Apports de la cytométrie en flux dans le diagnostic des ... Vβ Repertoire Kit . Clonogramme: expression de la diversité des TCR Vβ$ expansion de lymphocytes T activés DR+ mémoires

Apports de la cytométrie en flux dans le diagnostic des immunodéficiences

primaires Françoise Mascart, MD, PhD

Liliane Schandené, PhD Immunobiology Clinic, Hôpital Erasme

Laboratory of Vaccinology and Mucosal Immunity Université Libre de Bruxelles, U.L.B.

Séminaire  d’hématologie  –  ULB                                  23  avril  2013  

Déficits immunitaires primaires

•  Maladies génétiques rares < mutations affectant un ou plusieurs gènes qui contrôle(nt) l’expression et les activités des réponses immunes.

•  prévalence ~ 1/5.000 •  >200 déficits décrits

•  >150 gènes identifiés

•  en général symptomatiques dès les 1ères années de vie (10 signes d’alerte parmi lesquels des infections sévères, récurrentes et/ou inhabituelles)

Mais plus récemment:

● DIPs conférant une prédisposition à un agent et/ou une famille d’agents pathogènes àdiagnostic plus tardif souvent à l’âge adulte (plus fréquents??) ● DIPs de l’homéostasie immunitaire: manifestations auto-inflammatoires ou auto-immunes, lymphoproliférations, néoplasies…

q  Defects of innate immunity q  Defects of adaptative immunity

•  Phagocytes  •  An?gen-­‐presen?ng  cells  •  NK  lymphocytes    

•  T  Lymphocytes    •  B  Lymphocytes    

q  Defects  in  immune  regula?on  

The  type  of  infec-on  is  a  guide    to  which  part  of  the  immune  system    is  deficient  

•  Pyogenic  bacteria    

•  Pyogenic  bacteria    

•  Persistent  fungal  skin  infec?on    

•  Recurrent  viral  infec?ons  •  Intracellular  bacteria  

Cellules immunitaires affectées <> agents infectieux

Classification of DIPs

•  Déficits immunitaires combinés (T et B) •  Déficits immunitaires humoraux (B) •  Déficits immunitaires syndromiques •  Déficits de régulation du système immunitaire •  Déficits des cellules phagocytaires •  Autres déficits de l’immunité innée •  Déficits immunitaires du complément •  Désordres auto-inflammatoires

International Union of Immunological Societies (IUIS) Expert Committee on Primary Immunodeficiency New York June 2011

Rôle de la cytométrie en flux

Anamnèse, examen clinique ê

1/Hémogramme, dosage IgG-A-M, sérologies post-vaccinales et infectieuses

ê 2/ Phénotypage lymphocytaire T,B,NK

+-Tests fonctionnels ê

Diagnostic Traitement ê

Confirmation génétique: - diagnostic définitif - conseil génétique

Autres marqueurs

Numération des lymphocytes T, B et NK

Interprétation en % et en valeurs absolues

-normes en fonction de l’âge Evolution en nombre absolus des sous-populations

lymphocytaires en fonction de l'âge

0

1

2

3

4

5

6

7

8

neon

atal (n

=35)

1w-2m

o (n=

13)

2-5mo

5-9mo

9-15m

o

15-24

mo2-5

y5-1

0y

10-16

yad

ults

âge

nom

bre

abso

lu (x

109/

L)

lymphocytesCD19+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD3+TCRab+CD3+TCRgd+CD3-CD16+56+

Déficits immunitaires combinés (T et B)

-a/ déficits immunitaires combinés sévères, lymphopénie T sévère, diminution des IgG-A-M

Cc

Mort des thymocytes/lymphocytes T-B-NK- déficit en ADA

Défaut de réarrangement de VDJ T-B-NK+

déficit RAG1/2, Artemis, Ligase IV Anomalies du TCR ou du pré-TCR T-B+NK+

CD45, CD3E, CD3D, CD3G, CD3Z, ZAP70 Défaut de signalisation cytokinique

déficit IL-2RG, JAK3 T-B+NK- IL-7RA T-B+NK+

Exemple de DICS T-B+NK-

Apport de la cytométrie en flux:

Expression de la chaîne IL-2Rγ négativeàT-B+NK-

Expression de la chaîne IL-2Rγ+ mais Il-7Rα -àT-B+NK+

Déficits immunitaires combinés (T et B)

-b/ déficits immunitaires combinés lymphopénie T variable, B présents,

Ig normales ou diminuées plus de 20 types

Déficit CMH de classe II: lymphopénie T CD4, diminution IgG-A, taux élevé ou normal IgM (voir déficits humoraux)

Facteurs de transcription (CIITA, RFX-ANK, RFX5, RFXAP)

Apport de la cytométrie en flux

Syndrome d’Omenn: T présents mais hétérogénéité restreinte diminution des IgG-A-M sauf IgE, hyperéosinophilie Différentes mutations hypomorphiques: le plus souvent RAG1

ou RAG2, Artémis, IL7RA.

