Řešení struktury proteinů pomocí NMR spektroskopie

Řešení struktury proteinů pomocí NMR spektroskopie

J.W. Emsley: “NMR started as the plaything of the physicists, became the

favourite toy of the chemists and finally went on to seduce biochemists.”

Využití NMR spektroskopie v jednotlivých oborech podle nositele

Nobelovy ceny za chemii Prof. Richarda Ernsta:

Medicine

Biochemistry

Chemistry

Physics

fyziologické prostředí

jednoduchá příprava vzorku

vysoce selektivní odezva

široký rozsah fyzikálně-chemických vlastností

protože se zabýváme NMR spektroskopií

Důvody pro využití NMR spektroskopie ke studiu biomolekul

1. Jaké typy biologicky aktivních molekul ? peptidy a proteiny

nukleové kyseliny

oligosacharidy

2. Jaký typ informace může být pomocí NMR získán? identifikace substrátu

prostorová struktura molekuly

studium dynamického chování systému

prostorová struktura komplexu

zkoumání vazby ligandu a substrátu

Strategie pro určování struktur biomolekul

Obecné informace o

molekule (primární

struktura, kovalentní

vazby…)

Oprava přiřazení NMR

parametrů, signálů

Zhodnocení kvality struktur

Odhad přibližné struktury

Výpočet souboru struktur

Výpočet statistických údajů pro soubor

konečných struktur

Výpočet NOESY spekter Porovnání s databázemi

(Procheck, Whatif….)

NMR vzorek

NMR experimenty

NMR spektra Přiřazení signálů

Přiřazení experimentálních NMR

parametrů (NOE…)

Požadavky na vzorek pro NMR experimenty

Vzorek musí zůstat aktivní a nedenaturovaný během NMR experimentů !!!

rozpouštědlo H2O + 5-10% D2O (časová stabilizace magnetického pole)

pufr nejběžnější je fosfátový pufr, neobsahuje žádné protony

acetátový pufr (lze pořídit deuterovaný)

teplota podle požadavků studovaného materiálu (15 – 40C)

aditiva nutná aditiva je možné někdy zaměnit za deuterovaná analoga

koncentrace pro NMR experimenty musí být v rozsahu alespoň 0.1-1.0 mM, vzorek

nesmí podléhat agregaci, koagulaci, sebezničení v tomto konc. rozmezí

stabilita nutná dlouhodobá stabilita v rozsahu minimálně několika týdnů

Úspěšné řešení proteinových struktur

bezpodmínečně vyžaduje kvalitní

spolupráci mezi NMR specialisty a

biochemiky !

Příprava vzorku proteinu pro NMR měření

1. Získání DNA proteinu

2. Příprava plasmidové DNA

3. Exprese rekombinantního proteinu, např. v E.Coli

4. Izolace a čištění

5. Zakoncentrování vzorku

6. Zopakování procesu se značeným médiem

CO C N CO

C

C

H H H

H H C

C

Exprese proteinů: - v minimálním médiu (15NH4Cl, 15NH4SO4 - jediný zdroj 15N ) (13C-glukosa, 13C-glycerol - jediný zdroj 13C) - izotopově obohacené růstové médium

Příprava vzorků se zvýšeným obsahem 13C/15N

Segmentové izotopové obohacení

N-terminální doména

C-terminální doména

Capsidový protein HIV-1

N-term Intein N-term Cys C-term Tag

N-term

N-term

Intein N-term Tag Cys

Cys

C-term

C-term

1. Obě domény se exprimují zvlášť

2. Intein se odštěpí thiolem a Tag proteasou

3. Domény se spojí vytvořením peptidové vazby

Segmentové izotopové obohacení

Segmentové izotopové obohacení

1H

15N celý protein obohacen (15N) 1 doména obohacena (15N)

