60% Goetz & Coffman,

2000

Oncorhynchus mykiss

2 - 3 216 77,50% Niksirat et al., 2007

Salmo trutta 4 72 61 - 90

% Billard et al., 1981

Salmo trutta caspius

2 - 3 48 91% Niksirat et al., 2006

Al comparar la proporción entre los largos y los anchos de los 4 primeros

blastómeros para ovas almacenadas por 4 y 24 horas con el valor control “1”

revela una evidente asimetría siendo, todos los valores significativamente

distintos de 1 (< 0,9 y >1,1 son significativamente distintos de 1 (p<0,05) (Tabla

2). La proporción entre el ancho y el largo de los 4 blastómeros para ovas

almacenadas por 4 y 24 horas fue de 0,947 ± 0,11 y 0,966 ± 0,11

respectivamente, donde se puede inferir la obtención de ocho blastómeros

simétricos en un tercer clivaje. Pavlov & Emel 2008 caracterizan la simetría del

primer clivaje en Z. scopas, identificando algunos embriones asimétricos;

12

desincronización del clivaje, “sincitio” y otras aberraciones en el desarrollo

atribuidas a la sobremadurez de huevos. Avery & Brown 2005 y Avery et al.

2009 mencionan una evaluación de calidad de gametos basada en simetría

de los blastómeros realizada solo hasta las 16 células, puesto que después

son demasiadas divisiones y es poco clara la evaluación, mencionando

patrones de anomalía como; marginal, “donut”, triple y tarta, dándose algunos

casos donde el patrón de asimetría es combinado. Proponiendo utilizar los

patrones de segmentación temprana con una buena simetría de los

blastómeros de 8-32 células como herramienta de control de calidad de

gametos correlacionándose con el éxito de incubación, tasa de eclosión,

sobrevivencia de las larvas (Pavlov & Monkness 1994; Shields et al.,

1997KjØrsvik et al., 2003; Avery & Brown 2005; Pavlov & Emel 2008; Avery et

al., 2009). Generalmente las aberraciones, adoptan la forma de las

interacciones espaciales irregulares (asimetría) o anomalías del clivaje:

tamaños desiguales de las células, márgenes de las células incompletas o

incorrecto número de células, (Shields et al, 1997). Blastómeros anormales de

peces han sido registrados en una serie de estudios, en su mayoría sobre los

efectos de los contaminantes en el desarrollo del óvulo, en términos generales

conciernen a la sensibilidad de las ovas a las variables medioambientales

(físicos y químicos) o estudios de "calidad de los ovas".

Se establece que la calidad de gametos puede verse influenciada por la

nutrición de los reproductores, ambiente, manejos y otros (KjØrsvik et al., 1990

& KjØrsvik et al., 2003). Las divisiones celulares anormales en la embriogénesis

temprana se cree que está relacionado con un deterioro del huevo (Kjørsvik et

al, 1990, 2003; Shields et al, 1997). También puede ser que el líquido celómico

influye en la fertilidad de los huevos y esto varía según los reproductores (Goetz

& Coffman, 2000).

Shield et al., 1997, sostienen que en la división celular la evaluación de las

primeras fases del desarrollo es el único indicador fiable de la calidad de los

huevos para el “halibut”. Sin embargo, esto no debería proporcionar una

13

evaluación definitiva, por lo que debe ser acompañado por otros indicadores de

viabilidad. Además, la mayoría de la mortalidad de huevos anormales ocurre

durante el primer tercio de la embriogénesis, lo que sugiere que algunos huevos

pueden someterse a la corrección de la simetría celular durante divisiones

posteriores (Von Westernhagen, 1988). Los resultados actuales muestran que

para Oncorhynchus kisutch la simetría de los blastómeros es un indicador

confiable de viabilidad como ya se sugirió antes, en especial cuando se

considera como el único criterio. La evaluación de simetría y su relación con la

calidad de huevos, son desarrolladas con éxito en peces de aguas marinas,

por esto, es necesario llevar a cabo investigaciones que correlacionen

simetría de blastómeros con sobrevivencia embrionaria y larval (Sánchez,

2010).

