Profesor Patrocinante Dra. Fabiola Sánchez Vásquez Instituto de Inmunología Facultad de Medicina ÓXIDO NÍTRICO INCREMENTA LA PERMEABILIDAD MICROVASCULAR INDUCIENDO CAMBIOS EN PROTEINAS DE LAS UNIONES ADHERENTES Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico RODRIGO ANDRÉS CARRASCO LEÓN VALDIVIA – CHILE 2012
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Profesor Patrocinante
Dra. Fabiola Sánchez Vásquez
Instituto de Inmunología
Facultad de Medicina
ÓXIDO NÍTRICO INCREMENTA LA PERMEABILIDAD
MICROVASCULAR INDUCIENDO CAMBIOS EN PROTEINAS DE
LAS UNIONES ADHERENTES
Tesis de Grado presentada como parte de
los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
RODRIGO ANDRÉS CARRASCO LEÓN
VALDIVIA – CHILE
2012
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer en primer lugar a mis padres y hermanos, por la preocupación
y el apoyo que he recibido de ellos en diversos ámbitos, lo cual ha sido fundamental en
estos años de estudio. A Paulina, que desde hace varios años ha estado junto a mí,
quien ha sido un pilar importante en mi vida y una gran compañía.
A la Dra. Fabiola Sánchez, mi tutora de tesis en la Universidad Austral de Chile,
por permitirme desarrollar este trabajo dentro de su grupo de investigación y por
siempre apoyarme e instarme a seguir adelante, pese a las dificultades. A la profesora
Marcela por sus consejos y buena disposición.
Quiero agradecer a todos los miembros del Instituto de Inmunología, a mis
compañeros e integrantes del laboratorio por su buena disposición y generosidad con
sus conocimientos cuando era necesario, sobre todo al grupo de trabajo de la profesora
Fabiola: Paty, Natalie, Anita, Caro y Alex por su buena onda y simpatía en todo
momento.
También un agradecimiento muy especial a todos mis amigos y amigas que he
conocido en Valdivia, ya que junto a ellos he compartido grandes alegrías como
también nos hemos apoyado en las dificultades: Jorgito, Cristian, Pedro, Sandro,
Sapex, Gonzalo, Oscarin y a la Magda, un cariño muy especial a cada uno de ellos, así
como también a mis amigos de Temuco: Alejandro, Eduardo y Javier. Esta tesis fue
financiada por el proyecto FONDECYT 1100569.
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS
página
ÍNDICE DE CONTENIDOS i
ÍNDICE DE FIGURAS iii
LISTA DE ABREVIATURAS iv
1. RESUMEN 1
1.1 Summary 2
2. INTRODUCCIÓN 3
2.1 Barrera endotelial 5
2.2 VE-caderina y cateninas 5
2.3 Óxido nítrico y PAF 11
2.4 Hipótesis del trabajo 17
2.5 Objetivo general 17
2.6 Objetivos específicos 17
3. MATERIALES Y MÉTODOS 18
3.1 Materiales 18
3.1.1 Material biológico 18
3.1.2 Reactivos 18
3.1.3 Equipos 20
3.2 Métodos 20
3.2.1 Cultivo celular 20
3.2.2 Extracción de proteínas totales 21
3.2.3 Ensayo de permeabilidad 21
ii
3.2.4 Ensayo de biotinilación 22
3.2.5 Ensayo de coinmunoprecipitación para VE-caderina y
β-catenina 23
3.2.6 Separación de proteínas por gel de
poliacrilamida desnaturante (PAGE-SDS) y electrotransferencia 23
3.2.7 Inmunodetección de proteínas mediante Western blot 24
3.2.8 Inmunodetección de proteínas de membrana mediante
ensayo de inmunofluorescencia indirecta 25
3.2.9 Inhibidor L-NMA 26
3.2.10 Análisis estadístico 26
4. RESULTADOS 27
4.1 Producción de NO y ensayo de permeabilidad con L-NMA 27
4.2 PAF induce fosforilación de eNOS 29
4.3 Internalización de VE-caderina inducida por PAF 31
4.4 Internalización de VE-caderina detectada por ensayo de
inmunofluorescencia indirecta 33