„Cell-free“ expresní systém

Zdroj: propagační materiál firmy Promega

http://www.protein-nmr.org.uk/labelling.html

Přehled metod pro izotopové obohacení proteinů

Postup přípravy izotopově obohaceného vzorku

• Příprava neznačeného vzorku proteinu o příslušné koncentraci

kontrola správného sbalení proteinu

kontrola dostatečně vysoké koncentrace

sledování dlouhodobé stability

• Příprava 15N obohaceného vzorku proteinu

kontrola čistoty proteinu

kontrola správného sbalení proteinu

kontrola dostatečně vysoké koncentrace

• Příprava 13C/15N (13C/15N/2H) obohaceného vzorku proteinu

vlastní strukturní studie

Zakoncentrování vzorku

Koncentrace měřeného vzorku ~ 0,5 – 1,0 mM

v případě využití chlazené sondy ~ 0,1 – 0,5 mM

Objem roztoku 250 - 500 l

Srovnání NMR spekter sbalené a nesbalené struktury proteinu

7.07.58.08.59.09.5 ppm

108

110

112

114

116

118

120

122

124

126

128

7.07.58.08.59.09.5 ppm(1H)

(15

N)

10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 ppm

WVQPI 107 AA (12 kDa) IMMCS

WVQPI 107 AA (12 kDa) IMMCS

83 AA (9 kDa)

(1H)

správně sbalená forma proteinu

nesbalená forma téhož proteinu

1H- 15N korelace v oblasti amidických vodíků (vzorek nespecificky obohacen 15N)

čerstvě připravený

vzorek

vzorek po 5 dnech

Strategie pro určování struktur biomolekul

Obecné informace o

molekule (primární

struktura, kovalentní

vazby…)

Oprava přiřazení NMR

parametrů, signálů

Zhodnocení kvality struktur

Odhad přibližné struktury

Výpočet souboru struktur

Výpočet statistických údajů pro soubor

konečných struktur

Výpočet NOESY spekter Porovnání s databázemi

(Procheck, Whatif….)

NMR vzorek

NMR experimenty

NMR spektra Přiřazení signálů

Přiřazení experimentálních NMR

parametrů (NOE…)

Biomolekulární NMR spektroskopie: měřená jádra

vysoké přirozené zastoupení (99.98%) vysoká citlivost (1.00) malá disperze chemických posunů NMR signálů (~15.0 ppm)

velká disperze chemických posunů NMR signálů (~200.0 ppm) nízké přirozené zastoupení (1.108%), možné uměle navýšit až na

100% nízká citlivost (1.76x10-4), po 100%ním izotopovém obohacení

(1.59x10-2) střední disperze chemických posunů NMR signálů (~30.0 ppm)

(oproti 13C nezávislost na typu aminokyseliny) nízké přirozené zastoupení (0.37%), možné uměle navýšit až na

100% velmi nízká citlivost (3.85x10-6), po 100%ním izotopovém

obohacení (1.04x10-3) používá se pro speciální účely

1H

13C

15N

2H

Potlačení signálu vody

Signál H2O je 104-105 násobně intenzivnější než odezva měřené molekuly.

Proč H2O?

1. Voda je fyziologické prostředí

2. Nelze použít D2O z důvodů chemické výměny s amidickými protony.

1H spektrum proteinu po presaturaci H2O

zbytkový signál H2O

CW-ozařování

90°

Během relaxační doby ozařujeme signál vody slabým RF polem.

Potlačení signálu vody: metoda presaturace

Potlačení signálu vody: metoda WATERGATE

Selektivní manipulace se signály vody a rozpuštěné látky doplněná o čistící gradientní echo.

t t

G G

180°

90°

1H

G

Selektivní 180° puls

Potlačení signálu vody: metoda WATERGATE

Multidimensionální NMR spektroskopie

F3(1H)

F1(15N)

F2(13C)

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5

N

H

H

H

H H

H H

1H - spektrum

ppm

aromatic H

NH-backbone

NH-SC

CH

aliphatic H

methyl H

1D 1H spektrum proteinu

kuřecí lysozym

129 AA, Mw = 14.6 kDa

Odezva více jader v jednom spektru

13C

13C

13C

13C’

15N

H H

H HHN

13C’

