-
Biologia z genetyką Ćwiczenie 05 08.12.2020.
Kornelia Polok, [email protected] 1 z 12
Ćwiczenie 05
Reakcja PCR: przebieg reakcji. Projektowanie reakcji PCR:
startery, warunki reakcji.
Odmiany PCR.
Kornelia Polok
1. Reakcja PCR: przebieg reakcji
1.1. Podstawy teoretyczne reakcji PCR
1.1.1. PCR: reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. Polymerase Chain
Reaction) jest reakcją replikacji DNA in vitro. Pozwala ona na
powielenie danego fragmentu DNA w wielu kopiach. Reakcja PCR składa
się z szeregu pojedynczych reakcji zwanych cyklami. W każdym cyklu
ilość cząsteczek DNA się podwaja. Reakcja PCR służy do namnożenia
DNA, który później można poddać analizom, np. sekwencjonowaniu.
Typowa reakcja PCR wymaga znajomości sekwencji, którą chcemy
powielić. Niektóre odmiany reakcji PCR wykorzystują tzw.
uniwersalne startery i pozwalają na namnożenie wielu sekwencji
rozpoznawanych przez starter w genomie. Są to tzw. markery DNA
oparte o reakcję PCR.
1.1.2. Reakcja PCR wykorzystuje właściwości fizyko-chemiczne
DNA, które zależą od temperatury. Struktura helikalna DNA ulega
destabilizacji wraz ze wzrostem temperatury. Powyżej pewnej
temperatury krytycznej, zwanej temperaturą topnienia, nici DNA
ulegają całkowitej separacji i występują jako fragmenty
jednoniciowe. Jest to wynikiem zerwania wiązań wodorowych. Poniżej
temperatury topnienia występuje spektrum możliwości, od lokalnych
fragmentów jednoniciowych do całkowitego
Rys. 1.1.2. Zależność denaturacji DNA wirusowego (niebieska
linia) i bakteryjnego (czerwona) od temperatury. W temperaturze
bliskiej 100oC prawie cały DNA jest zdenaturowany.
-
Biologia z genetyką Ćwiczenie 05 08.12.2020.
Kornelia Polok, [email protected] 2 z 12
splecenia DNA. W zależności od temperatury mieszaniny, DNA może
występować w postaci częściowo zdenaturowanej, co umożliwia dostęp
starterów i polimerazy, całkowicie zdenaturowanej lub w postaci
podwójnej spirali. Tym samym manipulując temperaturą reakcji możemy
doprowadzać do namnożenia DNA lub nie. Temperatura topnienia jest
różna dla poszczególnych typów DNA, zależy od zawartości GC.
Dlatego nie ma jednolitej, standardowej temperatury dla reakcji
PCR. Dla każdej matrycy i każdego typu starterów musi ona być na
nowo optymalizowana. Ponadto manipulując temperaturą mieszaniny
możemy regulować specyfiką reakcji.
Temperatura topnienia: temperatura, w której 50% nici DNA
występuje w postaci zdenaturowanej
(pojedyncze nici) i 50% w postaci podwójnej helisy.
1.1.3. Reakcja PCR jest bardzo czuła. Pozwala ona na namnożenie
nawet pojedynczej cząsteczki DNA. Cecha ta jest szczególnie
przydatna, gdy dysponujemy małą ilością materiału genetycznego, np.
DNA ze śladów kopalnych. Z drugiej strony czułość reakcji PCR
wymaga dużej precyzji przy analizie materiału genetycznego, gdyż
każde zanieczyszczenie może prowadzić do błędnych wyników. Jeżeli
badana próba zawiera materiał genetyczny różnego pochodzenia, to
każdy materiał się może namnożyć. Startery zaprojektowane dla danej
sekwencji nie rozwiązują problemu, gdyż sekwencje homologiczne
występują w genach różnych organizmów. Tym samym warunkiem
prawidłowego przeprowadzenia reakcji PCR jest czysty materiał
genetyczny. W przeciwnym razie zamiast namnożyć DNA poszukiwanej
sekwencji, namnożymy każdą sekwencję podobną. W diagnostyce
prowadzi do otrzymania wyników fałszywie pozytywnych, które mogą
pociągnąć określone konsekwencje prawne.