4.5 PAF inhibe la coinmunoprecipitación de β-catenina con VE-caderina 35
4.6 Inhibición de la internalización de VE-caderina en células EA.hy926
pretratadas con L-NMA 38
4.7 Interacción de VE-caderina con β-catenina es regulada por NO 41
5. DISCUSIÓN 44
6. CONCLUSIONES 51
7. BIBLIOGRAFÍA 52
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1
Organización molecular de uniones adherentes endoteliales. 9
Figura 2
Diagrama de los mecanismos regulatorios en hiperpermeabilidad
paracelular inducida por agonistas en células endoteliales. 14
Figura 3
Producción de NO y Ensayo de permeabilidad con L-NMA. 28
Figura 4
Fosforilación de eNOS en respuesta a PAF. 30
Figura 5
Ensayo de Biotinilación de VE-caderina. 32
Figura 6
Internalización de VE-caderina detectada por ensayo de inmunofluorescencia
indirecta. 34
Figura 7
El tratamiento con PAF estimula la disociación de VE-caderina de β-catenina. 36
Figura 8
Internalización de VE-caderina en presencia de L-NMA. 39
Figura 9
L-NMA previene la ruptura inducida por PAF de las asociaciones entre
VE-caderina y β-catenina. 42
iv
LISTA DE ABREVIATURAS
A absorbancia.
AJs uniones adherentes.
Akt/PKB proteína quinasa B.
BSA albúmina sérica de bovino.
C-terminal carboxilo terminal.
cGMP guanosina monofosfato cíclica.
EDTA ácido etilendiaminotetraacético.
EGTA ácido etilenglicoltetraacético.
ERK 1/2 quinasa reguladora de señales extracelulares 1 y 2.
FBS suero bovino fetal.
GTP guanosina trifosfato.
L-NMA L-N metil arginina.
NO óxido nítrico.
N-terminal amino terminal.
PAF factor activante de plaquetas.
PI-3k fosfatidil inositol 3-quinasa.
PKG proteína quinasa G.
PMSF fluoruro de sulfonilfenilmetano.
PSA persulfato de amonio.
SDS dodecil sulfato de sodio.
sGC guanilato ciclasa soluble.
v
Temed N, N, N´, N´-tetrametiletilendiamina.
TJs uniones estrechas.
Tris Tris (hidroximetil) aminometano.
VEGF factor de crecimiento endotelial vascular.
1
1. RESUMEN
El óxido nítrico (NO), es un importante regulador de la homeostasis vascular,
pero su rol en el control de la permeabilidad microvascular no es aun bien entendido.
Utilizando ratones knockout para eNOS y células endoteliales depletadas de eNOS,
hemos demostrado previamente que el NO derivado de la óxido nítrico sintasa
endotelial (eNOS) es una señal clave para el inicio de la permeabilidad microvascular
inducida por agonistas. La depleción de eNOS perjudica la respuesta inflamatoria a los
agentes, pero no altera la permeabilidad basal. Hemos demostrado también que el
movimiento molecular de eNOS y la localización citosólica son cruciales en la
determinación de funciones vasculares del NO. En este trabajo de tesis se examinó la
organización de las uniones de las células endoteliales en EAhy926, una línea celular
endotelial inmortalizada, mediante microscopia de fluorescencia, examinando la
localización de VE-caderina, la principal proteína de las uniones adherentes. Bajo
condiciones control, VE-caderina se localiza en la membrana de las células endoteliales
de células adyacentes como una estructura continua. La administración del factor
activante de plaquetas (PAF), causa internalización de VE-caderina y desestabilización
del complejo de uniones adherentes entre VE-caderina y β-catenina. El pretratamiento
de las células EAhy926 con L-NMA, un inhibidor de la óxido nítrico sintasa, bloquea la
internalización de VE-caderina y la pérdida de interacción entre ambas proteínas.
