Yeni Nesil Dizileme Prensipleri - media.klimud.orgmedia.klimud.org/Klimud_2015_Kongre/sunumlar... · Yeni Nesil Dizileme Prensipleri Doç.Dr.Hüseyin Onay Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi

Yeni Nesil Dizileme Prensipleri

Doç.Dr.Hüseyin Onay

Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik AD

1 2 3 7 8 9 4 5 6

• Yeni Nesil Dizi Analizi

• Next Generation Sequencing

• Massively Parallel Sequencing

• Second Generation Sequencing

• Paired End Sequencing

NGS

• En yaygın sekanslama teknolojisi – Sanger sekanslama – 1000-1200 bç

• HGP – Shotgun sekanslama

• DNA’ nın enzimatik ya da mekanik olarak fragmanlara ayrılıp sekanslama vektörlerine klonlanması

• Bireysel olarak okunan overlap diziler sayesinde insanın tüm genomu dizilendi

• Massively Parallel Sequencing’ in temeli

Tarihçe

• 1977- Sanger sekanslama • 1990- HPRT geni klonlandı • 1996- ABI 310 piyasaya çıktı • 1998-ABI 3700 piyasaya çıktı

– HGP çoğunlukla bu cihaz ile gerçekleştirildi

• 2001- ilk insan DNA’ sı konsensus dizisi • Sanger • Lander et al., 2001; Venter et al., 2001

• 2004- Roche 454

• 2007- İlk diploid insan genomu • Craig Venter • whole-genome shotgun sequencing • Levy et al., 2007

• 2008- İkinci diploid insan genomu • James D Watson • Roche 454 • Wheeler et al., 2008 • 1,5 milyon $

Tarihçe

Shendure J et al. Nature Biotechnology, 2008

Steinbock LJ et al., Nanotechnology, 2015

NGS-2015

NGS

• Roche GS-FLX 454 Genome Sequencer

– 454 sequencing

• ABI SOLiD analyzer

• Illumina Genome Analyzer

– Solexa technology

İkinci Nesil Sekanslama Teknolojileri

Bench-top Sequencers

İllumina Solexa Teknolojisi

İllumina Solexa Teknolojisi

İllumina Solexa Teknolojisi

5’

G

T

C

A

G

T

C

A

G

T

C

A

G

T

3’

5’

C

A

G

T

C

A

T

C

A

C

C

T

A

G

C

G

T

A

First base incorporated

Cycle 1: Add sequencing reagents

Remove unincorporated bases

Detect signal

Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat

All four labelled nucleotides in one

reaction

High accuracy

Base-by-base sequencing

No problems with homopolymer repeats

Sequencing By Synthesis (SBS)

40 MILLION CLUSTERS

PER FLOW CELL

20 MICRONS

100 MICRONS

Clonal Single Molecule Array™ Technology

1 2 3 7 8 9 4 5 6

T T T T T T T G T …

T G C T A C G A T …

Base Calling

İllumina SBS Teknolojisi

MiSeq

Uygulamalar

• DNA – Targeted Resequencing – De Novo Sequencing – Whole Exome Sequencing (WES) – Whole Genome Sequencing (WGS)

• RNA – Targeted Resequencing – mRNA Sequencing – Small RNA Sequencing – Total RNA Sequencing