1.2. Etapy reakcji PCR
1.2.1. Denaturacja, 94-95oC: jest to przekształcenie dwuniciowej
cząsteczki DNA w jednoniciową. Ma ona na celu rozdzielenie nici DNA
tak, aby umożliwić przyłączenie się starterów oraz polimerazy. W
warunkach naturalnych nici DNA są rozdzielane za pomocą helikaz i
topoizomeraz, a stabilizują je białka SSB. W reakcji PCR
rozdzielenie nici odbywa się przez inkubację w wysokiej
temperaturze, tj. 94-95oC. W tej temperaturze DNA występuje w
postaci pojedynczych nici.
1.2.2.
5’ATGCGGGCTACGATAAGACATCCG3’
1. Denaturacja DNA: 94oC
5’ATGCGGGCTACGATAAGACATCCG3’
3’TACGCCCGATGCTATTCTGTAGGC5’
Rys. 1.2.1. Denaturacja fragmentu DNA o sekwencji,
ATGCGGGCTACGATAAGACATCCG. Sekwencję zawsze zapisujemy od 5’ do 3’.
Ponieważ jest to DNA, musimy dopisać nić komplementarną o odwrotnej
polarności, czyli od 3’ do 5’. W ten sposób uzyskamy odcinek DNA,
który będzie powielany w reakcji PCR.
-
Biologia z genetyką Ćwiczenie 05 08.12.2020.
Kornelia Polok, [email protected] 3 z 12
1.2.2. Annealing (przyłączanie starterów), 36-70oC: jest to
proces przyłączania starterów do matrycy DNA. Polimeraza DNA nie ma
możliwości przeprowadzania syntezy de novo. Potrafi ona jedynie
dołączać nukleotydy do już istniejącego łańcucha. W komórkach
replikacja rozpoczyna się od syntezy krótkich odcinków RNA za
pomocą polimerazy RNA. Dopiero do tych odcinków polimeraza DNA
dobudowuje nukleotydy. W reakcji PCR nie można wykorzystać RNA,
gdyż jest to cząsteczka niestabilna, która w temperaturach >37oC
ulega rozkładowi. Dlatego w reakcji PCR wykorzystuje się krótkie
odcinki DNA, które pełnią podobną funkcję jak fragmenty RNA w
replikacji in vivo.
Startery: krótkie odcinki DNA wykorzystywane w reakcji PCR w
celu rozpoczęcia reakcji namnażania DNA
in vitro czyli amplifikacji. Startery mają 10-30 nukleotydów,
najczęściej około 20 nukleotydów.
W trakcie annealingu dochodzi także do renaturacji DNA
matrycowego czyli procesu ponownego łączenia się i zwijania nici
DNA. Proces zależy od temperatury i pH.
Warunkiem rozpoczęcia reakcji namnażania DNA przez polimerazę
jest połączenie się startera z fragmentem komplementarnym na
matrycy DNA. Stabilność i specyfika tego połączenia zależy od
temperatury. Optymalną temperaturą jest temperatura topnienia
fragmentu, który ma się przyłączyć do matrycy. Powyżej tej
temperatury starter się nie przyłączy, gdyż będzie występował w
postaci jednoniciowego fragmentu. Uniemożliwi to przeprowadzenie
reakcji PCR nawet w sytuacji, gdy odpowiednia matryca znajdzie się
w mieszaninie reakcyjnej.
Poniżej temperatury topnienia, ze względu na szybką denaturację
matrycy, starter przyłączy się do jednoniciowych fragmentów
matrycy, które są częściowo komplementarne, np. w 50%, 60%, 80%
itd. Dlatego temperatura annelingu jest podstawowym wyznacznikiem
specyfiki reakcji PCR.
