8/17/2019 Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ UV - VIS http://slidepdf.com/reader/full/xay-dung-quy-trinh-dinh-luong-cephalexin-trong-duoc-pham-bang 1/58 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN----NGUYỄN LẦU HAIXÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CEPHALEXIN TRONG DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-Vis LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH HÓA HỌC8/2014 WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM óng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú
58
Embed
Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ UV - VIS
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
8/17/2019 Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ UV - VIS
Trong cuộc sống, không có sự thành công nào không gắn liền với hỗtrợ, động viên và giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của ngườikhác. Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu vào giảng đường đại học em đã nhậnđược rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Vớilòng biết ơn sâu sắc nhất:
Lời đầu tiên, con xin cảm ơn Cha Mẹ đã không quản vất vả để tạo mọiđiều kiện thuận lợi, luôn động viên con hoàn thành tốt khóa học cũng như hoànthành tốt luận văn này.
Xin cảm ơn quý Thầy Cô trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là quý Thầy
Cô bộ môn Hóa, khoa Khoa học Tự nhiên đã tận tình truyền dạy cho em bằngtất cả tâm huyết và vốn kiến thức quý báu của mình, để trang bị cho em kiếnthức hoàn thành tốt khóa học.
Em xin cảm ơn Cô Nguyễn Thị Diệp Chi đã giúp đỡ, hướng dẫn, tạo cơhội cho em được tiếp xúc và học hỏi kinh nghiệm ở Trung tâm Kiểm nghiệm
Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Thành phố Cần Thơ.
Cảm ơn ban Giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Thành phố Cần Thơ cùng với tập thể anh chị phòng Vật lý đo lường, cô
Lê Thị Cẩm Thúy đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu
của mình cho em hoàn thành tốt luận văn này.
Xin cảm ơn quý Thầy Cô trong hội đồng luận văn đã giành thời gian
quý báu của mình để đọc và đưa ra những lời nhận xét quý báu để bài luận văncủa em được hoàn thiện hơn.
Cuối cùng cảm ơn Cô Cố vấn lớp Hóa học K37 cùng với tập thể lớp đãquan tâm giúp đỡ em trong suốt khóa học cũng như trong thời gian hoàn thànhluận văn.
Cephalexin là một loại kháng sinh thế hệ I thuộc nhóm Cephalosporin, ít
tan trong nước, tan trong dung dịch đệm có môi trường axit. Có nhiều phương pháp xác định Cephalexin: phương pháp sắc ký lỏng cao áp, phương pháp chuẩn
độ thể tích, phương pháp quang phổ UV - Vis…. Tuy nhiên, phương pháp quang phổ UV – Vis có những ưu điểm, có thể áp dụng ở nhiều phòng thí nghiệm như:các thao tác thực hiện đơn giản, ít độc hại, chi phí thấp và thời gian tiến hànhnhanh. Đề tài “Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩmbằng phương pháp quang phổ UV - Vis” nhằm xây dựng, kiểm tra quy trìnhđịnh lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ tử ngoạikhả kiến. Đưa ra một quy trình tối ưu về yêu cầu kỹ thuật, kinh tế cũng như về
bảo vệ môi trường và bảo vệ sức khoẻ con người.
Tiến hành thẩm định hai quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến với hai hệ dung môi: dung
dịch đệm phosphat pH5.5 và nước cất. Cả hai quy trình đều được thực hiện tại bước sóng 261 nm, đều cho độ tuyến tính rất cao trong khoảng 15 ppm – 35
ppm với hệ số tương quan R 2 = 1.0000. Khi sử dụng dung dịch đệm phosphate,
phương pháp cho độ đúng với tỷ lệ tìm lại 100.6988% và độ lặp lại có RSD =0.3449%. Khi sử dụng nước, phương pháp cho cho độ đúng với tỷ lệ tìm lại
100.6528% và độ lặp lại có RSD = 0.5329%. Tiến hành định lượng trên một sốchế phẩm thì cả hai quy trình đều cho hàm lượng các mẫu đạt yêu cầu chấtlượng.
Đề tài đã chứng minh được phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến khi
thực hiện bằng hai quy trình trên đều đảm bảo yêu cầu của một quy trình phântích định lượng. Vì vậy, có thể sử dụng hai quy trình trên để định lượngCephalexin trong dược phẩm, nhưng sử dụng dung dịch đệm sẽ cho kết quảchính xác hơn vì RSD = 0.3449% < RSD = 0.5329% khi sử dụng nước cất.
Cephalexin là một loại kháng sinh thế hệ một của nhóm Cephalosporin cótác dụng diệt khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp vỏ tế bào vi khuẩn, là một hợpchất ít tan trong nước, tan trong các dung dịch có môi trường axid. Từ khi xuấthiện, Cephalexin được dùng để điều trị các bệnh tai, mũi, họng, nhiễm khuẩn
sản phụ khoa… Hiện nay việc xác định Cephalexin trong dược phẩm chủ yếudựa theo Dược điển Việt nam, USP, BP với phương pháp sắc ký lỏng cao áp và
phương pháp chuẩn độ thể tích. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp tuy có độ chínhxác cao nhưng phải sử dụng pha động là các dung môi độc hại và thiết bị đắt
tiền, phương pháp chuẩn độ thể tích tuy ít sử dụng hoá chất độc hại nhưng là
pháp thủ công dễ sai số, có quy trình phức tạp, có độ chính xác không cao lắm.