Nuestros resultados sugieren que el NO regula la permeabilidad microvascular
mediante modificaciones de proteínas de uniones adherentes.
2
1.1 SUMMARY
Nitric oxide (NO) is an important regulator of vascular homeostasis but its role in
the control of microvascular permeability is incompletely understood. Using eNOS
knockout mice and eNOS depleted endothelial cells; we demonstrated previously that
NO derived from endothelial nitric oxide synthase (eNOS) is a key signal for the onset of
agonist-induced hyperpermeability. eNOS depletion impairs the response to
inflammatory agents but does not alter basal permeability. We have also demonstrated
that eNOS molecular movement and cytosolic location are crucial in determining NO
vascular functions. In this work, we examined the organization of endothelial cell
junctions in EAhy926, an immortalized endothelial cell line, by fluorescence microscopy,
studying VE-cadherin localization, the main protein from the adherens junction. Under
control conditions, VE-cadherin locates to the endothelial cell membranes of adjacent
cells as a continuous structure. Administration of platelet activating factor (PAF) caused
VE-cadherin internalization and destabilization of the interaction between VE-cadherin
and β-catenin. Pretreatment of EAhy926 cells with L-NMA, an inhibitor of nitric oxide
synthases, blocked the internalization of VE-cadherin and the loss of interaction
between both proteins. Our results suggest that NO regulates microvascular
permeability by modifying adherens junction proteins.
3
2. INTRODUCCIÓN
Los procesos inflamatorios se caracterizan por un aumento de la permeabilidad
microvascular, la cual es controlada principalmente en las vénulas postcapilares. El
control de esta función reside principalmente en las células endoteliales que revisten los
vasos sanguíneos y regulan el paso de solutos y solventes desde el lumen de los vasos
sanguíneos hacia los tejidos subyacentes (Andriopoulou et al., 1999).
Esta función es finamente regulada por diferentes sistemas (Andriopoulou et al.,
1999). La permeabilidad endotelial es mediada por las llamadas vías transcelular y
paracelular, es decir a través (transcelular) o entre (paracelular) las células endoteliales
(Dejana et al., 2008). Estas últimas controlan el paso de proteínas del plasma, solutos
y fluidos a través de las uniones interendoteliales de la barrera endotelial, regulando así
la permeabilidad endotelial y la homeostasis entre fluidos y tejidos. Mientras la ruta
paracelular restringe el paso de solutos que superen los 3nm de radio (Pappenheimer
et al., 1951), el tráfico de vesículas transcelular transporta selectivamente
macromoléculas tales como albúmina a través del endotelio (Ghitescu et al., 1986). La
vía transcelular en el endotelio continuo es responsable del transporte de albúmina u
otras proteínas del plasma a través de la barrera endotelial por mecanismos de
transporte vesicular vectorial (Minshall et al., 2002). El trafico transcelular de estas
proteínas ocurre predominantemente vía fisión de los macro-dominios de la membrana
plasmática enriquecidas con caveolina-1 (Cav-1), desde la superficie luminal de la
célula endotelial seguida por transporte vesículo-caveolar a la superficie basal. Las
vesículas se fusionan con la membrana plasmática del lado abluminal y liberan
4
macromoléculas por exocitosis (Minshall et al., 2002). Este proceso finamente regulado
es esencial para transportar albumina, albumina unida a ligandos, hormonas y para
controlar la presión oncótica de tejidos en el endotelio continuo normal (Mehta y Malik,
2006).
Las vías transcelular y paracelular son generalmente consideradas como
procesos independientes en la regulación de la barrera endotelial. Sin embargo, la
creciente evidencia favorece también el concepto de interdependencia entre las vías
paracelular y transcelular que son responsables en el mantenimiento de la homeostasis
de fluidos y tejidos. Este trabajo de tesis se centrará principalmente en la vía
paracelular, mediada por la apertura y el cierre coordinado de las uniones
interendoteliales célula-célula.