3’TAGGC5’
Annealing czyli przyłączanie starterów: 36-70oC
5’ATGCGGGCTACGATAAGACATCCG3’
3’TACGCCCGATGCTATTCTGTAGGC5’
5’ATGCG3’
Rys. 1.2.2a. Przyłączanie starterów do sekwencji
ATGCGGGCTACGATAAGACATCCG. Dla uproszczenia pokazano startery
5-nukleotydowe. Startery przyłączają się zgodnie z zasadą
komplementarności. Amplifikacji ulega sekwencja oflankowana
starterami. Pojęcia starter Forward i Reverse są umowne, ułatwiają
porozumiewanie się. Układ Forward i Reverse jest zachowany tylko w
przypadku, gdy sekwencja aplifikowana jest sekwencją sensowną, a
więc znany jest produkt genu. Jeżeli produkt genu nie jest znany,
to nić sensowna nie jest znana. Może zdarzyć się, że nicią sensowną
(kodującą) jest nić 3’ do 5’. Wówczas starter Reverse funkcjonuje
jako Forward i vice versa.
Starter Forward
Starter Reverse
-
Biologia z genetyką Ćwiczenie 05 08.12.2020.
Kornelia Polok, [email protected] 4 z 12
Różna specyfika reakcji PCR w zależności od temperatury
annelingu może być wykorzystana w badaniach. Przykładowo, jeżeli
chcemy zamplifikować gen u organizmu A, ale tego genu nie znamy,
natomiast znana jest sekwencja genu u gatunku B to możemy
zaprojektować startery na podstawie gatunku B. następnie możemy
przeprowadzić PCR w temperaturze poniżej temperatury optymalnej
wyznaczonej przez temperaturę topnienia. Startery mogą się
przyłączyć do najbardziej podobnego fragmentu DNA matrycowego.
Obniżenie temperatury annealingu umożliwia połączenie z fragmentami
komplementarnymi np. w 70%. Dzięki temu możliwe jest zamplifikownie
genu homologicznego u gatunku A.
Konieczność wykorzystania starterów w reakcji PCR powoduje, że
aby ją przeprowadzić musimy znać sekwencję, którą chcemy namnożyć.
Aby ten warunek ominąć wykorzystuje się czasami pojedynczy, losowo
skomponowany starter. Wówczas, jeżeli taki starter znajdzie
sekwencje komplementarne w niewielkiej odległości (1000–4000 par
zasad) to możemy fragment oflankowany takim starterem namnożyć. W
ten sposób ujawniamy tzw. markery skanujące genom. Innym sposobem
ominięcia tej niedogodności jest cięcie DNA matrycowego enzymami
restrykcyjnymi i przyłączenie specjalnie przygotowanych
oligonukleotydowych odcinków zwanych adapterami do miejsc cięcia. W
ten sposób wykrywa się miejsca insercji transpozonów.
Na proces annealingu wpływa także struktura starterów. Startery
z większą liczbą zasad GC tworzą stabilniejsze wiązania. Dlatego
dobrze zaprojektowane startery powinny mieć co najmniej 50% zasad
GC. Ponadt startery nie powinny tworzyć struktur drugorzędowych, a
także nie powinny tworzyć dimerów zarówno w obrębie danego startera
(homodimery) oraz pomiędzy różnymi starterami (heterodimery).
1.2.3. Elongacja: czyli wydłużanie łańcucha DNA, za pomocą
polimerazy DNA, 72oC. Jest to właściwa replikacja in vitro.