Trước thực tế đó, việc xây dựng một phương pháp có độ chính xác cao vàít độc hại, chi phí thấp là một đề tài được quan tâm, phương pháp quang phổ tử
ngoại khả kiến là một phương pháp thích hợp để tiến hành nghiên cứu. Do đó,
đề tài “Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng
phương pháp quang phổ UV Vis” được tiến hành để xây dựng, kiểm tra đánhgiá phương pháp. Từ đó, tối ưu hoá quy trình phân tích để có thể áp dụng trongcông tác kiểm nghiệm dược phẩm, cụ thể là phân tích Cephalexin trong dược
phẩm.
1.2 Mục tiêu đề tài
Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương
pháp UV-Vis, thẩm định phương pháp với một số chỉ tiêu: độ chọn lọc, độ tuyếntính, độ đúng, độ lặp lại giới hạn pháp hiện, giới hạn định lượng và định lượng6 lô thuốc chứa hoạt chất Cephalexin trên thị trường của các công ty CPDP HậuGiang, CTCPDP Cửu Long và Imexpharm bằng phương pháp đã thẩm định.
Tính chất: Cephalexin nguyên chất là chất bột kết tinh màu trắng hoặcgần như trắng. Hơi tan trong nước, thực tế không tan trong ethanol 96%, tantrong acid và dung dịch đệm có tính acid [1].
2.1.3 Dược động học [2]
Cephalexin hầu như được hấp thu hoàn toàn, ngay cả khi có sự hiện diệncủa thức ăn và không bị ảnh hưởng của các bệnh đường tiêu hóa, sau khi cắtmột phần dạ dày, chứng thiếu axit clohydric, vàng da hay bệnh có túi thừa (ở tátràng hay hổng tràng). Thuốc được đào thải với nồng độ cao qua nước tiểu, thời
gian bán hủy thường khoảng một giờ, nhưng lâu hơn ở trẻ sơ sinh. Cephalexincó mức độ an toàn cao.
2.1.4 Cơ chế tác động [2]
Cephalexin là thuốc kháng sinh cephalosporin và được sử dụng để chốnglại các vi khuẩn trong cơ thể. Nó hoạt động bằng cách ức chế quá trình hìnhthành vỏ tế bào của vi khuẩn, làm cho nó bị vỡ và giết chết vi khuẩn.
2.1.5
Tác dụng [2]
Cephalexin có phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên vi khuẩn gram dương
như tụ cầu, liên cầu, phế cầu.
Cephalexin cũng có tác dụng trên một số vi khuẩn gram âm như E.coli,Klebsiella pneumonia Proterusmirabilis và Shigella.
2.1.6 Chỉ định [2]
Ngày nay, Cephalexin được sử dụng rộng trong những trường hợp nhiễmđường hô hấp (viêm phế quản cấp, mãn tính và giãn phế quản có bội nhiễm),
nhiễm tai mũi họng, nhiễm trùng đường tiểu. Ngoài ra, Cephalexin còn đượcdùng trong dự phòng nhiễm khuẩn đường tiết niệu tái phát, nhiễm khuẩn sản,
phụ khoa, da, mô mềm và xương.
2.1.7
Tương tác thuốc [2]
Tránh dùng Cephalexin cho bệnh nhân dị ứng với kháng sinh nhómCephalosporin. Vì Cephalexin có quan hệ hóa học với Penicilin nên đôi khi một
bệnh nhân có thể có phản ứng dị ứng với cả hai loại thuốc. Tuy nhiên Cephalexinkhông gây quen thuốc.
2.1.8
Tác dụng phụ [2]
Một số ít bệnh nhân có thể bị rối loạn tiêu hóa như buồn nôn, nôn mữa và
tiêu chảy khi dùng Cephalexin. Ngoài ra, do có phổ kháng khuẩn rộng nên
Cephalexin có thể gây tăng trưởng các vi khuẩn cộng sinh. Một số trường hợpcó thể xảy ra giảm bạch cầu trung tính nhưng có hồi phục.
Bản mỏng: Silicagel, không có chất kết dính, được chuẩn bị như sau: Đặt bản mỏng trong bình sắc ký có chứa hỗn hợp dung môi n-hexan (C6H14) và
tetradecan (C14H30) (95 : 5) ngập khoảng 1 cm, để dung môi di chuyển theochiều dài của bản mỏng, sau đó lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký và để dungmôi bay hơi.
Dung môi khai triển: Dung dịch acid citric 0.1M - dung dịch dinatrihydrophosphat 0.1M - dung dịch ninhydrin trong aceton có nồng độ 1 g trong
15 ml (60 : 40 : 1.5).
Dung dịch thử: Lấy một lượng bột viên tương ứng với khoảng 30 mgcephalexin, hòa tan trong 10 ml nước, lọc.
