به نام پروردگار
Post on 24-Feb-2016
45 Views
Preview:
DESCRIPTION
Transcript
پروردگار نام به
یادآوریتحقیق؟ • موضوع انتخاب و بندی گروه
– - : همراه صفحه چند در تحقیق پاورپوینت ارایه نحوهمنابع
بیوتکنولوژی • تعریفکالسیک – بیوتکنولوژی از مثالهاییمدرن – بیوتکنولوژی
چیست؟ • کلونینگچیست؟ • تراریختشده؟ • سازی شبیه انسان
بیوتکنولوژی
جلسه دومPCR
واكنشزنجيرهايپليمرازPolymerase chain reaction
Purine
Pyrim idine
GuanineAdenine
Cytosine Thymine Uracil
Thymine Adenine
Cytosine
Guanine
Adenine
Guanine
ThymineCytosine
Leading Strand
Laging Strand
3’
5’3’
5’
5’5’
5’3’
3’5’3’3’
5’
Single strand binding proteins
DNA Polymerase
Okazaki fragment
RNA Primers
Primase
5’ 3’5’
Helicase
سازی DNAهمانند
سازی همانند در کلیدی های DNAآنزیم
• DNA Polymerase• DNA Ligase• Primase• Helicase• Topoisomerase• Single strand binding protein
PCR چیست؟از • خاصی قسمت آن در که الگو DNAروشی
تکثیر گرمایی سیکلهای در پلیمراز آنزیم توسطگردد می
•: باکتری در ژن کلونینگ روش جایگزینتر – سادهتر – هزینه کمسریعتر–
تاریخچهموليسیكر1985•برندهنوبل1993•
دالیل پیشرفت این روش
•DNAپلیمرازمقاومبهحرارتدستگاههایترمالسایکلر•
موادموردنیازآبدیونیزه•Taq)پلیمراز)•(dNTPsنوکلئوتید)•پرایمرها•بافرآنزیم•(Mgکوفاکتور)•(DNAالگو)•
PCRمراحل واکنش دناتوراسیوناولیه•مراحلیکهچندینسیکلتکرارمی•
شونددناتوراسیون–اتصالپرایمرها–طویلشدن–
طویلشدننهایی•
Overview of PCR
.1Temperature Cycling
Denaturation 94°Annealing 55°Extension 72°
2 .Every cycle DNA between primers is duplicated
PCR Amplification
Exponential Amplification
PCRMelting
94 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
5’3’3’5’
PCRMelting
94 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
3’5’
5’3’
Heat
PCRMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
3’5’
5’3’5’
5’
Melting94 oC
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
30x
3’5’
5’3’
Heat
Heat
5’
5’
5’
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
30x
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
30x
3’5’
5’3’ 5’
5’5’
5’
5’
5’
Heat
Heat
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
30x
3’5’
5’3’ 5’
5’5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
Fragments of defined length
PCRMelting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
30x
3’5’
5’3’ 5’
5’5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
Plateau phase
Linear phase
Exponential phaseEnd point analysis on agarose gels
Cycles
PCR
Pro
duct
Polymerase Chain Reaction
الکتروفورز
در موثر PCRعوامل
• Reagent and instrument • User mistakes• Template • Primers
کاربردها برخیژنتیکی • بیماری تشخیصافراد • هویت تعیینویروسی • بیماری تشخیصتوسط • ویروسی Real-Time PCRتیترکلونینگ • ژن برای ژنی خاص قطعه تکثیرکلونینگ • ژن برای جهش ایجادکلونینگ • ژن برای خاص قطعات کردن اضافهژن • بیان RT-PCRبررسی
بر ای Real Time PCRمقدمه
What’s Wrong With Agarose Gels?• *Low sensitivity• *Non-automated
• *Size-based discrimination only• *Results are not expressed as numbers• *Ethidium bromide staining is not very
quantitative
Threegeneralmethodsforthequantitativedetection :1-TaqMan,Beacons,Scorpions
2 .Hybridisationprobes3 .DNA-bindingagents
(SYBRGreen)Thefirsttwomethodsarespecificformats.
Fluoresces when boundto dsDNA
DNAPolymerase5'exonucleaseactivity
Polymerization
5’3’
5’5’3’5’
ForwardPrimer
ReversePrimer
TaqMan® ProbeR Q
Taqman probes are “hydrolysis” probes
Displacement
5’3’
5’5’3’5’
ForwardPrimer
ReversePrimer
RQ
Hydrolysis
5’3’5’
5’3’5’
Q
R
Polymerization Completed
5’
3’5’
5’3’5’
R Q
FRETEmission
P
Excitation
Amplicon
Hybridization probes
Denaturation
95oC
FRET Emission
P
ExcitationTm
55oC
Primer/Probe Annealing
FluorimeterReading
72oC
Primer Extension
MolecularBeacons
Scorpion
Product confirmation
Melting curve analysis
Melting peaks
SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS
threshold
Ct
Real-Time PCR Applications
• Quantification of DNA and RNA• Identify of presence and copy number of
sequence– Identification and quantification of pathogen– Diagnosis of disease condition
• Quantitation of Gene Expression• Array Verification
Real-timePCRadvantages
*amplificationcanbemonitoredreal-time *nopost-PCRprocessingofproducts
(highthroughput,lowcontaminationrisk ) *ultra-rapidcycling)30minutesto2hours(
*requirementof1000-foldlessRNAthanconventionalassays
(3 picogram=onegenomeequivalent) *detectioniscapabledowntoa2-foldchange
*confirmationofspecificamplificationbymeltingpointanalysis
*mostspecific,sensitiveandreproducible *notmuchmoreexpensivethanconventionalPCR
(exceptequipmentcost)
Real-timePCRdisadvantages
*notidealformultiplexing *settinguprequireshightechnicalskillandsupport
*highequipmentcost
* * * *DNAcontamination)inmRNAanalysis(
باشین • موفق
top related