La permeabilidad paracelular de la barrera endotelial es mantenida
principalmente por las uniones interendoteliales o uniones adherentes que restringen el
transporte de proteínas del plasma del tamaño de la albúmina (67kDa) desde la luz del
vaso al estroma.
Dos tipos de uniones interendoteliales están presentes en el endotelio, uniones
estrechas (TJs) y uniones adherentes (AJs), las cuales contribuyen al mantenimiento de
la barrera endotelial. Las uniones adherentes compuestas por los complejos de
caderina endotelial vascular (VE-caderina) con cateninas, son dominantes en la
mayoría de los lechos vasculares (Mehta y Malik, 2006).
Los mecanismos celulares que regulan la permeabilidad endotelial paracelular
son complejos. La integridad de las uniones adherentes son fundamentales en la
regulación de la permeabilidad paracelular y la interrupción de las adhesiones
5
homotípicas de VE-caderina que conducen a una acumulación excesiva de fluido en el
intersticio y se asocian con procesos patológicos tales como inflamación, aterogénesis y
daño pulmonar agudo (Wallez y Huber et al., 2008).
2.1 BARRERA ENDOTELIAL
La barrera endotelial está formada por una continua monocapa de células
endoteliales vinculadas entre sí por diferentes estructuras adherentes. Células
endoteliales de vénulas postcapilares normalmente muestran uniones adherentes, las
cuales contienen VE-caderina, formando un complejo con proteínas citosólicas α-
catenina, β-catenina, plakoglobina y p120-catenina (Bazzoni y Dejana, 2004; Dejana,
1996; Durán, 2008; Geiser y Ayalon, 1992; Weis y Nelson, 2006). Las uniones
adherentes y en particular VE-caderina, son blancos de las vías de señalización de
agentes que incrementan la permeabilidad vascular tales como factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF), histamina y trombina. (Dejana et al., 2008).
2.2 VE-CADERINA Y CATENINAS
Las caderinas consisten en una superfamilia de glicoproteínas que son
responsables de la adhesión homotípica dependiente de calcio de las células
(Lampugnani et al., 1992). Esta superfamilia consiste en 5 subfamilias que se
distinguen basándose en su composición de domino, en la similitud de secuencia y por
análisis filogenéticos (Breier et al., 1996; Nollet et al., 2000). En el endotelio, la principal
6
caderina encontrada constantemente en los contactos intercelulares es la caderina
endotelial vascular (VE-caderina), la cual es célula específica (Alexander et al., 2000).
VE-caderina es expresada en células endoteliales y es necesaria para la organización
de estructuras vasculares y el mantenimiento de la integridad de la pared vascular
endotelial (Vittet et al., 1997). VE-caderina puede ser agrupada con las caderinas de
tipo II basados en su estructura genómica (Nollet et al., 2000). Como todas las
caderinas tipo I y II, VE-caderina, posee una estructura modular general de cinco
repeticiones extracelulares (EC) que forman una estructura rígida en forma de barra, la
cual se estabiliza por la unión de iones calcio a una secuencia localizada en la base de
cada dominio (Takeichi, 2000; Vincent et al., 2004). VE-caderina es una proteína
transmembrana de paso único, con el extremo amino terminal (N-terminal) en el
dominio extracelular y el extremo carboxilo terminal (C-terminal) en el dominio
intracelular. El extremo N-terminal es el sitio de adhesión homotípica, mientras que el
extremo C-terminal regula el crecimiento celular (Caveda et al., 1996) y está asociada
con varias proteínas citoplasmáticas, incluyendo β-catenina, p120 catenina y γ-catenina
(también llamada plakoglobina).
El dominio extracelular de VE-caderina media la uniones homotípicas y de
adhesión entre células adyacentes. Estas uniones de adhesión homotípicas de VE-
caderina son mediadas por medio de interacciones cis y trans. Las interacciones cis
ocurren a través de interacciones laterales entre la repetición EC1 de moléculas de VE-
caderina en la misma superficie celular. Esta interacción es mediada por un crítico
residuo conservado de triptófano (Trp-2) dentro de un bolsillo hidrofóbico en EC1. La
dimerización trans es la interacción entre caderinas de células adyacentes.