Dung dịch đối chiếu: Dung dịch cephalexin chuẩn 0.3% trong nước.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 l mỗi dung dịch trên.
Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 3/4 chiều dài bản mỏng.Lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, đánh dấu mức dung môi và để bản mỏng khôngoài không khí, sấy bản mỏng ở 110oC trong 10 phút và quan sát dưới ánh sáng
thường.
Yêu cầu: Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử và của dung dịch
đối chiếu phải giống nhau về vị trí, màu sắc và kích thước.
b) Phương pháp quang phổ IR [3]
Hoà tan một lượng bột thuốc tương đương với 0.5 g Cephalexin trong
1 ml nước và 1.4 ml dung dịch HCl 1M, lọc và rửa bằng 1 ml nước, thêm từtừ dung dịch CH3COONa bão hoà cho đến khi xuất hiện kết tủa, thêm 5 ml
CH3OH, lọc và rửa kết tủa hai lần mỗi lần bằng 1 ml CH3OH và làm khan ởáp suất không quá 0.7 kPa. Đo phổ IR của phần kết tủa vừa làm khan và so
sánh với phổ chuẩn của Cephalexin chuẩn.
Yêu cầu: Phổ IR của chế phẩm phải phù hợp với phổ chuẩn của
Cephalexin chuẩn.
c) Phương pháp HPLC [1]
Trong phép thử định lượng, pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồcủa dung dịch chuẩn.
Pha động: Hòa tan 1.0 g natri pentansulfonat trong 1015 ml hỗn hợp nước,
CH3CN, CH3OH và (CH3)3 N (850 : 100 : 50: 15), điều chỉnh tới pH=3 .0±0.1 bằng acid phosphoric.
Dung dịch chuẩn nội: Cân chính xác khoảng 300 mg 1-hydroxy
benzotriazol (C6H5 N3O) vào bình định mức 1000 ml, hòa tan trong 10 mlCH3OH (TT) và loãng bằng pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng
lọc 0.45 m.
Dung dịch chuẩn: Hoà tan một lượng cephalexin chuẩn trong nước để thuđược dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1,0 mg/ml. Hút chính xác 10,0
ml dung dịch chuẩn gốc vào bình nón nút mài, thêm chính xác 15,0 ml dungdịch chuẩn nội và trộn đều. Lọc qua màng lọc 0.45 m.
Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng100 mg cephalexin vào bình định mức 100 ml, thêm 75 ml nước và lắc siêu âm15 phút, pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua giấy lọc và bỏ20 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 10 ml dịch lọc vào bình nón nút mài, thêm
chính xác 15,0 ml dung dịch chuẩn nội và trộn đều. Lọc qua màng lọc 0.45 m.
Điều kiện sắc ký: Cột nhồi pha tĩnh C18 (5 m hoặc 10 m)
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm.
Tốc độ dòng: 1.5 ml/phút.
Thể tích tiêm: 20 l.
Cách tiến hành:
Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký đốivới dung dịch chuẩn: trên sắc ký đồ thu được, độ phân giải giữa pic chuẩn nội
và pic cephalexin không nhỏ hơn 5; độ lệch chuẩn tương đối của tỷ số diện tích pic cephalexin và chuẩn nội không được lớn hơn 2.0%.
Tiến hành sắc ký lần lượt đối với dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
Tính hàm lượng cephalexin (C16H17 N3O4S), từ tỷ số diện tích piccephalexin và chuẩn nội trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn vàhàm lượng C16H17 N3O4S trong cephalexin chuẩn.
Nhận xét: Phương pháp đòi hỏi hoá chất, thiết bị đắt tiền, thời phân tích
trên máy lâu, sử dụng dung môi độc hại. Tuy nhiên cũng có nhiều thuận lợi nhưđộ chọn lọc cao, sử dụng ít hoá chất, quy trình đơn giản.
Vòng – Lactam của Cephalexin không bền trong môi trường kiềm, khi
gặp môi trường kiềm thì vòng – Lactam bị phá vỡ và tạo thành hợp chất có
tính khử. Hàm lượng Cephalexin được xác định bằng cách phá vỡ vòng –
Lactam trong môi trường kiềm sau đó cho phản ứng với một lượng xác địnhdung dịch I2 dư. Lượng I2 thừa sau phản ứng sẽ được xác định bằng cách chuẩnđộ với Na2S2O3 với chất chỉ thị hồ tinh bột .
Mẫu thử: cân khối lượng 20 viên thuốc, tính khối lượng trung bình bộtthuốc của viên. Lấy bột thuốc 20 viên trộn đều, cân lượng bột thuốc tươngđương 250 mg cephalexin khan cho vào bình định mức 250 ml. Thêm 100 mlnước cất, lắc kỹ trong 30 phút. Định mức tới vạch bằng nước cất, lắc đều, lọc
bỏ 20 ml dụng dịch lọc đầu và lọc lấy dung dịch. Lấy chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình nón có nút mài, thêm 5
ml dung dịch NaOH 1N, lắc đều và để yên 30 phút. Sau đó thêm 20 ml dung
dịch đệm acetate (5.44% CH3COONa.3H2O và 2.4% CH3COOH), 5 ml HCl
1N và 25 ml dung dịch I2 0.02N. Đậy kín bằng nút mài đã thấm ướt và để trongtối 20 phút. Định lượng I2 thừa bằng Na2S2O3 0.02N với chất chỉ thị hồ tinh
bột.
