ESTUDO DA DESCELULARIZAÇÃO TECIDUAL NA PRODUÇÃO DE ARCABOUÇOS BIOLÓGICOS PARA ENXERTO Haroldo A. Osório Jr. 1 , José S. P. Silva 1 , Carlos A. G. Barboza 2 , Hugo A. O. Rocha 3 1 Departamento do Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal (RN), Brasil 2 Departamento de Morfologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal (RN), Brasil 3 Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal (RN), Brasil E-mail: [email protected]Resumo: A regeneração de defeitos ósseos com perda de substância permanece um desafio terapêutico na área médica. Existem basicamente quatro tipos de enxertos: autógeno, alogênico, xenogênico e isogênico. Destes, somente peças autógenas e isogênicas estão isentas do caráter antigênico, já que os enxertos alogênicos e xenogênicos são promotores, em potencial, da resposta imunológica. É consenso ser o osso autógeno, o material mais adequado para esta finalidade, porém há limitações para o seu uso, especialmente a quantidade insuficiente no doador. Pesquisas de engenharia tecidual evidenciam que os componentes da matriz extracelular (MEC) são geralmente conservados entre as diferentes espécies sendo bem toleradas, mesmo em destinatários xenogênicos. Assim, diversas pesquisas têm sido realizadas na busca por um arcabouço substituto do osso autógeno. Para a obtenção destes arcabouços, os tecidos devem passar por um processo de remoção celular (descelularização), minimizando quaisquer efeitos adversos na composição, atividade biológica e integridade mecânica na matriz extracelular remanescente. Não há, entretanto, uma conformidade entre os pesquisadores, acerca do melhor protocolo de descelularização. A eficiência da remoção celular de um tecido depende da sua origem e dos métodos físicos, químicos e enzimáticos específicos utilizados. Cada um desses tratamentos afeta a composição bioquímica, a ultra-estrutura e o comportamento mecânico do arcabouço de matriz extracelular (MEC) remanescente, o que por sua vez, afeta a resposta imunológica ao material. Os métodos variam muito, inclusive entre
28
Embed
€¦ · Web viewIsso enfatiza a importância da escolha do protocolo de remoção celular adequado. Todavia a eficiência destes métodos varia de acordo com vários fatores, inerentes
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
ESTUDO DA DESCELULARIZAÇÃO TECIDUAL NA PRODUÇÃO DE
ARCABOUÇOS BIOLÓGICOS PARA ENXERTO
Haroldo A. Osório Jr.1, José S. P. Silva1, Carlos A. G. Barboza2, Hugo A. O. Rocha3
1Departamento do Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal (RN), Brasil2Departamento de Morfologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal (RN), Brasil3Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal (RN), Brasil
Resumo: A regeneração de defeitos ósseos com perda de substância permanece um desafio terapêutico na área médica. Existem basicamente quatro tipos de enxertos: autógeno, alogênico, xenogênico e isogênico. Destes, somente peças autógenas e isogênicas estão isentas do caráter antigênico, já que os enxertos alogênicos e xenogênicos são promotores, em potencial, da resposta imunológica. É consenso ser o osso autógeno, o material mais adequado para esta finalidade, porém há limitações para o seu uso, especialmente a quantidade insuficiente no doador. Pesquisas de engenharia tecidual evidenciam que os componentes da matriz extracelular (MEC) são geralmente conservados entre as diferentes espécies sendo bem toleradas, mesmo em destinatários xenogênicos. Assim, diversas pesquisas têm sido realizadas na busca por um arcabouço substituto do osso autógeno. Para a obtenção destes arcabouços, os tecidos devem passar por um processo de remoção celular (descelularização), minimizando quaisquer efeitos adversos na composição, atividade biológica e integridade mecânica na matriz extracelular remanescente. Não há, entretanto, uma conformidade entre os pesquisadores, acerca do melhor protocolo de descelularização. A eficiência da remoção celular de um tecido depende da sua origem e dos métodos físicos, químicos e enzimáticos específicos utilizados. Cada um desses tratamentos afeta a composição bioquímica, a ultra-estrutura e o comportamento mecânico do arcabouço de matriz extracelular (MEC) remanescente, o que por sua vez, afeta a resposta imunológica ao material. Os métodos variam muito, inclusive entre diferentes tipos de tecidos submetidos aos mesmos. Ademais o baixo arsenal de pesquisas envolvendo a descelularização de tecidos ósseos representa mais um obstáculo à chegada de um consenso protocolar. O presente projeto objetiva avaliar a influência de três dos mais usuais métodos de descelularização (SDS, Triton X-100, Tripsina) na produção de arcabouços biológicos, a partir de órgãos ósseos de camundongos, identificando o protocolo mais eficiente na remoção celular e que melhor preserva a estrutura da MEC óssea.
