Zellkultur - virologie.medizin.uni-leipzig.devirologie.medizin.uni-leipzig.de/imag/Zellkultur.pdf · CPE Rundzellige, traubenförmige Zelldegeneration bei Viren, die sich vornehmlich

Zellkultur

• Kultivierung tierischer oder pflanzlicher Zellen in einem Nährmedium außerhalb des Organismus

• Zelllinien sind Zellen einer Gewebeart, die sich im Lauf dieser Zellkultur unbegrenzt fortpflanzen können (Permanente Zelllinien)

• Es werden sowohl immortalisierte (unsterbliche) Zelllinien als auch primäre Zellen kultiviert (Primärkultur)

• Prim ärkultur = eine nicht immortalisierte Zellkultur, die direkt aus einem Gewebe gewonnen wurde

Zellkultur

ZelllinienZelllinie Herkunft Spezies Gewebe Morphologie

HEK-293 human embryonic Mensch Niere EpithelKidney

HeLa Henrietta Lacks Mensch Zervixkarzinom Epithel

CHO Chinese hamster Hamster Ovarien Epithelovary

Sf-9 Spodoptera Insekt Ovar Epithelfrugiperda (Nachtfalter)

bEnd.3 brain endothelial Maus Gehirn/Cortex Endothel

HEK-293 Zellen HeLa-Zellen

Adhärente CHO-Zellen Sf-9-Zellen

Zelllinien

Zellkulturlabor und Einrichtung

Zellkulturmedien

Zusammensetzung von Standardmedien:anorganische Salze AminosäurenKohlenhydrateVitaminePeptide und ProteineLipide und FettsäurenSpurenelemente

Medienzusätze

L-GlutaminNatriumpyruvatNichtessentielle AminosäurenNatriumbicarbonatPhenolrotSerum/ fetales Kälberserum

Zellkulturmethoden zum Nachweis von Virusinfektionen

• Als obligat intrazelluläre Erreger können Viren nur in Zell – oder Organkulturen (sowie in Versuchstieren) angezüchtet werden!

• Konsequenzen einer viralen Infektion für die Wirtszelle hängen von Vermehrungstrategie (Replikationsstrategie) des Virus ab

• Latente Persistenz episomaler Genome (HSV)

• Zelltod (Nekrose, Apoptose) (Poliovirus)

• Immortalisierung durch Deregulierung des Zellzyklus (Papillomviren)

Konsequenzen

Zellkulturtechniken in der virologischen Diagnostik

Methode Erreger Erreger- Materialbestandteil

Virus- fast alle Viren infektiöse Abstrich,isolation Partikel Biopsie,

Liquor, Urin

PCR alle Viren Genabschnitte Serum, Plasma,Vollblut, Liquor,Biopsien, Urin,Abstriche, etc.

Antigen- Respiratorische virale Antigene zellhaltiges Material nachweis Viren (z.B. Abstriche) (Immunfluoreszenz)

Zellkulturtechniken in der virologischen Diagnostik

Methode Erreger Erregerbestandteil Material

IFA Respirations- einzelne Struktur- Exfolierte Zellen intrakt-Viren proteine Abstrichen,Sekreten,

Rachenspühlwasser

ELISA HBV, HCV, HIV z.B. HBs-Antigen, SerumHBe-Antigen,p24-Antigen

Elektronen- Gastroenteritis-, Viruspartikel Stuhlprobemikroskopie Herpes- und Bläscheninhalt

Poxviren

Goldstandard - Virusanzucht

• Virusisolation = aufwendiges Verfahren• hoher Zeitaufwand• hohe apparativer und raumtechnischer Aufwand• einige Viren nur sehr schwer und unter

eingeschränkten Bedingungen anzüchtbar (HBV, Parvovirus B19, best. Adenoviren)

• einige können gar nicht in Zellen kultiviert werden (HCV, Papillomviren, Noroviren)

Häufig für Virusisolation verwendete Zellkulturen

Wirt Virus

Primäre ZellkulturenAffennierenzellen Influenza-, Parainfluenza-, Enteroviren

Kaninchen-Nierenzellen (RK 13) HSVHumane embryonale Adenoviren, Enteroviren

Nierenzellen (HEK)