13C

13C

55Hz 15Hz

90Hz

35Hz

7Hz

<1Hz

130Hz

140Hz

35Hz

35Hz

11Hz 55Hz

při zobrazení jednoho jádra pH(H),pN(N) a pC(C)

pH (0 ≤ pH ≤ 1)

pN (0 ≤ pN ≤ 1)

pC (0 ≤ pC ≤ 1)

při zobrazení dvou jader (H-N) najednou P = pH . pN

při zobrazení tří jader (H-N-C) najednou P = pH . pN . pC

pravděpodobnost překryvu

F1(1H)

1D

Korelační spektroskopie jako nástroj pro

zjednodušení NMR spekter

Lepší rozlišení je ve vícedimenzionálních spektrech zajištěno využitím izotopového obohacení 15N a 13C.

2D

F1(1H/X)

F2(1H)

3D

F3(1H)

F2(X)

F1(1H/X)

4D

F4(1H)

F1(1H)

F3(X)

F2(X)

Přiřazování rezonancí

• NMR experimenty pro přiřazení signálů pracují se dvěma nebo

třemi různými jádry najednou (experimenty s trojnásobnou rezonancí),

chemické posuny těchto jáder jsou navzájem zkorelovány.

• Názvy takovýchto experimentů se tvoří podle typu jader, která korelují:

HNCA koreluje amidický vodík s příslušným dusíkem a uhlíkem v

pozici .

HN(CO)CA koreluje stejné typy atomů (jader) jako HNCA, ale přes

CO. To naznačuje směr korelace, tj. H a N i-té aminokyseliny a C

aminokyseliny v pozici i-1.

• Směr přenosu magnetizace je v případě těchto experimentů

H N C a zpět. Experimenty se nazývají „out and back“

• Naproti tomu přenos magnetizace u experimentů např. CBCA(CO)NH

začíná na atomu CB (i-1) aminokyseliny a končí na amidickém H

aminokyseliny následující, tj. experimenty „out and stay“.

Strategie pro určování struktur biomolekul

Obecné informace o

molekule (primární

struktura, kovalentní

vazby…)

Oprava přiřazení NMR

parametrů, signálů

Zhodnocení kvality struktur

Odhad přibližné struktury

Výpočet souboru struktur

Výpočet statistických údajů pro soubor

konečných struktur

Výpočet NOESY spekter Porovnání s databázemi

(Procheck, Whatif….)

NMR vzorek

NMR experimenty

NMR spektra Přiřazení signálů

Přiřazení experimentálních NMR

parametrů (NOE…)

Přiřazování rezonancí

13C

13C

13C

13C’

15N

H H

H HHN

13C’

13C

13C

55Hz 15Hz

90Hz

35Hz

7Hz

<1Hz

130Hz

140Hz

35Hz

35Hz

11Hz 55Hz

HNCA experiment

aminokyselinový zbytek I

aminokyselinový zbytek I-1

F3(1HN)

F2(15N )

F1(13C)

Konstrukce multidimensionálních NMR spekter 3D HNCA

F3(1HN)

F1(13C)

F2(15N )

I

I-1

Přiřazování rezonancí

13C

13C

13C

13C’

15N

H H

H HHN

13C’

13C

13C

55Hz 15Hz

90Hz

35Hz

7Hz

<1Hz

130Hz

140Hz

35Hz

35Hz

11Hz 55Hz

HN(CO)CA experiment

F3(1HN)

F2(15N )

F1(13C)

Konstrukce multidimensionálních NMR spekter 3D HNCA/HN(CO)CA

F3(1HN)

F1(13C)

F2(15N )

I

I-1

F2(15N )

I-1

Sekvenční přiřazení hlavního řetězce

HNCA HN(CO)CA

missing crosspík

Přiřazování rezonancí Využití atomů uhlíku C

13C

13C

13C

13C’

15N

H H

H HHN

13C’

13C

13C

55Hz 15Hz

90Hz

35Hz

7Hz

<1Hz

130Hz

140Hz

35Hz

35Hz

11Hz 55Hz

HNCACB experiment Výhoda: chemický posun C je charakteristický pro typ aminokyselinového zbytku

aminokyselinový zbytek I aminokyselinový zbytek I-1

Přiřazování rezonancí Využití atomů uhlíku C

13C

13C

13C

13C’

