Zeytin Çeşitlerindeki Antioksidan Kapasite ve PPO Enzimi İle İlişkisinin Araştırılması

Zeytin Çeşitlerindeki Antioksidan Kapasite ve PPO

Enzimi İle İlişkisinin Araştırılması

Hazırlayan: Arş.Gör. Nahit Hazırlayan: Arş.Gör. Nahit GENÇERGENÇER

Danışman: Prof.Dr. Oktay Danışman: Prof.Dr. Oktay ARSLANARSLAN

Çalışmamızda Aşağıdaki Çalışmamızda Aşağıdaki Hedefler Belirlenmiştir;Hedefler Belirlenmiştir;

Zeytin yağlarındaki Zeytin yağlarındaki -tokoferol, ferulik asit, kafeik -tokoferol, ferulik asit, kafeik asit ve tirozolün konsantrasyonlarının HPLC ile asit ve tirozolün konsantrasyonlarının HPLC ile saptanması saptanması

Zeytinlerdeki PPO’nun katalitik aktivitesinin (KZeytinlerdeki PPO’nun katalitik aktivitesinin (KMM ve ve VVmaxmax) belirlenmesi) belirlenmesi

Enzim aktivitesi üzerine pH ve sıcaklık etkisinin Enzim aktivitesi üzerine pH ve sıcaklık etkisinin araştırılmasıaraştırılması

Türler arasındaki PPO aktivitesi ile antioksidanların Türler arasındaki PPO aktivitesi ile antioksidanların miktarı arasındaki korelasyonun incelenmesimiktarı arasındaki korelasyonun incelenmesi

Neden Farklı Zeytin Çeşitleri?

Çünkü; türden Çünkü; türden türe antioksidan türe antioksidan madde miktarı ve madde miktarı ve polifenol oksidaz polifenol oksidaz enziminin enziminin aktivitesi değiştiği aktivitesi değiştiği düşünülmektedir.düşünülmektedir.

PPO ile Antioksidanlar Arasında

Nasıl Bir İlişki Var?

CH2CH2OH

OH

Polifenol oksidaz

1/2 O2 H2O

CH2CH2OH

OHOH

H2O1/2 O2

Polifenol oksidaz

CH2CH2OH

O

O

TirosolMonofenolaz aktivitesi

Hidroksitirosol3,4-kinonfeniletanol

Difenolaz aktivitesi

Zeytin Ve Zeytin Yağı

Zeytin gıda olarak, zeytin yağının eldesin de ve Zeytin gıda olarak, zeytin yağının eldesin de ve yenilebilir meyveleri için yetiştirilmektedir.yenilebilir meyveleri için yetiştirilmektedir.

Zeytinyağı esansiyel yağ asitlerinin kaynağı ve Zeytinyağı esansiyel yağ asitlerinin kaynağı ve yağda çözünen A,D,E,K vitaminlerinin yağda çözünen A,D,E,K vitaminlerinin deposudur.deposudur.

Zeytin yağı tüketen insanlarda kanser oranının Zeytin yağı tüketen insanlarda kanser oranının az olduğu hakkında bir çok araştırma vardır.az olduğu hakkında bir çok araştırma vardır.

Zeytin Yağındaki Fenol Zeytin Yağındaki Fenol Bileşikleri Bileşikleri

Zeytin yağında 50 ile 1000 mg/kg arasında basit Zeytin yağında 50 ile 1000 mg/kg arasında basit ve kompleks fenol bileşikleri vardır.ve kompleks fenol bileşikleri vardır.

Zeytin yağı; tokoferoller, karotenoidler ve fenolik Zeytin yağı; tokoferoller, karotenoidler ve fenolik bileşikler gibi doğal antioksidanları içerir.bileşikler gibi doğal antioksidanları içerir.

Fenolik bileşikler arasında ferulik asit, kafeik asit, Fenolik bileşikler arasında ferulik asit, kafeik asit, gallik asit, kumarik asit, tirozol ve hidroksitirozol gallik asit, kumarik asit, tirozol ve hidroksitirozol en çok yer alır. en çok yer alır.