Mẫu trắng: Hút chính 10 ml dung dịch lọc cho vào một bình nón khác,
thêm 20 ml dung dịch đệm acetate và 25 ml dung dịch I2 0.02N. Đậy kín bằngnút mài thấm ướt, để trong tối 20 phút. Chuẩn độ với Na2S2O3 0.02N với chấtchỉ thị hồ tinh bột.
Mẫu chuẩn: Cân chính xác 250 mg cephalexin chuẩn khan cho vào bình
định mức 250 ml. Thêm 100 ml nước cất, lắc kỹ trong 30 phút. Định mức tớivạch bằng nước cất, lắc đều (dung dịch chuẩn).
Hút chính xác 10 ml dung dịch chuẩn cho vào một bình nón khác, thêm
20 ml dung dịch đệm acetate và 25 ml dung dịch I2 0.02N. Đậy kín bằng nútmài thấm ướt, để trong tối 20 phút. Chuẩn độ với Na2S2O3 0.02N với chất chỉ
thị hồ tinh bột.
Hàm lượng được tính dựa vào hàm lượng chuẩn.
Nhận xét: Quy trình tốn nhiều thời gian, nếu nguyên liệu hay chế phẩm
có lẫn các chất khử sẽ bị I2 oxi hoá làm cho kết quả phân tích bị sai lệch do đóđộ chọn lọc không cao. Tuy nhiên, phương pháp này dễ dàng thực hiện ở các
Dựng đường chuẩn với dãy dung dịch chuẩn Cephalexin ứng với các nồng
độ 15 ppm – 20 ppm – 25 ppm – 30 ppm – 35 ppm.
Dung dịch thử: Cân 20 viên thuốc, tính giá trị trung bình bột thuốc trongmỗi viên, trộn đều. Cân lượng bột thuốc tương đương 50 mg Cephalexin khantheo hàm lượng ghi trên nhãn, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml dung
môi dung dịch đệm phosphat pH5.5, siêu âm 15 phút, định mức tới vạch bằngdung dịch đệm, lắc đều. Lọc bỏ 20 ml đầu, lọc thu lấy dịch lọc. Hút chính xác
5 ml dịch lọc cho vào bình định mức 100 ml, định mức tới vạch bằng dung dịchđệm, lắc đều.
Tiến hành đo độ hấp thụ dãy dung dịch chuẩn và dung dịch thử với mẫu
trắng là dung dịch đệm ở bước sóng 261 nm.
Hàm lượng Cephalexin được tính dựa vào đường chuẩn
Nhận xét: Quy trình đơn giản, ít sử dụng hoá chất độc hại, ít tốn thời
gian, thiết bị không đắt lắm.
2.3 Giới thiệu phương pháp quang phổ UV- Vis
Phương pháp phân tích quang phổ là phương pháp phân tích quang họcdựa trên việc nghiên cứu sự tương tác của bức xạ ánh sáng trên chất khảo sát
hoặc sự hấp thụ các bức xạ dưới một tác động hóa lý nào đó.
Một chùm sáng từ nguồn sáng tử ngoại hoặc khả kiến được tách thành cáctia sáng đơn sắc với các bước sóng khác nhau bằng một lăng kính hoặc lưới
nhiễu xạ. Mỗi tia sáng đó được tách thành hai tia sáng có cường độ bằng nhau bằng một bán gương. Một tia sáng (chùm sáng mẫu) sẽ đi xuyên qua một vật
chứa trong suốt (cuvet) có chứa hỗn hợp chất nghiên cứu được hoà tan trongdung môi trong suốt (dung dịch thử). Tia sáng còn lại (tia sáng tham chiếu) sẽ
đi xuyên qua một cuvet khác (giống với cuvet chứa dung thử) chỉ chứa dung
môi hoà tan (mẫu trắng). Cường độ của hai tia sáng sẽ được đo bằng đầu dò điệntử và được so sánh. Tia sáng tham chiếu sẽ hấp thụ ít hoặc không hấp thụ, đượcxác định là I0. Cường độ của tia sáng mẫu được xác định là I. Trong một thờigian ngắn, quang phổ kế sẽ quét tất cả các bước sóng. Vùng UV thường đượcquét trong khoảng 200 nm – 400 nm, vùng Vis từ 400 nm – 800 nm.
Bộ phận đầu dò (detector) sẽ so sánh cường độ chùm ánh sáng đi quadung dịch (I) và đi qua dung môi (I0). Tín hiệu quang được chuyển thành tínhiệu điện, sau khi được phóng đại, tín hiệu sẽ chuyển sang bộ phận ghi để vẽ
đường cong sự phụ thuộc của log (I0/I) vào bước sóng. Nhờ sử dụng máy tính, bộ tự ghi còn có thể ghi ra cho ta những số liệu cần thiết như giá trị λmax cùng
với giá trị độ hấp thụ A. Tất cả các cường độ hấp thụ ứng với mỗi bước sóng sẽđược thể hiện trên phổ đồ.