(Gilbert, Sellaro, & Badylak, 2006). Após a utilização de SDS, Desoxicolato de Sódio e
SDS/Desoxicolato de Sódio em protocolos de descelularização valvar, demonstrou-se que
ciclos de lavagens consecutivos são essenciais para a redução da contaminação residual
abaixo de limiares perigosos, tornando a citotoxicidade insignificante a partir de 8, 6 e 4
ciclos, respectivamente (Cebotari, et al., 2010). É importante ressaltar que lavagens são
necessárias não só para a remoção de resíduos dos agentes, mas também para a retirada de
restos celulares que tenham ficado encarcerados na estrutura dos arcabouços após a
descelularização (Schenke-Layland, et al., 2003).
3. METODOLOGIA
3.1. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O projeto foi submetido à apreciação da Comissão de Ética no Uso Animal (CEUA)
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, sendo aprovado, de acordo com o protocolo
no 020/2010.
3.2. AMOSTRA
Foram utilizados, no presente projeto, 18 camundongos (raça Albino Swiss) com 06
(seis) dias de idade, submetidos à eutanásia através da administração intraperitoneal de
pentobarbital sódico (Nembutal) (100 mg/kg) e dissecados para remoção da calvária. Também
foram utilizados 06 camundongos e 06 ratos (Wistar) com 04 meses de idade com a finalidade
de enxertia para os arcabouços obtidos, os quais receberam anestesia com 60 mg de cetamina
+ 10 mg de xilazina, ambas/kg. Terapia analgésica foi fornecida a estes espécimes através da
aplicação de 2 mg/kg de butorfanol, via subcutânea, a cada 6 horas, durante 3 dias, para os
camundongos; e 1 mg/kg de butorfanol, via subcutânea, a cada 6 horas, durante 3 dias, para os
ratos. Outro camundongo também com 04 meses de idade foi submetido à eutanásia pela
aplicação intraperitoneal de pentobarbital sódico (Nembutal) (100 mg/kg) para possibilitar a
extração de células mesenquimais da medula óssea. Todos os espécimes são oriundos do
Biotério do Departamento de Biofísica e Farmacologia do Centro de Biociências da UFRN,
mantidos em condições adequadas de temperatura e ciclo dia/noite, com água e alimentação
ad libitum.
Na primeira fase do estudo, 06 (seis) camundongos albinos com 06 (seis) dias de idade
foram submetidos à eutanásia com injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (Nembutal)
(100 mg/kg). Os fragmentos sofreram hemissecção para utilização das metades direita e
esquerda, totalizando 12 (doze) órgãos ósseos, os quais foram estudados para avaliação da
eficácia do método de descelularização.
Na segunda fase do estudo, calvárias de outros 06 (seis) camundongos com 06 (seis)
dias de idade foram utilizadas para avaliar a capacidade do arcabouço descelularizado de
promover a adesão, proliferação e diferenciação osteogênica de células mesenquimais, da
medula óssea de um camundongo com 04 meses de idade.