AntioksidanlarAntioksidanlar

Reaktif oksijen türlerinin oluşumunu ve Reaktif oksijen türlerinin oluşumunu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için vücuttaki savunma sistemlerine için vücuttaki savunma sistemlerine AntioksidanlarAntioksidanlar denir. denir.

Canlı dokularda istenmeyen oksidasyon Canlı dokularda istenmeyen oksidasyon reaksiyonlarını önleyen maddeler reaksiyonlarını önleyen maddeler ANTİOKSİDANLAR’dır . ANTİOKSİDANLAR’dır .

Vitaminler ve mineraller yanında bazı enzimler de Vitaminler ve mineraller yanında bazı enzimler de antioksindandırlar. antioksindandırlar.

Antioksidanlar, oksidatif stresle oluşan serbest Antioksidanlar, oksidatif stresle oluşan serbest radikaller olarak adlandırılan zararlı moleküllere radikaller olarak adlandırılan zararlı moleküllere karşı koruyucu etkiye sahiptirler.karşı koruyucu etkiye sahiptirler.

Antioksidan Nedir?Antioksidan Nedir?

Serbest Radikaller Nelerdir?Serbest Radikaller Nelerdir?

Üzerinde elektron fazlalığı veya eksikliği nedeniyle yüklü olan kimyasal olarak aktif atom veya moleküllerdir.

Serbest Radikaller özellikle reaktif tür oksijen içerirler.

Bunlar; hidrojen peroksit, alkoksit ve ozon gibi eşleşmemiş elektronu bulunmayan oksijen türevleri ile hidroksil, peroksil, alkoksil, azot oksit, azot trioksit ve süperoksit radikallerini içerir.

Serbest Radikaller Nasıl Oluşur?

Serbest radikaller hem vücudun içinde hem de Serbest radikaller hem vücudun içinde hem de dışındaki etkenler tarafından meydana gelir. dışındaki etkenler tarafından meydana gelir.

Oksijenli solunum, metabolizma ve enfeksiyon gibi Oksijenli solunum, metabolizma ve enfeksiyon gibi vücut içinden kaynaklanan olayların yanında; vücut içinden kaynaklanan olayların yanında; sigara, alkol, x-ışınları, güneş ışını ve kirlilik gibi dış sigara, alkol, x-ışınları, güneş ışını ve kirlilik gibi dış kaynaklı çevresel faktörlerin etkisiyle de serbest kaynaklı çevresel faktörlerin etkisiyle de serbest radikaller oluşur. radikaller oluşur.

*Sigara ve alkol yanında strese bağlı olarak ta vücutta bu moleküllerin üretimi gerçekleşmektedir.

Serbest Radikallerin Zararları Nelerdir?

Serbest radikaller vücudun her yerinde Serbest radikaller vücudun her yerinde elektron verip yada alabilirler. elektron verip yada alabilirler. Böylelikle hücreler, proteinler ve Böylelikle hücreler, proteinler ve DNA’ya zarar verebilirler. DNA’ya zarar verebilirler.

Antioksidanlar; Antioksidanlar; serbest radikalleri serbest radikalleri etkisiz hale getirerek etkisiz hale getirerek oksidasyon prosesini oksidasyon prosesini engellerler. Bu engellerler. Bu esnada kendileri esnada kendileri okside olurlar. Bu okside olurlar. Bu nedenle antioksidan nedenle antioksidan kaynaklı gıdalara kaynaklı gıdalara sürekli ihtiyacımız sürekli ihtiyacımız vardır.vardır.

Antioksidanların Fonksiyonu

Zeytin Yağındaki AntioksidanlarZeytin Yağındaki Antioksidanlar

1-Tokoferoller:1-Tokoferoller: T Tokoferol türevlerinin genel bir adı okoferol türevlerinin genel bir adı vitamin E’dir ve bu bileşikler E vitamininin vitamin E’dir ve bu bileşikler E vitamininin aktivitesine sahiptir. Bu yüzden, gösterdikleri aktivitesine sahiptir. Bu yüzden, gösterdikleri aktiviteler bazı hastalıklarda antioksidan etkilerinin aktiviteler bazı hastalıklarda antioksidan etkilerinin olduğunu ispatlamak için oldukça önemlidir. olduğunu ispatlamak için oldukça önemlidir.