Cường độ tia sáng trước và sau khi qua cuvette được liên hệ với nhau bởi
biểu thức Lambert – Beer: C I
I T A
0log)log(
Trong đó: A: Độ hấp thụ
C: Nồng độ (mol/L)
l: Chiều dài lớp dung dịch
: Hệ số hấp thụ phân tử gam
2.3.3 Ưu điểm
Phương pháp quang phổ khả kiến có các ưu điểm:
- Phương pháp có độ nhạy cao, cho phép xác định nồng độ trong khoảng10-2 đến 10-6 mol/L (1-10 %).
- Phân tích thuận tiện: không đòi hỏi thiết bị, hóa chất quá đắt tiền, có thể phân tích nhiều đối tượng mẫu khác nhau.
- Dễ tự động hóa: các thao tác từ đưa mẫu phân tích vào, đưa các hóa chấtcần thiết, vẽ phổ, xử lý phổ, xử lý kết quả, xử lý thống kê đều được thực hiện
một cách tự động hóa trên các máy móc, thiết bị hiện đại.
- Phương pháp này rất thuận lợi cho việc nghiên cứu các cơ chế tạo phức,xác định các dạng tồn tại của ion trung tâm, các ligand nằm trong phức đơn vàđa ligand trong pha nước cũng như pha hữu cơ
2.3.4 Các sai số trong phép đo
Phương pháp phân tích quang phổ cũng như các phương pháp phân tích
khác, sai số được chia làm hai loại: sai số do tiến hành phản ứng hóa học (hóa
chất, thao tác, dụng cụ….), sai số của tín hiệu đo độ hấp thụ của dung dịch (saisố hệ thống). Trong phương pháp quang phổ thì sai số quan trọng nhất là sai sốcủa tín hiệu trong quá trình đo độ hấp thụ.
2.3.5
Yêu cầu của chất phân tích
Các hợp chất cần xác định phải bền, ít phân ly, ổn định, không thay đổithành phần trong khoảng thời gian nhất định để thực hiện phép đo (10 – 20
phút). Hệ số càng lớn càng tốt, nồng độ các chất xác định phải tuân theo định
luật Lambert – Beer.
Các hợp chất là phức cần đo phải có bước sóng cực đại khác xa bước sóngcực đại của thuốc thử trong cùng điều kiện, tức là khoảng 80 – 100 nm.
2.3.6 Ứng dụng phương pháp quang phổ UV – Vis
Phương pháp phổ UV – Vis có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực phân tích
định tính, phân tích cấu trúc phân tử và phân tích định lượng. Nguyên tắt của phương pháp phân tích định lượng là dựa vào mối quan hệ giữa mật độ quang
và nồng độ dung dịch của định luật Lambert – Beer, phương pháp định tính là
dựa vào hình dáng của phổ và bước sóng cực đại.
2.4
Thẩm định quy trình định lượng [7]
Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra, cung cấp
bằng chứng khách quan để chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được cácyêu cầu đặt ra (fitness for the urpose). Kết quả của thẩm định phương pháp cóthể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Thẩmđịnh phương pháp phân tích là một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết
- Sử dụng một phương pháp mới vào công việc phân tích hằng ngày.
- Thay đổi mục đích sử dụng của phương pháp.
- Giới hạn thu được sau khi phân tích nằm ngoài giới hạn quy định.
- Thay đổi quy trình: thành phần tá dược trong thuốc, trang thiết bị, thôngsố kỹ thuật, thay đổi nhà cung cấp hoá chất.
2.4.2
Tầm quan trọng của việc thẩm định quy trình phân tích [9]
Thẩm định quy trình phân tích là một quá trình tiến hành thiết lập bảng
thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Nói cách khác, việc thẩm định một quy
trình phân tích yêu cầu chúng ta phải chứng minh một cách hoá học rằng khitiến hành thí nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận được.
Trong các tiêu chuẩn chúng ta phải xây dựng phương pháp phân tích haycũng gọi là quy trình thử nghiệm để giúp cho việc thực hiện kiểm tra chất lượng
cũng như các tiêu chí đề ra cho các tiêu chuẩn đó.
Mục tiêu của việc thẩm định các phương pháp phân tích là để chứng tỏrằng quy trình đáp ứng với yêu cầu dự kiến.
2.4.3 Các chỉ tiêu thẩm định quy trình định lượng
a) Độ đặc hiệu [8]
Độ đặc hiệu: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt cáctạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạpchất.... Cụ thể, trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh được kếtquả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồngthời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất
phân tích. Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất
phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướngđến kết quả chính xác.
Cách tiến hành: Ta đánh giá độ đặc hiệu dựa vào cách so sánh hệ số góccủa đường chuẩn thu được từ mục độ tuyến tính và hệ số góc biểu diễn mốitương quan giữa nồng độ dung dịch và độ hấp thụ thu được khi xác định độđúng.