Para una mejor evaluación de la simetría de los primeros blastómeros y su

relación con la calidad de gametos, se recomienda llevar a cabo un estudio

posterior donde se incluya un mayor número de hembras, se aumente la

frecuencia de palpajes y así se podrá conocer con mayor certeza el momento

de la ovulación. Además prolongar los periodos de almacenamiento con

evaluación entre intervalos de menor tiempo (desde 12 horas, hasta 48 horas),

correlacionar la simetría de los blastómeros con la sobrevivencia que se

obtenga al cultivar los alevines obtenidos de gametos de las mismas hembras

sometidos a las mismas condiciones de almacenamiento e incubación.

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BIBLIOGRAFÍA

Avery, T.S., Brown, J.A. 2005. Investigating the relationship among abnormal

patterns of cell cleavage, egg mortality and early larval conditionin Limanda

ferruginea. Journal of Fish Biology 67: 890–896.

Avery, T., Killen, S., Hollinger. 2009. The relatioship of embrionic development,

mortality, hatching success, and larval quality to normal or abnormal early

embrionic cleavage in Atlantic cod, Gadus morua. Aquaculture 289, 265-273.

Ballard W. 1973. Normal Embryonic Stages for Salmonid Fishes, Based on

Salmo gairdneri Richardson and Salvelinus Fontinalis (Mitchill). Journal of

Experimental Zoology. 184, 7-25.

Billard R., Gillet C. 1981. Ageing of eggs and teperature potentialization of

micropolluant effects of the aquatic médium on trout gamotes. Cah. Lab.

Montereau, 12: 35-42.

Bobe J., Labbé C. 2010. Egg and Sperm quality in fish. Gen. Comp.

Endocrionol. 165, 535-548.

Bonnet É., Jalabert B., Bobe J. 2003. A 3-day in vitro storage of rainbow trout

(Oncorhynchus mykiss) unfertilised eggs in coelomic fluid at 12ºC does not

affect development succes. Cybium, 27(1): 47-51.

Bustos C., Landaeta M. 2005. Desarrollo de huevos y larvas tempranas de la

Merluza del sur, Merluccius australis, cultivados bajo condiciones de

laboratorio. Gayana 69, 402-408.

Costello, D. P., M. E. Davidson, A. Eggers, M. H. Fox, and C. Henley. 1957.

Methods for obtaining and handling marine eggs and embryos. Marine Biological

Laboratory, Woods Hole, Mass., 247 pp.

15

Cuartas A., Rosas J., Velasquez A., Cabrera T. 2003. Inducción al desove,

desarrollo embrionario y larval del Corocoro rayao Haemulon bonariense

Cuvier, 1830 (Pisces: Haemulidae). Revista de Biología Marina y Oceanografía

38, 27 – 37

Estay, F., Díaz, N.F., Valladares, L., Dazarola, G. 1995. Manejo reproductivo de

salmonidos. Serie de Publicaciones para la Acucultura. 62 pp.

Goetz F.W., Coffman M.A. 2000. Storage of unfertilized eggs of rainbow trout

(Oncorhynchus mykiss) in artificial media. Aquaculture, 184: 267-276.

Gorodilov Y. N. 1983. Stages of embryonic velopment in Atlantic salmon,

Salmon salar L. II scription and chronology. GosNIORKh 200: 107 – 126.

Gordon, M.R., Klotins, K.C., Campbell, V.M. & Cooper, M.N., 1987. Farmed

salmon broodstock management. Ministry of Environment Victoria, , B.C.

Industrial Research Assistance Program National Research Counsil of Canada.

Sea-1 Aquafarm, Ltd. Vancouver, B.C. 145pp.

Gorodilov, Y.N. 1996 Description of the early ontogeny of the Atlantic salmon,

Salmo salar, with a novel system of interval (state) identification. Environmental

Biology of Fishes 47: 109-127.

Jensen J.O.T., Alderdice D.F. 1984. Effect of temperature on short-term storage

of eggs and sperm of chum salmon (Oncorhynchus keta). Aquaculture, 37: 251-

265.