IOTest® Beta Mark PN IM3497 TCR Vβ Repertoire Kit

Clonogramme: expression de la diversité des TCR Vβ

expansion de lymphocytes T activés DR+ mémoires CD45RO+ avec un répertoire TCR Vβ restreint, oligoclonal

Déficits immunitaires humoraux -a/ diminution Ig (au moins 2 isotypes) T présents, B normaux ou diminués

Défauts d’expression de marqueurs B de surface

Déficit en CD81: fillette de 6 ans d’origine marocaine, hypo IgG, IgA suboptimales, IgM normales, thrombopénie, syndrome inflammatoire, absence de réponse vaccinale

M.C. van Zelm, J. Smet, B. Adams, F. Mascart, L. Schandené et al. J. Clin Invest. 120(4), 1265-1274, 2010

Contrôle Patient

Apport de la cytométrie en flux

Déficit immunitaire commun variable (DICV): Fourre-tout de ttes les hypo IgG (hypo IgA ou IgM), mutation non définie, diminution des lymphocytes B mémoires switchés

Lymphocytes totaux Lymphocytes B

B naïfs CD19+CD27-IgM+IgD+ B mémoires CD19+CD27+IgM++IgD+ (Zone marginale de la rate) B mémoires switchés CD19+CD27+IgD-IgM-(IgG+,IgA+)

NB: normes suivant l’âge

-b/ diminution IgG et A, IgM normale ou élevée T présents, B normaux ou diminués

Déficits immunitaires humoraux

Défaut de coopération T-B/monocytes au sein des organes lymphoïdes, essentielle pour la commutation isotypique des Ig

Apport de la cytométrie en flux

CD69   CD40L  

4  hrs  in  vitro  s?mula?on  of  PBMC                            (PMA+Ionomycin)  

Déficit CD40L: T présents, diminution IgG-A, taux élevé ou normal IgM, neutropénie transitoire cf déficit en CD40

absence d’expression du CD40L (CD154) par les lymphocytes T activés

Déficits immunitaires humoraux

-c/ diminution Ig (tous les isotypes) T présents, B fortement diminués ou absents

7 types décrits

Agammaglobulinémie de Bruton ou agammaglobulinémie liée à X: -mutation du gène BTK (Bruton Tyrosine Kinase) qui code pour une tyrosine kinase impliquée dans l’ontogénie B

Apport de le cytométrie en flux: marqueurs intracytoplasmiques

Déficits de régulation du système immunitaire

-a/ lymphohistiocytoses hémophagocytaires ou syndromes hémophagocytaires:

génétiques acquises

-causée par la prolifération incontrôlée de lymphocytes activés et d’histiocytes secrétant de grandes quantités de cytokines inflammatoires

-hémophagocytose

Défauts cytotoxiques des T CD8 et des NK

Défauts moléculaires associés aux formes génétiques peuvent affecter différentes étapes de l’exocytose des granules

cytotoxiques vers la cible

Activité cytotoxique

CD107a=LAMP « lysosomal associated membrane proteins »

CD107a

Cytométrie en flux: Test de dégranulation CD107a

-sang total (IL-2) incubé avec K562 et PHA

CD3-­‐  CD1

6+CD

56+  

No  s?mula?on            K562  

CD107  

Control    

Pa?ent  1  

Pa?ent  2  

Pa?ent  3  

CD3-­‐  CD1

6+CD

56+  

Perforin    

Griscelli FHLH-3 FHLH-2

Déficits de régulation du système immunitaire

-b/ syndromes avec autoimmunité:

Le syndrome lymphoprolifératif avec auto-immunité ou autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS): -autoimmunité, lymphadénopathie chronique non-maligne +- splénomégalie -déficits de l’apoptose lymphocytaire, 5 sous-types