Elongację może przeprowadzić każda polimeraza DNA (np. fragment
Klenowa z E. coli). Jednakże warunkiem przeprowadzenia reakcji i
dostępu do DNA jest rozplecenie nici (denaturacja), które odbywa
się w temperaturze 94oC. W tej temperaturze większość polimeraz,
które są białkami ulega denaturacji i tym samym dezaktywacji. Aby
przeprowadzić reakcję PCR, taką polimerazę należałoby dostarczać
przy każdym cyklu po denaturacji, co oczywiście nie jest
praktyczne. Dlatego stosuje się polimerazy, które tolerują
temperaturę 94oC. Są to tzw. polimerazy termostabilne, które
pochodzą z bakterii żyjących w ciepłych źródłach. Najczęściej
stosuje się polimerazę z Thermus aquaticus i Thermus flavus. Obie
bakterie należą do
A C B
Rys. 1.2.2b. Struktury drugorzędowe starterów. A. Szpilka do
włosów powstaje w temperaturze poniżej optymalnej. B. Struktura
pośrednia, może powstać w temperaturze optymalnej i wówczas
uniemożliwia amplifikację. C. Jednoniciowa struktura.
Rys. 1.2.3a. Kolonia Thermus aquaticus.
-
Biologia z genetyką Ćwiczenie 05 08.12.2020.
Kornelia Polok, [email protected] 5 z 12
Archaea, klasy Deinococci. Bakterie te po raz pierwszy
zidentyfikowano w Parku Yellowstone w źródłach o temperaturze
53-86oC, a następnie ich obecność potwierdzono w 53 różnych
lokalizacjach. Optimum polimerazy DNA z tych bakterii to 72oC, a
więc jest to temperatura elongacji. Jednakże wytrzymują one również
temperaturę 94-95oC, co umożliwia przeprowadzenie wielu cykli
reakcji namnażania DNA bez dodawania polimerazy w każdym cyklu.
Geny polimerazy DNA pochodzące z obu bakterii wklonowano do
Escherichia coli. Dostępne na rynku termostanilne polimerazy DNA
powstają w genetycznie zmodyfikowanej E. coli.
2. Projektowanie reakcji PCR
2.1. Składniki i ich stężenia
2.1.1. Obiekt badań i liczebność prób
Analizą należy objąć 4 populacje sosny zwyczajnej.
Z każdej populacji należy pobrać 6 prób.
Należy uwzględnić dodatkową próbę ze względu na straty podczas
pipetowania.
2.1.2. Analizowana sekwencja
Analiza obejmie geny 18S rDNA, dla których zaprojektowano dwa
startery:
Forward: PS-F
Reverse: PS-R
2.1.3. Roztwory podstawowe i objętość reakcji
Roztwór podstawowy to roztwór jakim dysponujemy, np. mamy MgCl2
o stężeniu 25 mM, bufor o stężeniu 20 x itd.
Należy określić ile każdego z roztworów podstawowych podanych w
tabeli 1 należy pobrać aby otrzymać 20 l roztworu o stężeniu
podanym dla próby, np. stężenie MgCl2 w próbie ma być 1.5 mM, bufor
o stężeniu 1 x itd.
Objętość mieszaniny reakcyjnej dla pojedynczej próby wynosi 20
μl.
GGCTACGATAAGACATCCG
3. Elongacja czyli wydłużanie łańcucha 72oC
5’ATGCGGGCTACGATAAGACATCCG3’
3’TACGCCCGATGCTA TT CTGTAGGC5’
5’ATGCG
3’TACGCCCGATGCAATTCTG
Rys. 1.2.3b. Polimeraza DNA dołącza nukleotydy do starterów i
wydłuża łańcuch DNA.
-
Biologia z genetyką Ćwiczenie 05 08.12.2020.
Kornelia Polok, [email protected] 6 z 12
2.1.4. Proszę uzupełnić tabelę.
Liczba prób: 1 punkt
Kolumna 3: 3 punkty
Kolumna 4: 2 punkty
Ilość i sposób dodania DNA: 2 punkty
L.p. Składnik Stężenie w próbie
Roztwór podstawowy
Ilość w próbie [μl]
Ilość dla ____ prób [μl]
1 H2O
2. Bufor: 20 mM (NH4)2SO4, 50 mM Tris-HCl
1x 20 x stężony
3. MgCl2 2,0 mM 25 mM
4. Wzmacniacz (betaine)
1 X 10 x stężony
5. Nukleotydy: dNTP (dATP + dCTP +dGTP + dTTP)
200 M 10 mM
6 Startery: katG1-F katG1-R
1 M 1 M
20 M 20 M
7. Polimeraza DNA, Tfl lub Taq 2 U 1U/ l
8. DNA 80 ng 20 ng/ l
Objętość próby:
Czas wykonania: 15 minut
2.2. Ustalanie temperatury przyłączania starterów
2.1.1. Startery przyłączają się do sekwencji komplementarnych.
Odległość między starterami nie może być zbyt duża. Typowe
polimerazy bez problemu amplifikują sekwencje do 4 000 par zasad.
Polimerazy specjalnie przygotowane mogą amplifikować odcinki do 10
000 par zasad. Warunki reakcji należy tak dobrać aby startery
przyłączyły się jedynie do sekwencji komplementarnych.
2.1.2.Temperatura przyłączania starterów decyduje o specyfice
reakcji. Powinna ona być jak najbliższa temperaturze topnienia
starterów. Temperatura topnienia jest taką temperaturą, w której
połowa starterów w mieszaninie jest zdenaturowana.
2.1.3. W reakcji PCR wykorzystujemy dwa startery, co oznacza, że
musimy dobrać temperaturę topnienia tak aby była ona jak najbliższa
obu starterom. Jeżeli temperatura topnienia będzie zbyt wysoka
wówczas startery się nie przyłączą i nie powstaną produkty reakcji
PCR. Z kolei zbyt niska temperatura powoduje przyłączanie się
starterów do sekwencji, które nie są w pełni komplementarne. W
efekcie reakcja
-
Biologia z genetyką Ćwiczenie 05 08.12.2020.
Kornelia Polok, [email protected] 7 z 12
jest niespecyficzna tzn. amplifikowane są wszystkie sekwencje,
które są oflankowane sekwencjami częściowo komplementarnymi do
starterów.
2.1.4. Temperaturę topnienia należy obliczyć dla każdego
startera osobno, a następnie należy je porównać i wybrać jak
najbardziej zbliżoną do obu starterów. Przyjmuje się, że
temperatura pomiędzy starterami nie powinna się różnić o więcej niż
5oC. Testuje się najczęściej 2-3 temperatury w zakresie wyznaczonym
przez startery.
2.1.5. Jeżeli różnica temperatur pomiędzy starterami jest zbyt
duża (>5oC) wtedy projektuje się nowe startery.
2.3. Wyznaczanie temperatury przyłączania starterów
Poniżej podana jest para starterów komplementarna do odcinka
genu KatG u M. tuberculosis. KatG1-F: 5’GAC TAC GCC CAA CAG CTC C3,
KatG2-R: 5’GCG ATA ACC CCG CAA GAC 3’
A. Na podstawie wzoru podanego na wykładzie proszę obliczyć
temperaturę topnienia obu starterów. Dla logNa+ proszę przyjąć
wartość log0,05 = -1,3 (2 punkty)
B. Czy startery te umożliwiają ustalenie temperatury annealingu?
Jeżeli tak, to proszę podać wartości temperatur, które należy
przetestować. (2 punkty)
C. Co można zrobić aby temperatura topnienia obu starterów była
taka sama? (2 punkty)
Czas wykonania: 15 minut
3. Odmiany reakcji PCR
Reakcja PCR zasadniczo zawsze obejmuje te samy etapy. Różnice
pomiędzy poszczególnymi reakcjami temperatury annealingu, dotyczą
czasów poszczególnych etapów, i liczby cykli. Temperatura
annealingu zależy od wykorzystywanych starterów, natomiast czasy
poszczególnych etapów i liczba cykli związane są z długością
analizowanego fragmentu, liczbą spodziewanych fragmentów oraz
wielkością genomu. Im dłuższy fragment ma być namnożony, tym
dłuższy czas etapu elongacji i liczba cykli, Natomiast im większy
genom tym dłuższy czas annealingu i liczba cykli. Przy czym zbyt
długie czasy i liczby cykli zwiększają prawdopodobieństwo reakcji
niespecyficznej. Przykładowo 45 tykli dla fragmentu wirusa o
długości 200 par zasad to zdecydowanie za dużo. Namnożą się
wszystkie zanieczyszczenia w próbie, powstaną dimery lub reakcja
będzie niespecyficzna. Wystarczyłoby 25 cykli w przypadku genomu
wirusowego. Natomiast w celu namnożenia 1000 par zasad z genomu
sosny (20 miliardów pz) potrzeba 35 cykli. Z kolei dla
identyfikacji miejsc insercji transpozonów w dużych genomach należy
wykorzystać około 45 cykli.