E vitamini hücre membranlarında bulunan en E vitamini hücre membranlarında bulunan en büyük zincir kıran antioksidandır. büyük zincir kıran antioksidandır.

Kalp hastalıkları, kanser, katarakt ve sinir Kalp hastalıkları, kanser, katarakt ve sinir hastalıkları gibi rahatsızlıkların gelişmesini hastalıkları gibi rahatsızlıkların gelişmesini önlemede çok etkilidir. önlemede çok etkilidir.

Vitamin E’nin farklı formları hücre Vitamin E’nin farklı formları hücre membranında farklı derecelerde antioksidan etki membranında farklı derecelerde antioksidan etki gösterir. gösterir. -tokoferol en çok bulunan, vücutta en -tokoferol en çok bulunan, vücutta en yüksek canlı potansiyeline ve en kuvvetli etkiye sahip yüksek canlı potansiyeline ve en kuvvetli etkiye sahip izomerdir. Bu izomer, yağda çözülebildiği için hücre izomerdir. Bu izomer, yağda çözülebildiği için hücre membranının yapısının çoğunu oluşturan yağ membranının yapısının çoğunu oluşturan yağ asitlerinin serbest radikaller ile zarar görmesini asitlerinin serbest radikaller ile zarar görmesini önleyen tek formudur.önleyen tek formudur.

Tokoferoller; hücre membranı içindeki doymamış Tokoferoller; hücre membranı içindeki doymamış yağ asitlerini ve LDL’nin okside olmasını önlerken yağ asitlerini ve LDL’nin okside olmasını önlerken kalp hastalıklarının azalmasında, alzaimer kalp hastalıklarının azalmasında, alzaimer hastalığını geciktirmede ve kanserin hastalığını geciktirmede ve kanserin önlenmesinde çok fazla etkiye sahiptir .önlenmesinde çok fazla etkiye sahiptir .

Tokoferollerin antioksidan mekanizması; Tokoferollerin antioksidan mekanizması; 6-hidroksil.6-hidroksil.

CH3

HO

CH3

CH3

O

CH3CH3CH3CH3

-tokoferol-tokoferol

2-Ferulik Asit: Antioksidan etkiyi sağlamak için fenolik OH grupları ile serbest radikallere hidrojenler verir. Radikal ve aktif oksijen türlerini yok etme etkisine sahip olan ferulik asit, aktif oksijen üretimine sebep olan UV ışığı absorplar.

HO OH

O

OH3C

3-Kafeik asit:3-Kafeik asit: Zeytin yağının Zeytin yağının oksidasyonun da kendini ilk feda edenler oksidasyonun da kendini ilk feda edenler arasındadır. Yapısı ferulik aside çok arasındadır. Yapısı ferulik aside çok benzer.benzer.

HO

HO OH

O

4-Tirozol: Zihinsel ve fiziksel yorgunluklarda, hafıza kayıplarında yardımcı etkiye sahiptir. Diğer fenolik bileşikler gibi yapısındaki hidroksil grubundan bir hidrojeni serbest radikellere vererek onları etkisiz hale getirir. Bunun sonucunda da kendisi okside olur.

HOOH

Enzimatik Kararma

Meyve ve sebzelerin depolanması esnasında ve çarpma, kesme, kabuk soyma, dilimleme gibi mekanik zedelenmeler sonucu bazı renk değişimleri ortaya çıkmaktadır. Pembeden, mavimsi siyaha kadar olan farklı tonlardaki bu renk değişimlerine kararma denir.

Enzimatik kararmanın olabilmesi için polifenol oksidaz enzimi, bunun etkilediği fenolik madde ve moleküler oksijenin bir arada bulunmaları gerekir.