7
La importancia de VE-caderina in vivo es destacada por reportes en ratones
knock-out para VE-caderina que presentan gran deterioro de la función de la barrera
endotelial (Carmeliet et al., 1999). Por esto nuestro trabajo se enfoca también en esta
proteína de gran importancia en la composición de la barrera endotelial y clave en la
hiperpermeabilidad vascular.
El incremento de la permeabilidad microvascular por mediadores inflamatorios,
ha sido correlacionada con la activación del citoesqueleto contráctil celular y la
formación de pequeños gaps entre las células endoteliales adyacentes tanto in vitro
como in vivo desestabilizando el complejo de uniones interendoteliales (Moy et al.,
1996; Drenckhahn y Ness, 1997; Andriopoulou et al., 1999).
Los complejos de uniones adherentes compuestos por VE-caderina, β-catenina,
p120-catenina y α-catenina, controlan la permeabilidad efectuada por VEGF en las
células endoteliales (Dejana et al., 2008). El complejo catenina estabiliza VE-caderina
en las uniones, previniendo la endocitosis mediada por clatrina (Davis et al., 2003; Xiao
et al., 2003; Xiao et al., 2005). En particular, β-catenina se une a complejos de caderina
y α-catenina, que a su vez se une al citoesqueleto de actina. Estas uniones parecen ser
importantes para el mantenimiento entre las uniones homotípicas y moléculas de VE-
caderina de células endoteliales adyacentes [Figura 1]. VEGF fue el primer factor
vascular potente descrito que estimula un incremento rápido y reversible en
permeabilidad microvascular (Gavard y Gutkind, 2006). El factor VEGF promueve la
rápida endocitosis de VE-caderina. Este proceso es iniciado por la unión de VEGF a su
receptor VEGFR-2, el cual induce la activación de Src, un factor intercambiador-
nucleótidico. Src activa vía fosforilación a Vav2, la cual a su vez promueve la activación
8
de la pequeña GTPasa Rac. La activación de Rac, promueve la activación de la
quinasa p21 (PAK), la cual fosforila Ser 665, un motivo altamente conservado en la cola
citoplasmática de VE-caderina. Esto resulta en el reclutamiento de β-arrestina 2,
promoviendo así su internalización en vesículas cubiertas de clatrina y en consecuencia
la ruptura de las uniones intercelulares (Gavard y Gutkind, 2006).
La familia Src quinasa (SFK) median la fosforilación del residuo tirosina de VE-
caderina y β-catenina, mostrado en paralelo el desensamblaje de las uniones
adherentes y el incremento de la permeabilidad en diferentes sistemas de cultivos
celulares (Esser et al., 1998; Eliceiri et al., 1999). Alternativamente, el receptor- 2 de
VEGF (VEGFR-2), el cual induce activación de Src, también ha sido relacionado a
endocitosis de VE-caderina dependiente de clatrina, la cual podría también contribuir a
la ruptura de la barrera endotelial (Lampugnani et al., 2006; Gavard y Gutkind, 2006).
9
A
B
VE-caderina
Vimentina Actina
Dominio yuxtamembrana
Dominio de unión a catenina
Sitio CAR
(Caderina tipo I/II)
10
Figura 1. Representación esquemática de la composición de las uniones
adherentes (AJs).
A) Representación de caderina tipo I/II que destaca las cinco repeticiones en el dominio
extracelular. Notar en el extremo N-terminal el residuo triptófano (Trp-2), como también
el sitio de reconocimiento de adhesión celular (CAR) en el dominio EC1 y la posición del
sitio de unión del Ca+2 entre cada repetición. El dominio citoplasmático de VE-caderina
incluye la “región yuxtamembrana” y el “domino de unión a catenina” que une p120 y
que interactúa con β-catenina y plakoglobina respectivamente. Modificado de Peter
(2004).