Đánh giá: Sự sai khác giữa hai hệ số góc không quá 5%, chứng tỏ quytrình có tính chọn lọc với chất phân tích.
Tính tuyến tính của một phương pháp phân tích là khả năng luận ra các
kết quả thử của phương pháp hoặc bằng phép biến đổi toán học hay trực tiếpdựa vào tương quan tỉ lệ giữa đại lượng đo được và nồng độ. Tính tuyến tính
trong một miền giá trị được xác định bằng hệ số tương quan R.
Cách tiến hành:
Tiến hành thực nghiệm để xác định ứng với các nồng độ x biết trước, cácgiá trị định lượng được y. Như ta đã biết nếu y phụ thuộc tuyến tính vào x cónghĩa là trong khoảng nồng độ cần khảo sát đường biểu diễn của y theo x là một
đường thẳng (đoạn thẳng) theo phương trình sau: bax y hay baC A .
Dựa vào kết quả thu được từ thực nghiệm của x và y tương ứng ta tính hệ
số tương quan R. Dựa vào kết quả thu được từ thực nghiệm của x và y tươngứng ta tính hệ số tương quan R.
)()(
))((
11
1
1
n
i
i
n
i
n
i
ii
y y x x
y y x x
R
Trong đó: : Giá trị Abs đo được
: Giá trị nồng độ
: Giá trị Abs trung bình
: Giá trị nồng độ trung bình
Đánh giá: Tùy theo hoạch định mà chọn giá trị R. Thông thường chọn0,99 ≤ R ≤ 1 thì có sự tương quan tuyến tính.
c) Giới hạn phát hiện [7]
Giới hạn phát hiện: Nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độkhông đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phântích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với
phương pháp định lượng).
Có thể xác định giới hạn phát hiện dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng vàđộ dốc suy ra được từ phương trình hồi quy tuyến tính.
Giới hạn phát hiện (LOD) được tính theo công thức:
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫuthử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát.
Có thể xác định giới hạn định lượng dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng
và độ dốc suy ra được từ phương trình hồi quy tuyến tính.
Giới hạn định lượng (LOQ) được tính theo công thức:
LOD LOQ 3.3
e) Độ đúng [10]
Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm
thấy với giá trị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đãđược làm đồng nhất trong cùng điều kiện xác định. Độ đúng sẽ được tính bằng
tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất chuẩn tìm thấy so với lượng chất chuẩn thêmvào.
Cách tiến hành
Xác định hàm lượng hoạt chất cần đem thử bằng phương pháp đề xuất.
Thêm một lượng chất chuẩn của hoạt chất cần thử với hàm lượng bằng với hàmlượng trung bình ±20% của chất đó trong mẫu đem thử. Tiến hành định lượng
bằng phương pháp đề xuất để tìm hàm lượng của phần thêm vào chất cần thử,
từ kết quả thu được xác định tỷ lệ % tìm lại của chất đem thử:
100
3
21
M
M M Đ
Trong đó: M1: Tổng lượng tìm thấy
M2: Lượng sẵn có M3: Lượng thêm vào
Đánh giá: Phương pháp thử nghiệm được chấp nhận khi độ đúng trung bình có giá trị thuộc khoảng 98% ≤ Σ ĐTB ≤ 102%.
f) Độ lặp lại [10]
Độ lặp lại (hay độ chính xác): Mức độ sát gần giữa các kết quả thử riênglẻ với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng
một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định. Độ lặp lại bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên.
Độ lặp lại thường được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (SD) hay độ lệchchuẩn tương đối (RSD) của một loạt các lần thử ngiệm .
Cách thực hiện
Với cùng một mẫu được làm đồng nhất, tiến hành định lượng bằng phương pháp đề xuất n lần (n = 6 –10 hay nhiều hơn). Sau đó áp dụng công thức tínhSD và RSD của phương pháp:
1
)(
n
x xSD
i
; x
SD RSD
Đánh giá: RSD càng nhỏ thì phương pháp càng chính xác, thường giá trịRSD < 2%.
Đề tài được thực hiện tại phòng Vật lý đo lường, Trung tâm Kiểm nghiệmThuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm thành phố Cần Thơ. Thời gian thực hiện từ15/07/2014 – 15/10/2014
3.2 Hoá chất thiết bị Bảng 3.1: Hoá chất và thiết bị
Hoá chất Thiết bị
Kali dihydrophosphat
Dinatri hydrophosphat
Chuẩn nguyên liệu Cephalexin 94.8%
Nước cất
Máy quang phỏ UV-Vis Hitachi 2900
Máy siêu âm hoà tan
Máy pH
Cân phân tích
Bình định mức, pipet, bình tam giác, phiễu lọc
3.3
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp lấy mẫu
Trung tâm tiến hành lấy mẫu ngẫu nhiên ở một số nhà thuốc tây trên địa
bàn thành phố Cần Thơ, mỗi mẫu lấy 2 lô, ứng với mỗi lô thuốc sẽ lấy 60 viên
bất kì.
Đề tài tiến hành lấy và nghiên cứu trên các mẫu viên nang sau: Hapenxin
Đề tài tiến hành nghiên cứu bằng phương pháp quang phổ UV-Vis.