Killeen J., McClay H. And Johnston I. 1999. Development in Salmo trutta at

different temperatures, with a quantitavie scoring method for intraspecific

comparisons. Journal of Fish Biology. 55, 382-404.

KjØrsvik E., Hoehne.Reitan K., Reitan K.I. 2003. Egg and larval quality criteria

as predictive measures for juvenile production in turbot (Scophthalmus maximus

L.). Aquaculture. 227, 9-20.

16

KjØrsvik E., Mangor-Jensen, A., Holmefjord, I. 1990. Egg quality in fishes.

Advances in Marine Biology. Volume 26 ISBN O-12-026126-X

Kunz Y. 2004. Developmental biology of teleost fishes. Fish & Fisheries Series,

Springer, Dordrecht. 636 pp.

Komrakova M., Holtz W. 2009. Factors responsible for successful chilled

storage of unfertilized rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) eggs. Aquaculture

286, 156-163.

Kunz Y. 2004. Developmental biology of teleost fishes. Fish & Fisheries Series,

Springer, Dordrecht. 636 pp.

Moran D., Smith C., Gara B., Poortenaar C. 2007. Reproductive behaviour and

early development in yellowtail kingfish (Seriola lalandi Valenciennes 1833).

Aquaculture. 262, 95-104.

Niksirat H., Sarvi K., Mojazi B., Karami, M., Hatef A. 2006. In vitro storage of

unfertilized ova of endangered Caspian brown trout (Salmo trutta caspius) in

artificial media. Animal Reproduction Science. 100,356–363

Niksirat H., Sarvi K., Mojazi B., Hatef A. 2007. Effects of storage duration and

storage media on initial and post-eyeing mortality of stored ova of rainbowtrout

Oncorhynchus mykiss. Aquaculture 262, 528-531.

Pavlov, D.A., Drerahinskiy, K.F., Radzikhovskaya, E.K., 1992. Assessing the

quality of roe from White Sea wolffish (Anurhichus lupus marisalhi L.), obtained

under experimental conditions. Journal of ichthyology. 32, 88-104.

Pavlov D. Monksness E. 1994. Production and quality of eggs obtained from

wolfish (Anarhichas lupus L.) reared in captivity. Aquaculture. 122, 295-312.

Pavlov, D.A., Emel, N.G. 2008. Morphological Criteria of Egg Quality in Marine

Fishes: Activation and Cleavage of Eggs of Zebrasomma scopas

(Acanthuridae). Journal of ichthyology. 48; 533-548.

17

Rappaport, R. 1961. Experiments concerning the cleavage stimulus in sand

dollar eggs. Journal of Experimental Zoology. 148, 81-89.

Sánchez, R. 2010. Caracterización morfométrica de los primeros blastómeros

en trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss). Trabajo de titulación presentado

como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Ciencias de

la Acuicultura. Universidad Católica de Temuco. Chile. pp 15.

Shields R.J., Brown N.P. & Bromage N.R. 1997. Blastomere morphology as

predictive measure of fish egg viability. Aquaculture 155,1-12.

Sohrabnezhad M., Kalbassi M. R., Nazari R. M., Bahmani M. 2006. Short-term

storage of Persian sturgeon (Acipenser persicus) ova in artificial media and

coelomic fluid. Journal Applied Ichthyology. 22, 395-399.

Tarín J., Pérez-Albalá., Cano Antonio. 2000. Consequences on offspring of

abnormal fuction in ageing gamotes. European Society of Human Reproduction

and Embrology. 6, 532-549.

Von Westernhagen, H., 1988. Sublethal effects of pollutants on fish eggs and

larvae. In: Hoar, W.S., Randall D.J. (Eds.), Fish Physiology, Vol. XI, The

physiology of developing fish, Part A, eggs and larvae. Academic Press, pp.

253-346.

Withler F.C., Morley R.B. 1968. Effects of chilled storage on viability of storage

ova and sperm of sockeye and pink salmon. Journal of the Fisheries Research

Board of Canada., 25, 2695-2699.

18