Mécanismes de l’apoptose Fas-induite

-mutation homozygote du gène Fas ALPs 0

-mutation hétérozygote du gène Fas (TNFRSF6) ALPS type Ia

-mutation du gène caspase-10 ou 8 ALPs type IIa

-mutation hétérozygote du gène FasL ALPS type Ib

-mutation inconnue, ou mutation somatique ALPS type III

C.  Picard    IL-­‐10  et  FasL  soluble  dans  le  sérum    

Cytométrie en flux: défauts subtils Accumulation dans le sang et les organes lymphoïdes secondaires d’une population polyclonale de lymphocytes T TCRαβ doubles négatifs CD4-CD8- (TCRαβ CD4-CD8->2 % des CD3+)

Contrôle   Pa?ent  

àTCRαβ CD4-CD8-=7 % des CD3+ àTCRαβ CD4-CD8-=1.51 % des CD3+

Apoptose Fas-induite des lymphoblastes PHA

Contrôle anti-Fas 1 µg/ml anti-Fas 0.1 µg/ml anti-CD3 1 µg/ml anti-CD3 0.1 µg/ml

J=0 30%J=1 30% 38% 34% 38% 40%J=2 64% 55% 57% 52% 58%J=3 78% 79% 84% 73% nd

Résultats exprimés en % de cellules apoptotiques

Conclusion: déficit de l’apoptose Fas-médiée

Apoptose Fas-induite des lymphoblastes- lignée PHA IL-2

0102030405060708090

0 1 2 3

Jours d'incubation

% a

popt

ose

anti-Fas CH11

Déficits de régulation du système immunitaire

-b/ syndromes avec autoimmunité:

Le syndrome IPEX « immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked » -eczéma, manifestations autoimmunes importantes, sévères et précoces (entéropathie, diabète, thyroïdite, et cytopénie) avec des auto-anticorps -déficits (absence ou fonction) des T régulateurs

Mutations dans le gène FOXP3

               Cytométrie en flux: détection d’un marqueur nucléaire

   -facteur de transcription FoxP3

Déficits de l’immunité innée

Déficits de l’adhésion leucocytaire -chimiotactisme PMN anormal (PMN++ en périphérie), foyer d’infections sans pus, cicatrisation lente (chute tardive du cordon) -déficit d’expression de la chaîne β de 3 intégrines: CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18

Apport de la cytométrie en flux

C.  Picard    

Déficits de l’immunité innée

Déficits de l’explosion oxydative -granulomatose septique chronique, XL -déficit dans le complexe NADPH oxydase (sous-unité gp91phox)àproduction déficiente d’H2O2 et de superoxyde par les cellules phagocytaires, formation de granulomes

Cytométrie en flux: test fonctionnel

-  Stimulation PMN avec PMA

-  H2O2 production -  conversion du colorant

intracellulaire dihydrorhodamine-1,2,3 en un composé fluorescent lié à l’oxydation

fluorescence  

Even

ts    

Classiquement : réduction du nitrobleu de tétrazolium (NBT)

Déficits de l’immunité innée

Syndrome de prédisposition mendélienne aux infections mycobactériennes -sensibilité accrue à Mycobacterium bovis du BCG et/ou mycobactéries atypiques (M Avium..) -infection associée fréquente: cf salmonellose -aujourd’hui 7 défauts génétiques identifiés <<mutations identifiées dans gènes affectant l’axe IL-12/IL-23/IFN-γ

IL12RB1, IL12B, IFNGR1, IFNGR2, STAT1

Axe IL-12/IFN-γ Defects  in  the  collabora?on  between  APC  and  T  lymphocytes:                  defects  of  the  IL-­‐12;  IL-­‐23/  IFN-­‐γ  signaling  pathway  

Phagocytic cells/ dendritic cells NK cells/ T lymphocytes

Exemples de deux patients: 1/ Patient de 30 ans, d’origine martiniquaise Admis pour: T° 38.5°C avec frissons et sudations nocturnes < 3-4 semaines, perte de poids +++ (10 kg en 3 semaines), dyspnée avec obstruction des voies aériennes supérieures, grosses adénopathies cervicales fluctuantes <adénite cervicale à Salmonella D 2/Patiente de 37 ans , d’origine belge Adénite cervicale avec fièvre, PCR identifie 16sr DNA of Mycobacterium Tilburgii

Déficit d’expression de la chaîne β 1 du récepteur à l’IL-12 par les lymphocytes périphériques (sang total)

TEMOIN

PATIENT

Cytométrie en flux

Cytométrie en flux: ce n’est pas tout

Control  

-d’autres cellules cf cellules dendritiques

-tests fonctionnels: prolifération, profil cytokinique, facteurs de transcription, phosphoprotéines…;

Hyper  IgE  syndrome  (Job  syndrome  )  

Th17  defect  <  STAT3  muta?ons    

•  Merci pour votre attention