PPO NEDİR ?PPO NEDİR ?

PPO enzimi birçok PPO enzimi birçok meyve ve sebzede meyve ve sebzede bulunan ve bitkinin bulunan ve bitkinin hastalıklara karşı hastalıklara karşı direncini arttıran bir direncini arttıran bir metalo enzimdir. Gıda metalo enzimdir. Gıda endüstrisindeki önemi endüstrisindeki önemi ise , enzimatik ise , enzimatik kararmaya neden kararmaya neden olmasından olmasından kaynaklanmaktadır.kaynaklanmaktadır.

GIDA ÜRÜNLERİ NEDEN GIDA ÜRÜNLERİ NEDEN KARARIR?KARARIR?

Enzimatik Enzimatik Kararma:Kararma:

Polifenol oksidaz Polifenol oksidaz enzimienzimi

Enzimatik Enzimatik Olmayan Kararma:Olmayan Kararma:

Mailard reaksiyonuMailard reaksiyonu

Enzimatik Kararma Enzimatik Kararma ReaksiyonuReaksiyonu

OH

OH

PPO+O2

O

O

Melanin Pigmentleri

Kararmanın ÖnemiKararmanın Önemi

İnsan ve çevre İnsan ve çevre sağlığı.sağlığı.

Damak zevki.Damak zevki. Antioksidan Antioksidan

kapasitenin kapasitenin düşmesidüşmesi

Koku Renk Tat Antioksidan

Kapasite

OH

OH

Kararmanın ÖnlenmesiKararmanın Önlenmesi

pHpH

İyonik şiddetİyonik şiddet

SıcaklıkSıcaklık

İnhibitörİnhibitör

Yapılan Laboratuar Çalışmaları-1Yapılan Laboratuar Çalışmaları-1

1.Optimum pH1.Optimum pH

2. K2. KMM, Vmax çalışması, Vmax çalışması

3.Denatürasyon-Renatürasyon 3.Denatürasyon-Renatürasyon çalışmasıçalışması

Optimum pH nedir?Optimum pH nedir?

0

100

200

300

400

500

600

700

800

4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5

pH

Ak

tiv

ite

(U

/mL

da

k)

Bir enzimin optimum pH’ sı maksimum Bir enzimin optimum pH’ sı maksimum aktivite gösterdiği pH dır.aktivite gösterdiği pH dır.

Optimum pH (7)

Optimum pH çalışma sonuçlarıOptimum pH çalışma sonuçları

6,26,36,46,56,66,76,86,9

77,1

DOMAT EDREMİT KİRAZ GEMLİK USLU

Zeytin

pH

KKMM nedir? nedir?

KKMM: Maksimum hızın yarısına ulaşmak için gereken : Maksimum hızın yarısına ulaşmak için gereken substrat konsantrasyonuna Ksubstrat konsantrasyonuna KMM denir. denir.

Enzimin substrata karşı ilgisinin bir Enzimin substrata karşı ilgisinin bir ölçüsüdür. ölçüsüdür.

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

Km =( k-1 + k2 )

k1

;

VVmaxmax nedir? nedir?

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

Vmax = k2 * ET

VVmaxmax: Enzimin katalitik aktivitesinin bir ifadesidir. : Enzimin katalitik aktivitesinin bir ifadesidir. Toplam enzimin tümünün aktif bölgesinin Toplam enzimin tümünün aktif bölgesinin substratla dolduğu andaki reaksiyon hızıdır.substratla dolduğu andaki reaksiyon hızıdır.