15N

H H

H HHN

13C’

13C

13C

55Hz 15Hz

90Hz

35Hz

7Hz

<1Hz

130Hz

140Hz

35Hz

35Hz

11Hz 55Hz

HN(CO)CACB experiment

Leu12 Leu14Thr13 Trp15Ser11

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

126.8 ppm123.7 ppm 124.7 ppm 119.9 ppm114.9 ppm

(1H) (

1H) (

1H) (

1H) (

1H)

(15N) (

15N)(

15N) (

15N) (

15N)

(13C

)

Přiřazování rezonancí Využití atomů uhlíku C

HNCACB/HN(CO)CACB experiment

C

C’ N

H H

H H N

C’ C

H

C

C H H

C H H

C H H

Přiřazování rezonancí postranních řetězců

55 50 55 50

60

50

40

30

35 30 35 30 30 2565 60

60

50

40

30

ppm

ppm

Pro4CG-CD-HD2

Pro4CD-CD-HD2

Pro4CG-CD-HD3

Pro4CD-CD-HD3

Pro4CA-CB-HB2

Pro4CG-CB-HB2

Pro4CB-CB-HB2

Pro4CA-CB-HB3

Pro4CB-CB-HB3

Pro4CG-CB-HB3

Pro4CB-CG-HG

Pro4CD-CG-HG

Pro4CG-CG-HG

Pro4CB-CA-HA

Pro4CA-CA-HA

H : 4.296 ppmH : 1.818 ppm H : 2.185 ppm H : 1.913 ppm H : 3.589 ppm H : 3.715 ppm

(1

3C

)

(13C)

Kompletní přiřazení Prolinu 4 proteázy M-PMV pomocí hCCH-COSY spektra

ON

H

H

H

H

H

H

H

OCH3

Přiřazování rezonancí postranních řetězců

3D

F3(13C)

F2(1H)

F1(13C)

)](....'[8 6

22

)(

cfsJ

rCH

CDH t

2R

H/ D ~ 6.6

Práce s velkými molekulami způsobuje dvojí komplikaci

• velmi komplikovaná spektra

• rychlá spin-spinová relaxace

Práce s extra velkými molekulami Mw> 25 kDa

Řešení: výměna atomů vodíku za deuterium

13C

13C

13C

13C’

15N

H H

H HHN

13C’

13C

13C

55Hz 15Hz

90Hz

35Hz

7Hz

<1Hz

130Hz

140Hz

35Hz

35Hz

11Hz 55Hz

D D

D D

Teoreticky může být R2 snížen až 44 násobně, prakticky většinou maximálně 15x.

CD3 CD3

C D

C

D

CO N

H

Práce s extra velkými molekulami Mw> 25 kDa

Exprese proteinu v růstovém médiu obohaceném o 13C/ 15N/ 2H

Fully protonated versus perdeuterated EIN protein

Fully protonated versus perdeuterated EIN protein

Missing crosspeaks are marked

www.protein-nmr.org.uk

Praktické návody-jak na to?

Strategie pro určování struktur biomolekul

Obecné informace o

molekule (primární

struktura, kovalentní

vazby…)

Oprava přiřazení NMR

parametrů, signálů

Zhodnocení kvality struktur

Odhad přibližné struktury

Výpočet souboru struktur

Výpočet statistických údajů pro soubor

konečných struktur

Výpočet NOESY spekter Porovnání s databázemi

(Procheck, Whatif….)

NMR vzorek

NMR experimenty

NMR spektra Přiřazení signálů

Přiřazení experimentálních NMR

parametrů (NOE…)

chemický posun (chemické okolí jádra) NOE interakce (meziatomová vzdálenost)

interakční konstanta (dihedrální úhel)

zbytková dipolární interakce (orientace)

vodíková vazba (vzdálenost, vazebný úhel)

Získání experimentálních parametrů z NMR spekter.

Chemický posun Výpočet indexu chemického posunu

Přiřazení rezonancí hlavního řetězce: H,C, C’

Výpočet indexů chemického posunu, tzv. CSI

Odhad sekundární struktury na základě „lokální hustoty“

těchto indexů

Chemické posuny některých jader jsou ovlivněny typem pravidelné sekundární struktury, do které jsou zahrnuty!!!