B) VE-caderina por medio de uniones homotípicas dependiente de calcio media la
adhesión de células endoteliales adyacentes. El dominio citoplasmático de VE-caderina
se une a β-catenina, que a su vez recluta IQGAP1 y α-catenina para AJs. p120-catenina
se asocia con la región yuxtamembrana de VE-caderina y previene la internalización de
VE-caderina. Modificado de Komorova (2010).
11
La hiperpermeabilidad endotelial estimulada por VEGF e histamina ha sido
asociada con una elevada fosforilación de tirosina de VE-caderina, β-catenina y p120-
catenina (Andriopoulou et al., 1999; Cohen et al., 1999; Esser et al., 1998; Shasby et
al., 2002) y además cambios en la organización de VE-caderina en uniones
intracelulares (Alexander et al., 2000; Aramoto et al., 2004; Esser et al., 1998; Kevil et
al., 1998).
2.3 ÓXIDO NÍTRICO (NO) Y PAF
El NO es reconocido como un importante regulador de la homeostasis vascular,
pero su rol en el control de la permeabilidad microvascular solo ha sido descrito
recientemente. Nuestro grupo ha demostrado un rol clave de eNOS en la
hiperpermeabilidad inducida por agonistas, utilizando ratones knock-out para eNOS y
células endoteliales depletadas de eNOS mediante RNA de interferencia (Hatakeyama
et al., 2006; Sánchez et al., 2008). En ambos modelos la permeabilidad basal es normal
y sólo se afecta la permeabilidad en respuesta a agonistas. El óxido nítrico y su
constitutiva sintasa (eNOS), han emergido como un importante mecanismo de
señalización en el sistema cardiovascular (Durán et al., 2000).
Los mecanismos de regulación de la actividad de eNOS, tales como la
fosforilación y translocación de la enzima, han sido estudiados en cultivos de células
endoteliales. En estas células, la fosforilación de eNOS ha sido asociada con la
activación de la enzima (Corson et al., 1996; García- Cardena et al., 1996; Chen et al.,
1999; Dimmeler et al., 1999). El principal sitio de fosforilación, regulador de la actividad
12
de eNOS es Ser 1177. Además de los sitios de fosforilación reconocidos serina/
treonina, la fosforilación de tirosina también puede desempeñar un papel en la
regulación de eNOS (García- Cardena et al., 1996; Durán et al., 2000).
Debido al potencial y amplio espectro de la acción celular de NO y su vida media
corta, los mecanismos que regulan la síntesis de NO con respecto al tiempo y espacio
son cruciales en determinar las funciones biológicas de NO. A nivel celular, eNOS está
estrechamente regulada con respecto a su actividad y localización. En la membrana
plasmática, la mayor parte de eNOS se localiza en caveolas que se encuentran en las
membranas endoteliales luminal y abluminal, pero no en la unión endotelial (Schroeder
et al., 2001). eNOS se une directamente a caveolina-1 (cav1) a través de un sitio de
consenso, una interacción que inhibe la actividad de eNOS (Dimmeler et al., 1999).
Bajo estimulación con agonistas, eNOS se activa por fosforilación (Dimmeler et al.,
1999; Fulton et al., 1999; Sánchez et al., 2006), liberándose de la interacción inhibitoria
con caveolina-1 (Fulton et al., 2002; Garcia-Cardena et al., 1997), siendo internalizada
(Prabhakar et al., 1998; Sánchez et al., 2008; Sánchez et al., 2009; Sánchez et al.,
2006).
Después de la estimulación por agentes inflamatorios tales como PAF (factor
activante de plaquetas) y VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), los
receptores específicos gatillan una cascada de señalización que involucra PI-3K
(fosfatidil inositol 3-quinasa), Akt (proteína quinasa B), fosforilación de eNOS y
producción de NO (óxido nítrico).
El óxido nítrico activa su blanco sGC (guanilato ciclasa soluble) activando PKG