Micheales-Menten denklemi

V= Vmax. [S]

[S]+ Km

= +1

V

Km

Vmax

. 1

[S]

1

Vmax

Lineweaver-Burk denklemi

Lineweaver-Burk Grafiği

KKMM ve V ve Vmaxmax çalışması çalışması

 Enzim

Kaynağı 

 Optimum

pH

 Km

(mM)

 Vmax

(U/mLdak)

 Vmax / Km

GZPPO 6.5 22.491 3681.890 163.71x103

EZPPO 6.5 13.691 810.180 59.18x103

UZPPO 6.5 5.747 7183.392 1249.94x103

DZPPO 7.0 6.098 5325.381 873,30x103

KZPPO 6.5 5,251 538.474 102,55x103

Denatürasyon: Protein yapısında olan enzimlerin Denatürasyon: Protein yapısında olan enzimlerin yüksek sıcaklık, pH ve iyonik şiddet karşısında yüksek sıcaklık, pH ve iyonik şiddet karşısında üç boyutlu yapılarının kaybolması olayıdır.üç boyutlu yapılarının kaybolması olayıdır.

Renatürasyon: Denatüre edici faktörler ortadan Renatürasyon: Denatüre edici faktörler ortadan kaldırıldığında enzimin eski halini alması kaldırıldığında enzimin eski halini alması olayıdır.olayıdır.

Denatürasyon ve Denatürasyon ve RenatürasyonRenatürasyon

DZPPO

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70

t (dak)

% K

orun

an A

ktiv

ite

40

50

60

70

80

Sıcaklık(˚C)

Renatüre-D

0

10

20

30

40

50

60

70

0 10 20 30 40 50 60 70

t (dak)

% A

kti

vit

e

40

50

60

70

80

Sıcaklık (˚C)

Laboratuvar Çalışmaları-2Laboratuvar Çalışmaları-2

Her bir zeytin çeşidinden ayrı ayrı yağ çıkarıldı.Her bir zeytin çeşidinden ayrı ayrı yağ çıkarıldı.

Yağlardan tokoferolün ekstraksiyonu için Yağlardan tokoferolün ekstraksiyonu için metanol/izopropanol karışımı kullanıldı.metanol/izopropanol karışımı kullanıldı.

Ferulik asit, kafeik asit ve tirozolün Ferulik asit, kafeik asit ve tirozolün ekstraksiyonu için metanol/su karışımı ekstraksiyonu için metanol/su karışımı kullanıldı.kullanıldı.

Herbir antioksidan için değişik Herbir antioksidan için değişik konsantrasyonlar hazırlanarak HPLC’ye konsantrasyonlar hazırlanarak HPLC’ye yükleme yapıldı. Gelme zamanına karşı yükleme yapıldı. Gelme zamanına karşı absorbans grafikleri çizildi.absorbans grafikleri çizildi.

Daha sonra her bir antioksidan için Daha sonra her bir antioksidan için kalibrasyon eğrileri oluşturuldu.kalibrasyon eğrileri oluşturuldu.

Her bir zeytin yağı ekstraktı HPLC Her bir zeytin yağı ekstraktı HPLC analizine sunuldu ve antioksidanların miktar analizine sunuldu ve antioksidanların miktar tayinleri yapıldı.tayinleri yapıldı.

Zeytin türü

Tirosol(mg/kg)

Kafeik asit

(mg/kg)

Ferulik asit

(mg/kg)

Tokoferol (mg/kg)

Domat 1.34 1.69 3.43 6.35

Edremit - 1.56 - 11.3

Gemlik - - - 22.0

Kiraz 1.1 - 3.54 26.5

Uslu 9.84 1.51 3.68 33.7

Herbir zeytin türündeki antioksidanların miktarları

SONUÇLARSONUÇLAR

pH=5-8 de enzim önemli ölçüde aktivite pH=5-8 de enzim önemli ölçüde aktivite göstermektedir. göstermektedir.

Termal denatürasyon 70-80 derecelerde Termal denatürasyon 70-80 derecelerde yapılmalı.yapılmalı.

Farklı zeytin türlerinde PPO farklı katalitik Farklı zeytin türlerinde PPO farklı katalitik aktivitelere sahip.aktivitelere sahip.

Uslu zeytininde antioksidan miktarı ve PPO Uslu zeytininde antioksidan miktarı ve PPO aktivitesi en yüksek aktivitesi en yüksek

TeşekkürlerTeşekkürler