(H)

-sheet „random coil“ -helix

Změna chemického posunu indukovaná sekundární strukturou

Histogram indexu chemického posunu jader H, C a C‘.

helix I helix II helix III helix IV

Sekvence aminokyselin

C N

+1 0

-1

Secondary structure of M-PMV PR from CSI

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

CSI

-1

0 1

H H

rIS < 5-6 Ǻ

• přímá spin-spinová interakce mezi jádry

Nukleární Overhauserův efekt NOE Experimentální omezení vzdáleností

6

2

422

41

6

104

ISc

c

cIS r

ht

t

t

IS - rychlost nárustu NOE

tc - korelační čas

rIS - meziatomová vzdálenost

- pracovní frekvence

• interakce mezi dipóly interagujících jader

• relaxační jev

• výměna energie mezi oběma jádry

• charakterizuje vzdálenost mezi oběma jádry

6 rfIS

Převod intenzity NOE krospíků na vzdálenost mezi atomy.

Dolní mez :1.8 Ǻ

Jedná se o součet vzdáleností van der Waalsovských

poloměrů dvou interagujících atomů vodíku

Horní mez :

Nastavuje se podle intenzity příslušného krospíku. Pro

větší molekuly se používá max. vzdálenost až 6 Å.

1.8 Ǻ r 2.5 Ǻ

1.8 Ǻ r 3.5 Ǻ

1.8 Ǻ r 5.0 Ǻ

4D 13C/ 15N-editované NOESY

1H

1H

13C

15N

Editovaná NOESY spektra

NOE

1H 1H

15N 13C JHC JHN

15N= 106.4 ppm 15N= 106.4 ppm 13C= 45.8 ppm

15N= 106.4 ppm 13C= 56.1 ppm

G78HN-G78H G78HN-S77H

3D 15N-editované NOESY 4D 13C/15N-editované NOESY

H

O

O

N

C

C

C

C

y

f c1

c2

C

H

H

H

Nepřímá spin-spinová interakční konstanta Experimentální omezení dihedrálních úhlů

3J

[Hz]

10

8

6

4

2

0

-120 60 0 120

Q

deg

H-NC-H

CO-NC-H

H-NC-C H-NC-CO

Karplusova rovnice 3J = A cos2Q B cosQ C

Vztah mezi interakční konstantou a dihedrálními úhly peptidu

Typické hodnoty interakčních konstant 3JHH

pro dihedrální úhel f

-helix f ~ 60 deg

J 6 Hz

typické nastavení pro úhel f:

110 f 10 deg

-struktura skládaného listu f ~ 10

6 J 9 Hz

typické nastavení pro úhel f:

170 f 70 deg

9.0 8.9 8.8 8.7 1H

118.0

1

22.0

120.0

15N

Jiso

121.0

1

22.0

1

20.0

8.86 8.84 1H

15N

119.0

D

isoanisoresid JJD

NMR experiments: - experiments for measurement J constants - IPAP experiments (better resolution)

Bo Azz

Ayy

Axx

Principal axis system

Residual dipolar couplings RDC Long-range constraint

N H

q

f

N

Janiso

– ~ 6% polyacrylamide gel (crosslinked with bisacrylamide)

– protein diffuses into dried gel

– axial stretching (radial compression) of the gel

Stretched polyacrylamide gel

squeeze alignment of protein in oblate pores

NMR tube

Vodíkové vazby v pravidelných strukturách Další omezení vzdáleností

-helix

-sheet-antiparalelní

N

C

N

C Měření: - výměnné experimenty s D2O - teplotní závislost labilních protonů (NH, OH…) Z NMR experimentů je možné získat pouze informaci o donoru! Informaci o příslušném akceptoru lze získat až z vypočtených struktur

Strategie pro určování struktur biomolekul

Výpočet statistických údajů pro soubor

konečných struktur

Výpočet NOESY spekter Porovnání s databázemi

(Procheck, Whatif….)