Na terceira fase do projeto, arcabouços descelularizados obtidos da calvária de 06
(seis) camundongos com 06 (seis) dias de idade foram implantados no tecido conjuntivo
subcutâneo de 06 (seis) camundongos e 06 (seis) ratos, todos com 04 (quatro) meses de idade.
Este procedimento abriu caminho para avaliar a intensidade da resposta inflamatória do
hospedeiro aos arcabouços, quando utilizados como enxertos alógenos e xenógenos.
3.3. AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA DESCELULARIZAÇÃO
TÉCNICA DE DESCELULARIZAÇÃO
Fragmentos ósseos frescos (calvária) foram obtidos dos animais e transportados em
uma solução hipotérmica (4ºC) de PBS ao Laboratório de Técnicas Histológicas do
Departamento de Morfologia da UFRN e congelados a -80ºC, por 48 horas. Decorrido este
tempo, os fragmentos foram descongelados, em temperatura ambiente, e desmineralizados em
solução de EDTA a 10% (Sigma, USA), por duas semanas, com troca de solução a cada dois
dias. Em seguida os órgãos ósseos foram divididos em grupos e, então, submetidos aos
diferentes protocolos de descelularização.
- Grupo I (SDS): os ossos foram incubados em um tampão Tris hipotônico (10 mM Tris, pH
8.0) com 0,1% de EDTA e então descelularizados com SDS a 0,1% (Sigma, USA) no mesmo
tampão, por 48 horas à temperatura ambiente, com agitação constante. Os arcabouços
descelularizados foram, em seguida, lavados com PBS.
- Grupo II (Tripsina): os fragmentos foram incubados sob agitação contínua em
Tripsina/EDTA (0.5% Trypsin e 0.2% EDTA – Gibco, USA) em tampão Tris hipotônico, por
48 horas a 37ºC, com duas trocas da solução de Tripsina. Os arcabouços descelularizados
foram lavados com PBS sob agitação mecânica, para remoção de substâncias residuais.
- Grupo III (Triton X-100): os órgãos ósseos foram imersos em uma solução de 1% de Triton
X-100 com 0.2% EDTA (Sigma) em tampão Tris hipotônico, por 48 h, em uma atmosfera de
5% CO2/95% ar, sob agitação contínua. Os arcabouços foram várias vezes lavados com PBS
para remoção de substâncias residuais.
ANÁLISE HISTOLÓGICA DOS ARCABOUÇOS DESCELULARIZADOS
Após a descelularização, os arcabouços foram fixados em solução de formalina a 10%,
processados rotineiramente e incluídos em parafina. Foi realizada, nas lâminas obtidas, a
coloração por Hematoxilina e Eosina para validar a ausência de núcleos celulares nos
arcabouços, o que foi feito através de contagem manual do número de osteoplastos e do
número de células ou remanescentes celulares nestes contidos. A porcentagem entre esses
achados serviu para a obtenção de achados estatísticos, verificados pelo teste de Kruskal-
Wallis, com posterior penalização e realização dos testes de Mann-Whitney, para a
identificação das diferenças significativas.
Foi realizada ainda, a coloração por Picrosirius Red, a qual permitiu a avaliação do
efeito da descelularização sobre a estrutura da matriz colagênica. Essa análise foi feita de
maneira qualitativa, classificando os resultados histológicos dos eventos analisados em fraco,
moderado e forte.
Será considerado mais eficaz o método que promover melhor remoção das células do
tecido ósseo e mantiver a integridade da matriz extracelular (MEC).
4. RESULTADOS
4.1. ANÁLISE HISTOLÓGICA (H/E)
HEMATOXILINA E EOSINA
Após um período de 48 horas de descelularização, os três grupos de amostras
indicaram aspectos histológicos visivelmente distintos entre si.