Pojęcie odmian reakcji PCR często odnosi się nie do samej
reakcji, ale sposobu wykrywania produktów reakcji oraz rodzaju
użytej matrycy.
-
Biologia z genetyką Ćwiczenie 05 08.12.2020.
Kornelia Polok, [email protected] 8 z 12
3.1. Standardowa reakcja PCR
Jest to reakcja PCR, w której matrycą jest DNA genomowe lub
plazmidowe, natomiast produkty reakcji wykrywa się za pomocą
elektroforezy na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym.
Alternatywnie możliwy jest odczyt jako piki w sekwenserach. Jest to
reakcja jakościowa, która odczytuje obecność lub brak danego
fragmentu. Reakcja taka jest najczęściej stosowana w badaniach nad
genomami, badaniach ewolucyjnych. Standardowy PCR w połączeni u z
sekwencjonowaniem wykorzystywany jest w diagnostyce chorób
genetycznych.
3.2. RT-PCR
Reakcja PCR pozwala na powielenie tylko i wyłącznie DNA.
Tymczasem w badaniach nad ekspresją genów wykorzystuje się RNA.
Również niektóre wirusy zawierają RNA. Wykorzystanie RNA w PCR nie
jest możliwe ponieważ:
RNA jest niestabilne i podczas zmian temperatury się
rozpadnie;
Polimerazy RNA syntetyzują RNA na matrycy DNA, a więc nie ma
możliwości syntezy RNA na matrycy RNA.
Aby móc wykorzystać reakcję PCR do analizy RNA, należy RNA
przekształcić na DNA. Dokonuje się tego za pomocą enzymu, odwrotnej
transkryptazy. Jest to polimeraza DNA, RNA zależna. Wykorzystywana
jest ona przez retrowirusy. U Eukariota odwrotna transkryptaza jest
wykorzystywana do syntezy telomerów. Proces przekształcenia RNA w
DNA nosi nazwę odwrotnej transkrypcji (reverse transcription – RT).
W wyniku odwrotnej transkrypcji otrzymujemy DNA, który nosi nazwę
cDNA (complementary DNA) ze względu na komplementarność jednej z
nici do RNA.
Jeżeli w reakcji PCR wykorzystujemy cDNA zamiast DNA to taką
reakcję oznaczamy jako RT-PCR. Jest to istotna informacja, gdyż
oznaczenie RT-PCR pozwala stwierdzić, że otrzymany produkt PCR nie
ma intronów, a także, że produkty RT-PCR dla danego genu mogą się
różnić, gdy materiałem wyjściowym były różne tkanki lub organy.
Rys. 1.3.1. Miejsca insercji transpozonów pokazane na żelu
poliakrylamidowym (po lewej) i agarozowym (po prawej).
-
Biologia z genetyką Ćwiczenie 05 08.12.2020.
Kornelia Polok, [email protected] 9 z 12
Należy odróżnić reakcję odwrotnej transkrypcji od reakcji PCR.
To są dwie różne reakcje, które powinny być przeprowadzane
oddzielnie ze względu na różną specyfikę. Firmy komercyjne czasami
przygotowują zestawy do RT-PCR w taki sposób, że reakcja odwrotnej
transkrypcji oraz PCR przebiega w tej samej probówce. Wówczas do
mieszaniny dodaje się zarówno odwrotną transkryptazę jak i
polimerazę DNA. Zestawy takie upraszczają pracę, ale bardzo
obniżają specyfikę reakcji. W efekcie uzyskane wyniki mogą nie być
wiarygodne.