• Methylation Sequencing

Hedef Zenginleştirme Metodları

Meldrum C et al. Clin Biochem Rev 2011

MiSeq

MiSeq Örnek Hazırlama

Indeksleme

PCR-Sample Pooling

Havuz 1 Havuz 2 Havuz 3 Havuz 4 Havuz 5

1+2+3+4+5

Pool 1 Grup No GEN ADI

1 BTD

2 HBB

3 PTPN11

4 MEFV

5 SRD5A2

6 OXT

7 OXT

8 OXTR

9 NPC1

10 GCK

11 MC4R

12 NPC2

13 CFTR

14 VHL

15 LOXL1

16 HNF1A

17 BCKDHB

18 SLC6A8

19 CD40

20 CD40L

21 BRCA1

22 BRCA2

23 EPM2A

24 RET

25

Pool 2 Grup No GEN ADI1 BTD

2 HBB

3 PTPN11

4 MEFV

5 SRD5A2

6 OXT

7 OXT

8 OXTR

9 NPC1

10 GCK

11 MC4R

12 NPC2

13 GBA

14 GDF6

15 LOXL1

16 HNF1A

17 GCDH

18 SLC6A8

19 CD40

20 CD40L

21 BRCA1

22 BRCA2

23 LPL

24 RET

25 WFS1

26

27

Pool 3 Grup No GEN ADI1 BTD

2 AR

3 FGFR2

4 MEFV

5 WFS1

6 OXT

7 OXT

8 OXTR

9 NPC1

10 GCK

11 MC4R

12 NPC2

13 CAV3

14 SF1

15 LOXL1

16 HNF1A

17 RMRP

18 TACİ

19 CTSK

20 BRCA1

21 BRCA2

22 SERPİNA1

23 EPM2A

24 ELA2

25 RET

P

o

o

l

1

P

o

o

l

2

P

o

o

l

3

Pool 1 Grup No GEN ADI

1 BTD

2 HBB

3 PTPN11

4 MEFV

5 SRD5A2

6 OXT

7 OXT

8 OXTR

9 NPC1

10 GCK

11 MC4R

12 NPC2

13 CFTR

14 VHL

15 LOXL1

16 HNF1A

17 BCKDHB

18 SLC6A8

19 CD40

20 CD40L

21 BRCA1

22 BRCA2

23 EPM2A

24 RET

25

Pool 2 Grup No GEN ADI1 BTD

2 HBB

3 PTPN11

4 MEFV

5 SRD5A2

6 OXT

7 OXT

8 OXTR

9 NPC1

10 GCK

11 MC4R

12 NPC2

13 GBA

14 GDF6

15 LOXL1

16 HNF1A

17 GCDH

18 SLC6A8

19 CD40

20 CD40L

21 BRCA1

22 BRCA2

23 LPL

24 RET

25 WFS1

26

27

Pool 3 Grup No GEN ADI1 BTD

2 AR

3 FGFR2

4 MEFV

5 WFS1

6 OXT

7 OXT

8 OXTR

9 NPC1

10 GCK

11 MC4R

12 NPC2

13 CAV3

14 SF1

15 LOXL1

16 HNF1A

17 RMRP

18 TACİ

19 CTSK

20 BRCA1

21 BRCA2

22 SERPİNA1

23 EPM2A

24 ELA2

25 RET

P

o

o

l

1

P

o

o

l

2

P

o

o

l

3

Pool 1 Grup No GEN ADI

1 BTD

2 HBB

3 PTPN11

4 MEFV

5 SRD5A2

6 OXT

7 OXT

8 OXTR

9 NPC1

10 GCK

11 MC4R

12 NPC2

13 CFTR

14 VHL

15 LOXL1

16 HNF1A

17 BCKDHB

18 SLC6A8

19 CD40

20 CD40L

21 BRCA1

22 BRCA2

23 EPM2A

24 RET

25

Pool 2 Grup No GEN ADI1 BTD

2 HBB

3 PTPN11

4 MEFV

5 SRD5A2

6 OXT

7 OXT

8 OXTR

9 NPC1

10 GCK

11 MC4R

12 NPC2

13 GBA

14 GDF6

15 LOXL1

16 HNF1A

17 GCDH

18 SLC6A8

19 CD40

20 CD40L

21 BRCA1

22 BRCA2

23 LPL

24 RET

25 WFS1

26

27

Pool 3 Grup No GEN ADI1 BTD

2 AR

3 FGFR2

4 MEFV

5 WFS1

6 OXT

7 OXT

8 OXTR

9 NPC1

10 GCK

11 MC4R

12 NPC2

13 CAV3

14 SF1

15 LOXL1

16 HNF1A

17 RMRP

18 TACİ

19 CTSK

20 BRCA1

21 BRCA2

22 SERPİNA1

23 EPM2A

24 ELA2

25 RET

P

o

o

l

1

P

o

o

l

2

P

o

o

l

3

MiSeq Örnek Yükleme

Sekanslama Görüntü işleme Okuma

Alingment Varyant deteksiyonu Filtreleme

NGS Akış Şeması

Pabinger S et al. Briefings in Bioinformatics, 2013

Wangs S et al. Genomics and Informatics , 2013

NGS Dosya Türleri

• FASTAQ – NGS raw datası

– FASTA sekans+kalite datası

– Wellcome Trust Sanger tarafından bulundu

• SAM/BAM – Sequence Alignment/Map

– FASTAQ’ nun align edilmiş hali

– Varyant saptama algoritmalarına hazır format

– Kodlama şekilleri farklı

NGS Dosya Türleri

• VCF

– Variant Calling Format

– Align edilmiş dizideki varyantları gösterir

– Manifest dosyaya göre

NGS Dosya Türleri

MiSeq Kalite Kontrol

MiSeq Kalite Kontrol

MiSeq Kalite Kontrol

MiSeq Analiz

MiSeq Analiz

MiSeq Analiz

BRCA2 Geni K2729N

BTD Geni c.617_619delTTG

Sistemik Artefakt

Booycott et al. Nat Rev Genet, 2013

NGS ve Nadir Hastalıklar

• WES

– Ortalama 12.000 varyant

• %90 veritabanlarında kayıtlı

• WGS

– Ortalama 5 milyon varyant

• 144.000 yeni

Varyant Saptama Oranı

Pabinger S et al. Briefings in Bioinformatics, 2013

Boycott et al. Nat Rev Genet, 2013

Kalıtılan Mutasyon Algoritması

www.omictools.com

• Helicos

– HeliScope

• Dünyadaki ilk DNA mikroskobu

• Pacific Biosciences

– SMRT (Single Molecule Real Time) sequencer

– DNA polimeraz flow cell’ e bağlı

– Her nükleotid eklenmesinde ışıma

Üçüncü Nesil Sekanslama

Ku CS et al. Expert Rev. Med. Devices, 2013

• Nanopore DNA sequencer

• Nükleotid etiketleme ve tespiti yok

• Ekzonükleazla kesilen baz nanopordan geçer

• Polimerizasyon yok

• 15 dakikada WGS

• Çok düşük maliyet

Dördüncü Nesil Sekanslama

Oxford Nanopore Technologies