As calvárias do Grupo I (SDS) apresentavam manutenção satisfatória do seu contorno
estrutural, conservando, de maneira bem definida, áreas de osso cortical e osso medular. Estes
arcabouços apresentaram quantidade quase nula de remanescentes celulares, situados em
osteoplastos.
Os espécimes correspondentes ao Grupo II (Tripsina) foram os mais afetados, com
relação ao aspecto estrutural, pelo processo de descelularização. Áreas de fragmentação e
descontinuidade do contorno ósseo puderam ser notadas, bem como forte desagregação da
estrutura óssea, o que tornou mais difícil a distinção entre áreas de osso cortical e medular.
Com relação à presença celular, foi possível observar a total ausência de tais estruturas, na
intimidade óssea.
O Grupo III (Ttiton X-100) foi o que demonstrou melhor manutenção estrutural.
Continuidade tecidual e boa conservação de osteoplastos puderam ser verificadas. Zonas
corticais e medulares bem definidas também representaram achados notórios nesse grupo.
Este último protocolo de descelularização foi, notadamente, o que mais conservou
remanescentes celulares no arcabouço ósseo.
Os dados estatísticos referentes à contagem de células nos arcabouços dos três
diferentes grupos estão listados na Tabela 1.
Tabela 1 – Comparação da quantidade de remoção celular entre os três protocolos de descelularização
Comparação Média dos Postos (A) Média dos Postos (B) p
SDS (A) vs. Tripsina (B) 6,0 3,0 0,047
Tripsina (A)vs.Triton X-100 (B) 2,5 6,5 0,014
SDS (A) vs. Triton X-100 (B) 2,5 6,5 0,021
*Valores p calculados a partir do teste Mann-Whitney** Diferença estatisticamente significativa considerando o nível alpha de 0,05
PICROSIRIUS RED
A coloração com o Picrosirius Red permitiu a análise mais detalhada da integridade
estrutural das fibras colágenas, nos arcabouços descelularizados.
Imagens correspondentes ao Grupo I foram moderadamente coradas em tonalidade
vermelha, o que denota certa conservação colagênica. O contorno das calvárias manteve-se
bem delineado, sendo inferior apenas ao verificado no Grupo III.
O mesmo resultado não foi observado com os espécimes do Grupo II, cuja coloração
foi a mais fraca dentre os três protocolos analisados. Com intensidade de marcação fraca,
tendendo a cor rosa, os arcabouços pertencentes a este grupo aparentam ter uma redução na
qualidade estrutural, verificada pelo decréscimo das fibras colágenas. É importante salientar
que o aspecto estrutural e conservação da forma anatômica foram, nesse grupo, bastante
alteradas.
O terceiro grupo foi notadamente o detentor da mais forte marcação com o corante
utilizado. O vermelho vivo, que se fez presente nas lâminas analisadas, leva a crer que houve
grande manutenção da arquitetura colagênica. Além disso, a organização estrutural das
calvárias foi visivelmente melhor, em detrimento aos demais grupos.
a
c
b
Fig. 1. Aspecto das lâminas coradas com Picrosirius Red, sob a análise de microscópio de luz polarizada. Calvárias submetidas aos protocolos de descelularização com SDS (a), Tripsina (b) e Triton X-100 (c).
5. DISCUSSÃO
No presente estudo, foi verificado, em análise histológica descritiva, que a estrutura do
arcabouço foi visivelmente melhor mantida sob a ação do Triton X-100. Entretanto a sua
melhor performance na manutenção estrutural não foi acompanhada por igual desempenho no
que diz respeito ao grau de remoção celular. A manutenção de várias células e remanescentes
celulares, nos osteoplastos, apontam para o risco elevado, que esses arcabouços possuem, de
deflagrar uma resposta imuno-mediada, quando da enxertia em organismos.