Diploide ZellkulturenHumane Fibroblaten (MRC-5 CMV, VZV, HSV, Rhinoviren,

oder WI-38) einige Enteroviren, Adenoviren, RSV

Häufig für Virusisolation verwendete Zellkulturen

Wirt Virus

Permanente ZelllinienHep 2 (humanes Epidermoid- RSV, Adenovirus, HSV,

karzinom des Larynx) Masernvirus, einige

Parainfluenza und EnterovirenA549 (humanes Lungenkarzinom) HSV, Adenoviren, Enteroviren

MDCK (Hundenierenzellen) Influenzaviren

LLC-MK2 (Rhesusaffen-Nierenzellen) ParainfluenzaRhabdomyosarkom (RD) Echoviren

Verozellen (African green monkey Coxsackie-, Masern, Mumpsviren

kidney)HeLa (humanes Zervixkarzinom) Adenoviren

Host – shut - off

1. Interaktion mit Transkriptionsapparat2. Interaktion mit zellulärer RNA-Prozessierung3. Interaktion mit Translationapparat4. Interaktion mit DNA-Synthese5. Modifikation zellulärer Proteine

Intrazelluläre Vorgänge werden in einem begrenzten Spektrum an morphologischen Veränderungen sichtbar

Zytopathischer Effekt (CPE)

CPE

Rundzellige, traubenförmige Zelldegenerationbei Viren, die sich vornehmlich

von Zelle zu Zelle, nicht aber

über das Zellkulturmedium ausbreiten

Rundzellige, diffuse Degenerationuniformer Zellen, die sich über die gesamte

Kultur ausbreiten

Polymorphzellige, diffuse Zellgenerationmit Ausbildung von sich aus dem Gewebeverband

ablösenden Zellen

CPE

Mehrkernige Riesenzellen und Synzytien

des RSV-Fusionsproteins in das bhPIV3-Virus

vakuolige (schaumzellartige) Zellveränderungkommt im Frühstadium der Ausbildung eines CPE bei zahlreichen Viren vor

Zellveränderungen sind nicht virusspezifisch und lediglich ein Hinweis auf die Infektion mit Viren!

Aus dem CPE kann nicht eindeutig auf die Identität des verursachenden Virus geschlossen werden

CPE

Identifizierung: Immunfluoreszenz, Immunperoxidasetechniken

Einige Viren rufen CPE bereits nach 24 h hervor, andere erst nach Tagen bis Wochen

CPE

Beispiel HSV auf Verozellen

Lichtmikroskopische Aufnahme Immunfluoreszenz

Störfaktoren in der Zellkultur

Kontamination durch Mykoplasmen stellt Hauptproblem dar!

Mykoplasmen positive VerozellenHoechst-Färbung

Zellkerne Verozellen

Mykoplasmen DNA(im Cytoplasma)

Mykoplasmen

• können Bakterienfilter (0,22 µm Porengröße) passieren• kleinste Vertreter der Prokaryoten• gelten als Bakterien (Klasse: Mollicutes)• haben Fähigkeit der Zellwandbildung verloren• ~ 40 % aller Zellkulturen sind in Deutschland mit

Mykoplasmen infiziert sein• Hauptkontaminationsquelle: Mensch! (Rinder)

Auswirkungen eines Mykoplasmenbefalls auf Zellkultu r

ändern Parameter des ZellstoffwechselsAuswirkung auf:� Validität� Reproduzierbarkeit� Signifikanz von Forschungsarbeiten

Auswirkungen auf Zelle:� verlangsamtes Zellwachstum� Verminderung der Zellproliferation� starke Ansäuerung des Mediums� Absterben und Auflösung der Zellen� Veränderung Membranintegrität� Begünstigung von Viruswachstum und Infektionsrate � u.v.m.

Störfaktoren in der Zellkultur

Bakterien stellen den weitaus größten Teil der Kontaminationen im Zellkulturlabor darMeist auf Missachtung bzw. Vernachlässigung der sterilen Arbeitstechniken oder auf Mängel in der Gerätewartung zurückzuführenRegelm äßige Kontrolle der Kulturen!

Bakterien

Antibiotika

Lagerung, Haltbarkeit, Stabilität und Konzentration beachten!

in der Zellkultur häufig verwendet:� Penicillin – G� Streptomycin� (Tylosin)� Gentamycin

Pilze und HefenOptische IdentifizierungAntimycotika: Amphoterzin-B

Nystatin

Störfaktoren in der Zellkultur

Scanning electron micrograph of the Fadenpilzbudding yeast Saccharomyces cerevisiae