3.3. PCR w czasie rzeczywistym: qPCR, real-time PCR
PCR w czasie rzeczywistym różni się od standardowego PCR
odczytem produktu, który jest dokonywany w komputerze, a nie na
żelu. Odczytu można dokonać przez przyłączenie do produktu sondy
fluorescencyjnej, która jest wykrywana przez specjalne czujniki.
Ponieważ reakcja jest ilościowa tzn. im więcej produktu, tym
silniejszy sygnał możliwe jest określenie ilości otrzymanego
produktu. Z tego względu PCR w czasie rzeczywistym określa się jako
PCR ilościowy (quantitative – qPCR). Ponadto odczyt za pomocą sondy
fluorescencyjnej w połączeniu z odpowiednim oprogramowaniem pozwala
śledzenie przyrostu ilości produktu podczas reakcji PCR. Stąd
wynika nazwa — PCR w czasie rzeczywistym.
Główną zaletą qPCR jest odczyt ilości produktu, który jest
skorelowany z wyjściową ilością cDNA/RNA. Tym samym qPCR umożliwia
śledzenie ekspresji genów np. podczas działania stresu, w czasie
choroby. Wykorzystywany jest on także w śledzeniu wiremii w
chorobach wirusowych. Dodatkową korzyścią jest rezygnacja z
kłopotliwych żeli.
Rys. 3.2. Schemat reakcji odwrotnej transkrypcji.
-
Biologia z genetyką Ćwiczenie 05 08.12.2020.
Kornelia Polok, [email protected] 10 z 12
PCR w czasie rzeczywistym podobnie jak standardowy PCR wymaga
czystego materiału genetycznego, optymalizacji dla danych warunków,
w tym bardzo dokładnego dobrania temperatury przyłączania starterów
oraz liczby cykli. Ze względu na brak kontroli na żelu, zbyt
krótkie produkty PCR (np. 200 pz) mogą być trudne do odróżnienia od
właściwego produktu. Ponadto qPCR jest bardzo wrażliwy na
zanieczyszczenia obcym materiałem genetycznym również ze względu na
brak kontroli na żelu. Analiza na żelu pozwala określić długość
amplikowanych produktów, tym samym właściwy produkt jest łatwy do
odróżnienia od dimerów czy homologów. W qPCR żel nie jest
wykorzystywany i odróżnienie właściwego produktu od dimeru czy
homologa jest prawie niemożliwe. Dlatego stosowanie qPCR w celach
diagnostycznych zawsze powinno być połączone z kontrolą jakości
matrycy, kontrolą produktu na żelu lub sekwencjonowaniem.
Obecnie rezygnuje się z qPCR na rzecz RNAseq – sekwencjonowania
RNA jako metody bardziej wiarygodnej.
Rys. 3.3. Wynik reakcji qPCR dla rDNA Pinus. Wykresy na różnej
wysokości ukazują różną ilość produktu w próbach. Koreluje to z
różną liczbą powtórzeń rDNA w poszczególnych próbach.
-
Biologia z genetyką Ćwiczenie 05 08.12.2020.
Kornelia Polok, [email protected] 11 z 12
Klucz
2. Projektowanie reakcji PCR
2.1. Składniki i ich stężenia
L.p. Składnik Stężenie w próbie
Roztwór podstawowy
Ilość w próbie [μl]
Ilość dla ____ prób [μl]
1 H2O 7 175
2. Bufor: 20 mM (NH4)2SO4, 50 mM Tris-HCl
1x 20 x stężony 1 25
3. MgCl2 2,0 mM 25 mM 1,6 40
4. Wzmacniacz (betaine)
1 X 10 x stężony 2 50
5. Nukleotydy: dNTP (dATP + dCTP +dGTP + dTTP)
200 M 10 mM 0,4 10
6 Startery: katG1-F katG1-R
1 M 1 M
20 M 20 M
1 1
25 25
7. Polimeraza DNA, Tfl lub Taq 2 U 1U/ l 2 50
8. DNA 80 ng 20 ng/ l 4 -
Objętość próby: 20 l 400
Przygotowujemy mieszaninę reakcyjną ze wszystkich
składników.