NMR vzorek

NMR experimenty

NMR spektra Přiřazení signálů

Přiřazení experimentálních NMR

parametrů (NOE…)

Obecné informace o

molekule (primární

struktura, kovalentní

vazby…)

Oprava přiřazení NMR

parametrů, signálů

Zhodnocení kvality struktur

Odhad přibližné struktury

Výpočet souboru struktur

Jak vše poskládat dohromady ????

Cray T3E

Info o kovalentní

struktuře

Omezení vzdáleností

(NOEs)

Omezení dihedrálních úhlů

(interakční konst.)

Výpočetní algoritmus: Molekulární mechanika

simulované žíhání s experimentálními omezeními (vzdálenosti,

dihedrální úhly…)

- molekula se ohřeje na vysokou teplotu (2000 – 50 000 K)

- pomalu se ochladí na teplotu blízkou nule

simulované žíhání v Kartézském prostoru (Newtonovy pohybové

rovnice)

simulované žíhání v prostoru torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice)

potkintot EEE

Simulované žíhání (simulated annealing) typický průběh

časová osa [ns]

teplota [K] vysokoteplotní

perioda

perioda postupného

ochlazování

minimalizace

potenciálové

energie

Soubor struktur vyhovující nejlépe získaným experimentálním omezením

potkintot EEE

Ekin je kinetická energie vypočítávaná v každém kroku z teploty molekuly

Epot je součet energií produkovaných penalizačními funkcemi

Molekulární parametry (hmotnost atomů, délka vazby, vazebné úhly…

vstupují do výpočtu ve formě tzv „force fields“

Př: penalizační fukce pro NOE:

Jak vše poskládat dohromady ????

d

ENOE

0

dolní mez (1,8 Å) horní mez (< 6 Å)

Cílem je minimalizovat Epot

vdW kov NOE DIH

DIHNOEkovvdWpot DkDkDkDkE .....2222

2

0exp

2 )( ddD dexp je experimentální nebo aktuální hodnota

d0 je ideální hodnota

Prezentace vypočtených struktur

C N N C

helix I

helix III

helix II helix IV

N N

C C

Strategie pro určování struktur biomolekul

Výpočet statistických údajů pro soubor

konečných struktur

Výpočet NOESY spekter Porovnání s databázemi

(Procheck, Whatif….)

Obecné informace o

molekule (primární

struktura, kovalentní

vazby…)

Oprava přiřazení NMR

parametrů, signálů

Zhodnocení kvality struktur

Odhad přibližné struktury

Výpočet souboru struktur

NMR vzorek

NMR experimenty

NMR spektra Přiřazení signálů

Přiřazení experimentálních NMR

parametrů (NOE…)

2. Rozptyl struktur v souboru

- mezi jednotlivými strukturami a průměrnou strukturou (mean)

- mezi jednotlivými strukturami navzájem

- počítá se buď pro celou molekulu, jednotlivé části nebo jednotlivé

aminokyseliny

n

xx

RMSD

n

i

i

1

2

Charakterizace vypočtených struktur

1. Shoda vypočtených struktur s experimentálními daty

- velikost potenciálová energie

- počet a velikost neshod s experimentálními parametry (NOE,

dihedrální úhly….

- počet a velikost špatných kontaktů mezi atomy (van der

Waalsovský příspěvek)

- počet a velikost neshod s ideálními hodnotami kovalentních

parametrů (délky vazeb, vazebné úhly, planarita aromatických

kruhů…)

Charakterizace vypočtených struktur

3. Porovnání strukturních parametrů vypočtených struktur

s parametry v databázích software Procheck, Whatif…

http://biotech.embl-heidelberg.de:8400

Ramachandranův diagram

f/y diagram je charakteristický

pro konformaci páteře proteinu

- takto lze porovnávat i ostatní

dihedrální úhly, vazebné úhly,

délky vazeb…

- lze vytypovat problémové oblasti

Malate synthase, 723 AA, 82 kDa

Tugarinov V., Choy W.Y., Orekhov, V.Y., Kay L.E.(2005) PNAS, 102, 622-627