به نام پروردگار

پروردگار نام به

یادآوریتحقیق؟ • موضوع انتخاب و بندی گروه

– - : همراه صفحه چند در تحقیق پاورپوینت ارایه نحوهمنابع

بیوتکنولوژی • تعریفکالسیک – بیوتکنولوژی از مثالهاییمدرن – بیوتکنولوژی

چیست؟ • کلونینگچیست؟ • تراریختشده؟ • سازی شبیه انسان

بیوتکنولوژی

جلسه دومPCR

واكنش‌زنجيره‌اي‌پلي‌مرازPolymerase chain reaction

Purine

Pyrim idine

GuanineAdenine

Cytosine Thymine Uracil

Thymine Adenine

Cytosine

Guanine

Adenine

Guanine

ThymineCytosine

Leading Strand

Laging Strand

3’

5’3’

5’

5’5’

5’3’

3’5’3’3’

5’

Single strand binding proteins

DNA Polymerase

Okazaki fragment

RNA Primers

Primase

5’ 3’5’

Helicase

سازی DNAهمانند

سازی همانند در کلیدی های DNAآنزیم

• DNA Polymerase• DNA Ligase• Primase• Helicase• Topoisomerase• Single strand binding protein

PCR چیست؟از • خاصی قسمت آن در که الگو DNAروشی

تکثیر گرمایی سیکلهای در پلیمراز آنزیم توسطگردد می

•: باکتری در ژن کلونینگ روش جایگزینتر – سادهتر – هزینه کمسریعتر–

تاریخچه‌موليس‌یكر‌1985•‌برنده‌نوبل1993•

دالیل پیشرفت این روش

•DNAپلیمراز‌مقاوم‌به‌حرارتدستگاههای‌ترمال‌سایکلر•

مواد‌مورد‌نیازآب‌دیونیزه•Taq)پلیمراز)•(dNTPsنوکلئوتید‌)•پرایمرها•بافر‌آنزیم•(Mgکوفاکتور)•(DNAالگو)•

PCRمراحل واکنش دناتوراسیون‌اولیه•مراحلی‌که‌چندین‌سیکل‌تکرار‌می‌•

شونددناتوراسیون–اتصال‌پرایمرها–طویل‌شدن–

طویل‌شدن‌نهایی•

Overview of PCR

.1Temperature Cycling

Denaturation 94°Annealing 55°Extension 72°

2 .Every cycle DNA between primers is duplicated

PCR Amplification

Exponential Amplification

PCRMelting

94 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

5’3’3’5’

PCRMelting

94 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

3’5’

5’3’

Heat

PCRMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

3’5’

5’3’5’

5’

Melting94 oC

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

30x

3’5’

5’3’

Heat

Heat

5’

5’

5’

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

30x

3’5’

5’3’5’

5’

5’

5’

5’

5’

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

30x

3’5’

5’3’ 5’

5’5’

5’

5’

5’

Heat

Heat

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

30x

3’5’

5’3’ 5’

5’5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

Fragments of defined length

PCRMelting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

30x

3’5’

5’3’ 5’

5’5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

Plateau phase

Linear phase

Exponential phaseEnd point analysis on agarose gels

Cycles

PCR

Pro

duct

Polymerase Chain Reaction

الکتروفورز

در موثر PCRعوامل

• Reagent and instrument • User mistakes• Template • Primers

کاربردها برخیژنتیکی • بیماری تشخیصافراد • هویت تعیینویروسی • بیماری تشخیصتوسط • ویروسی Real-Time PCRتیترکلونینگ • ژن برای ژنی خاص قطعه تکثیرکلونینگ • ژن برای جهش ایجادکلونینگ • ژن برای خاص قطعات کردن اضافهژن • بیان RT-PCRبررسی

بر ای Real Time PCRمقدمه

What’s Wrong With Agarose Gels?• *Low sensitivity• *Non-automated

• *Size-based discrimination only• *Results are not expressed as numbers• *Ethidium bromide staining is not very

quantitative

Three‌general‌methods‌for‌the‌quantitative‌detection :1-TaqMan,‌Beacons,‌Scorpions

2 .Hybridisation‌probes3 .DNA-binding‌agents

(SYBR‌Green)The‌first‌two‌methods‌are‌specific‌formats.

Fluoresces when boundto dsDNA

DNA‌Polymerase‌5'‌exonuclease‌activity

Polymerization

5’3’

5’5’3’5’

ForwardPrimer

ReversePrimer

TaqMan® ProbeR Q

Taqman probes are “hydrolysis” probes

Displacement

5’3’

5’5’3’5’

ForwardPrimer

ReversePrimer

RQ

Hydrolysis

5’3’5’

5’3’5’

Q

R

Polymerization Completed

5’

3’5’

5’3’5’

R Q

FRETEmission

P

Excitation

Amplicon

Hybridization probes

Denaturation

95oC

FRET Emission

P

ExcitationTm

55oC

Primer/Probe Annealing

FluorimeterReading

72oC

Primer Extension

Molecular‌Beacons

Scorpion

Product confirmation

Melting curve analysis

Melting peaks

SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS

threshold

Ct

Real-Time PCR Applications

• Quantification of DNA and RNA• Identify of presence and copy number of

sequence– Identification and quantification of pathogen– Diagnosis of disease condition

• Quantitation of Gene Expression• Array Verification

Real-time‌PCR‌advantages

*amplification‌can‌be‌monitored‌real-time *no‌post-PCR‌processing‌of‌products

(high‌throughput,‌low‌contamination‌risk ) *ultra-rapid‌cycling‌)30‌minutes‌to‌2‌hours(

*requirement‌of‌1000-fold‌less‌RNA‌than‌conventional‌assays

(3 picogram‌=‌one‌genome‌equivalent) *detection‌is‌capable‌down‌to‌a‌2-fold‌change

*confirmation‌of‌specific‌amplification‌by‌melting‌point‌analysis

*most‌specific,‌sensitive‌and‌reproducible *not‌much‌more‌expensive‌than‌conventional‌PCR

(except‌equipment‌cost)

Real-time‌PCR‌disadvantages

*not‌ideal‌for‌multiplexing *setting‌up‌requires‌high‌technical‌skill‌and‌support

*high‌equipment‌cost

* * * *DNA‌contamination‌)in‌mRNA‌analysis(

باشین • موفق