Rozdzielamy do probówek po 16 l.
Do każdej probówki dodajemy 4 l DNA z poszczególnych prób.
-
Biologia z genetyką Ćwiczenie 05 08.12.2020.
Kornelia Polok, [email protected] 12 z 12
2.3. Wyznaczanie temperatury przyłączania starterów
Poniżej podana jest para starterów komplementarna do odcinka
genu KatG u M. tuberculosis.
KatG1-F: 5’GAC TAC GCC CAA CAG CTC C3’ KatG2-R: 5’GCG ATA ACC
CCG CAA GAC 3’
A. Na podstawie wzoru podanego na wykładzie proszę obliczyć
temperaturę topnienia obu starterów. Dla logNa+ proszę przyjąć
wartość log0,05 = -1,3
Korzystamy ze wzoru: Tm = 81.5 + 16.6 (logNa+) + 41 ∑G+C/długość
– 600/długość
logNa+ = 0,05 zatem wzór przyjmuje postać: Tm = 81.5 + 16.6
(-1,3) + 41 ∑G+C/długość – 600/długość
Po przeliczeniu wartości stałych otrzymujemy: Tm = 59,92 + 41
∑G+C/długość – 600/długość
KatG1-F o Długość KatG1-F: 19 zasad o Suma G+C = 12 o Tm = 59,92
+ 41(12/19) -600/19
Tm = 59,92 +25,89 – 31,58
Tm = 54,23
KatG1-R o Długość KatG1-RF: 18 zasad o Suma G+C = 11 o Tm =
59,92 + 41(11/18) -600/18
Tm = 59,92 +25,06 – 33,33
Tm = 51,65
B. Proszę Czy startery te umożliwiają ustalenie temperatury
annealingu? Jeżeli tak, to proszę podać wartości temperatur, które
należy przetestować.
Różnica temperatur wynosi 2,58oC, a więc jest mniejsza niż 5oC.
Zatem można ustalić temperaturę annealingu. Powinno się
przetestować temperatury: 52oC, 53oC i 54oC.
C. Co można zrobić aby temperatura topnienia obu starterów była
taka sama?
We wzorze uwzględnia się długość starterów oraz liczbę G+C.
Dlatego manipulując tymi wartościami można dobrać startery o
jednakowej temperaturze topnienia.
Starter KatG-F ma 19 zasad a KatG-R 18. Wystarczy skrócić KatG-F
o jedną zasadę, wówczas startery będą miały taką samą długość.
Starter KatG-F ma 12 G+C natomiast starter KatG-R ma 11 zasad
G+C. W starterze KatG-F ostatnia zasada (5’ do 3’) to C. Jeżeli
pominiemy tę zasadę to starter KatG-F będzie miał 18 zasad i 11
zasad G+C. Tym samym będzie miał taką samą temperaturę topnienia
jak KatG-R.
Odpowiedź: usunąć ostatnią zasadę, C (5’ do 3’) w starterze
KatG1-F
1. Reakcja PCR: przebieg reakcji.1.1. Podstawy teoretyczne
PCR1.2. Etapy reakcji PCR
2. Projektowanie reakcji PCR2.1. Składniki i ich stężenia2.2.
Ustalanie temperatury przyłączenia starterów2.3. Zadanie
3. Odmiany reakcji PCR3.1. Standardowa reakcja PCR3.2.
Rt-PCR3.3. PCR w czasie rzeczywistym
Klucz2.1. Składniki i ich stężenia2.3. Wyznaczanie temperatury
przyłączania starterów