3.3.3
Phương pháp xử lý kết quả
Các kết quả nghiên cứu sẽ được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel.
3.4 Hoạch định thí nghiệm
Thẩm định hai quy trình định lượng Cephalexin bằng phương phá p quang
phổ UV-Vis: Quy trình 1 với dung môi đệm phosphat pH5.5 và quy trình 2 với dung môi nước nhằm khảo sát: độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại,giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng.
Tiến hành định lượng lặp lại 6 lần mẫu Hapenxin 500 của CTCPDP Hậu
Giang, số lô 150114 theo quy trình:
Cân 20 viên thuốc, lau sạch nang và cân lại khối lượng 20 nang từ đó tínhkhối lượng trung bình bột thuốc trong mỗi viên, trộn đều bột thuốc. Cân lặp lại6 lần bột thuốc vừa trộn, mỗi lần tương đương 50 mg Cephalexin cho vào 6 bình
định mức 100 ml đã đánh số từ 1 – 6, ghi lại khối lượng bột thuốc trong mỗi bình. Cho thêm và mỗi bình khoảng 75 ml dung dịch đệm phosphate pH5.5,
siêu âm 15 phút. Sau đó, lấy ra định mức tới vạch bằng dung dịch đệm, lắc đềuvà lọc qua giấy lọc bỏ 20 ml đầu. Ứng với mỗi bình định mức được lọc vào 1
bình nón, các bình nón cũng được đánh số từ 1 – 6.
Hút chính xác 5 ml dịch lọc của 6 bình nón cho vào 6 bình định mức 100 mlkhác cũng được đánh số 1’ – 6’, định mức tới vạch bằng dung dịch đệm và lắc đều.Tiến hành đo độ hấp thụ của 6 bình, mỗi bình lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình.
Hàm lượng Cephalexin được tính như sau:
Từ độ hấp thụ A của các dung dịch mỗi bình, dựa vào đường chuẩn ta tìm
được nồng độ C. Sau đó áp dụng công thức sau để tính hàm lượng Cephalexin:
(%) = × 2000 ×
1000 × × × 100
Trong đó:
C: Nồng độ tính được bằng cách thế A vào phương trình hồi quy.
mtb: K hối lương trong bình bột thuốc trong mỗi viên (mg).
m: K hối lượng bột thuốc cho vào bình định mức (mg).
P: Hàm lượng Cephalexin ghi trên nhãn (mg).
2000: Độ pha loãng.
1000: Hệ số chuyển đổi.
3.6 Thẩm định quy trình 2 của phương pháp
Pha các dung dịch sau:
Dung dịch chuẩn gốc: Cân 53.5 mg chuẩn Cephalexin (hàm lượ ng 94.8%)
cho vào bình định mức, thêm 70 ml nước, siêu âm 15 phút, định mức tới vạch bằng nước.
Dung dịch thử gốc: Cân 20 viên thuốc Hapenxin 500 mg (số lô 150114 – 050116), tính giá trị trung bình bột thuốc trong mỗi viên, trộn đều. Cân 57.4 mg
Mục đích: Xác định độ chính xác của phương pháp thông qua việc so sánh
lượng tìm thấy so với lượng thực thêm vào ban đầu và được tính dựa trên tỉ lệ phần trăm tìm lại (%).
Tiến hành thí nghiệm:
Tiến hành pha các dung dịch Cephalexin theo các tỉ lệ trong bảng sau: Bảng 3.7: Dãy dung dịch khảo sát độ đúng QT2
Dung dịch
Thể tích
dung dịch chuẩn gốc
(ml)
Thể tích
dung dịch thử gốc
(ml)
Nước
1 0 3 Định mứctới vạch100 ml
2 1 3
3 2 3
4 3 3
Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch trên tại bước sóng 261 nm vớimẫu trắng là nước.
3.6.4
Khảo sát độ lặp lại
Tiến hành định lượng lặp lại 6 lần mẫu Hapenxin 500 của CTCPDP HậuGiang, số lô 150114 theo quy trình:
Cân 20 viên thuốc, lau sạch nang và cân lại khối lượng 20 nang từ đó tínhkhối lượng trung bình bột thuốc trong mỗi viên, trộn đều bột thuốc. Cân lặp lại6 lần bột thuốc vừa trộn, mỗi lần tương đương 50 mg Cephalexin cho vào 6 bình
định mức 100 ml đã đánh số từ 1 – 6, ghi lại khối bột thuốc trong mỗi bình. Cho
thêm và mỗi bình khoảng 75 ml nước, siêu âm 15 phút. Sau đó, lấy ra định mức
tới vạch bằng dung dịch đệm, lắc đều và lọc qua giấy lọc bỏ 20 ml đầu. Ứng với
mỗi bình định mức được lọc vào 1 bình nón, các bình nón cũng được đánh sốtừ 1 – 6.
Hút chính xác 5 ml dịch lọc của 6 bình nón cho vào 6 bình định mức 100
ml khác cũng được đánh số 1’ – 6’, định mức tới vạch bằng nước và lắc đều.Tiến hành đo độ hấp thụ của 6 bình mỗi bình lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình .
Hàm lượng Cephalexin được tính như sau:
Từ độ hấp thụ A của các dung dịch mỗi bình, dựa vào đường chuẩn ta tìm
được nồng độ C. Sau đó áp dụng công thức sau để tính hàm lượng Cephalexin:
Luận văn Tốt nghiệp Đại học Chương 4: KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
31 Nguyễn Lầu Hai
Bảng 4.9: Hàm lượng các mẫu khi định lượng bằng QT2
Mẫu Lượ ng cân(mg)
Abstrungbình
Nồng độ C
(ppm)
Hàm lượ ng
(%)
1 60.4 0.5946 27.1509 107.6106
2 60.3 0.5917 27.0265 106.2237
3 58.4 0.5747 26.2533 103.2871
4 59.8 0.5944 27.1514 103.9198
5 57.6 0.5644 25.7800 104.9997
6 57.5 0.5662 25.8622 106.0394
Hình 4.7: Kết quả định lượng bằng hai quy trình.
Nhận xét: Từ kết quả định lượng các mẫu bằng hai quy trình cho thấy
hai quy trình đều cho kết quả hàm lượng nằm trong khoảng 90% - 110% so vớihàm lượng ghi trên nhãn. Vì vậy, có thể sử dụng hai quy trình để định lượngCephalexin trong dược phẩm.
Luận văn Tốt nghiệp Đại học Chương 4: KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
32 Nguyễn Lầu Hai
4.4 So sánh phương pháp Bảng 4.10: Bảng tổng hợp so sánh hai quy trình
Thông số Quy trình 1 % Sai khác Quy trình 2
% Tìm lại 100.6988% 0.0456912 100.6528%
RSD 0.3449% 42.834359 0.5329%
K ết quả địnhlượ ng
Mẫu 1 105.8947 1.6074 107.6106
Mẫu 2 106.1200 1.2159 106.2237
Mẫu 3 104.6957 1.3545 103.2871
Mẫu 4 104.1410 0.8326 103.2293
Mẫu 5 103.0946 0.1098 104.9997
Mẫu 6 103.2214 0.9692 106.0394
Nhận xét: từ bảng trên, cho thấy 2 quy trình cho kết quả định lượng cácmẫu và tỷ lệ phần trăm tìm lại không có sự sai khác đáng kể. Tuy nhiên, vì quytrình 1 cho RSD bé hơn nhiều so với quy trình 2 nên quy trình 1 sẽ cho kết quảtốt hơn quy trình 2 của phương pháp quang phổ UV-Vis. Vì vậy, có thể áp dụngQT1 trong việc kiểm tra chất lượng Cephalexin trong dược phẩm.
Luận văn Tốt nghiệp Đại học Chương 5: KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ
33 Nguyễn Lầu Hai
Chương 5: KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ
5.1 Kết luận
Sau 3 tháng thực hiện, đề tài đạt được các kết quả sau:
Xây dựng được phương pháp định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng hai quy trình: Quy trình 1 nghiên cứu sử dụng dung môi hoà tan là dung
dịch đệm phosphat pH 5.5, quy trình 2 nghiên cứu sử dụng dung môi nước.
Quy trình 1: Phổ chuẩn các dung dịch Cephalexin với các nồng độ khácnhau có tính ổn định cao và độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 261 nm, độ tuyến
tính có hệ số tương quan R 2 = 1.0000, tỉ lệ phần trăm tìm lại 100.6988%, độchính xác có RSD = 0.3449%, LOD và LOQ là 0.1205 ppm và 0.3977 ppm.
Quy trình 2: Phổ chuẩn các dung dịch Cephalexin với các nồng độ khácnhau có tính ổn định cao và độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 261 nm, độ tuyến
tính có hệ số tương quan R 2 = 1.0000, tỉ lệ phần trăm tìm lại 100.6528%, độchính xác có RSD = 0.5329%, LOD và LOQ là 0.2799 ppm và 0.9237 ppm.
Định lượng được 6 mẫu thuốc của CTCPDP Hậu Giang, Cửu Long vàImexpharm đều cho kết quả định lượng đạt yêu cầu cho phép 90% - 110% hàm
lượng Cephalexin so với lượng ghi trên nhãn.
Với những kết quả đạt được nghiên cứu đã chứng minh được phương phápquang phổ UV – Vis có thể thay thế phương pháp HPLC trong việc kiểm trachất lượng Cephalexin trong dược phẩm với thời gian phân tích nhanh, ít sửdụng các dung môi độc hại và thiết bị ít tốn kém hơn so với phương pháp HPLCnhưng vẫn đảm bảo độ chính xác cao.
5.2 Kiến nghị
Có thể áp dụng phương pháp quang phổ UV – Vis để xác định hàm lượngCephalexin trong dược phẩm.
Nếu có thời gian và điều kiện, nghiên cứu tiếp tục khảo sát thêm trong
vùng Vis, thẩm định phương pháp HPLC, từ đó so sánh và đưa ra phương pháptối ưu trong xác định Cephalexin trong dược phẩm.