Foi demonstrada diferença significativa entre os três tipos de protocolo utilizados. Os
dados numéricos evidenciam que o melhor desempenho na remoção celular foi no grupo
submetido ao protocolo baseado no uso da Tripsina. Todavia, sabe-se que a manutenção
estrutural é de extrema importância, principalmente nos dispositivos de enxertia cuja
exigência mecânica é intensa, como é o caso dos enxertos valvares, por isso deve-se ressaltar
que o nível de desorganização estrutural, provocado por tal agente, é potencialmente inibitório
para o correto funcionamento destes arcabouços.
Assim sendo, o estudo em tela estudo nos direciona à conclusão de que o protocolo
com o melhor potencial para fins de enxertia é o baseado na utilização do SDS, o qual
mantém satisfatoriamente a arquitetura do arcabouço e das fibras colágenas, e promove
descelularização na sua quase totalidade, com permanência de raras estruturas celulares.
Dessa maneira, espera-se que os arcabouços assim produzidos tenham organização estrutural
suficiente para permitir, em sua intimidade, a adesão, proliferação e diferenciação celular,
atuando satisfatoriamente nas funções para as quais foram designados. Ademais, é imperativo
que tais arcabouços mantenham-se livres do potencial de produzirem resposta imuno-mediada
nos organismos hospedeiros, objetivo esperado diante do nível de remoção celular promovida
pelo SDS.
REFERÊNCIAS
Badylak, S. F. (2005). Regenerative Medicine and Developmental Biology: The Role of the Extracellular Matrix. The Anatomical Record (Part B: New Anat.) , 287B, pp. 36-41.
Badylak, S. F. (2004). Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology , 12, pp. 367-377.
Badylak, S. F., Freytes, D. O., & Gilbert, T. W. (2009). Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomaterialia , 5, pp. 1-13.
Bär, A., Dorfman, S. E., Fischer, P., Hilfiker-Kleiner, D., Cebotari, S., Tudorache, I., et al. (2010). The pro-angiogenic factor CCN1 enhances the re-endothelialization of biological vascularized matrices in vitro. Cardiovascular Research , 85, pp. 806-813.
Bornstein, P., & Sage, E. H. (2002). Matricellular proteins: extracellular modulators of cell function. Current Opinion in Cell Biology , 14, pp. 608-616.
Brown, B. N., Barnes, C. A., Kasick, R. T., Michel, R., Gilbert, T. W., Beer-Stolz, D., et al. (2010). Surface characterization of extracellular matrix scaffolds. Biomaterials , pp. 428-437.
Cartmell, J. S., & Dunn, M. G. (2000). Effect of chemical treatments on tendon cellularity and mechanical properties. J Biomed Mater Res , 49, pp. 134-140.
Cebotari, S., Tudorache, I., Jaekel, T., Hilfiker, A., Dorfman, S., Ternes, W., et al. (2010). Detergent Decellularization of Heart Valves for Tissue Engineering: Toxicological Effects of Residual Detergents on Human Endothelial Cells. Artif Organs , 34 (3), pp. 206-210.
Chen, F., Yoo, J. J., & Atala, A. (1999). Acellular Collagen Matrix as a Possible “Off the Shelf" Biomaterial for Urethral Repair. Urology , 54 (3), pp. 407-410.
Conklin, B., Richter, E., Kreutziger, K., Zhong, D.-S., & Chen, C. (2002). Development and evaluation of a novel decellularized vascular xenograft. Medical Engineering & Physics , 24, pp. 173-183.
Crapo, P. M., Gilbert, T. W., & Badylak, S. F. (2011). An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials , 32, pp. 3233-3243.
Freytes, D. O., Badylak, S. F., & Webster, T. J. (2004). Biaxial strength of multilaminated extracellular matrix scaffolds. Biomaterials , 25, pp. 2353-2361.
Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., & Badylak, S. F. (2006). Decellularization of tissues and organs. Biomaterials , 27, pp. 3675-3683.
Grauss, R. W., Hazekamp, M. G., Oppenhuizen, F., Munsteren, C. J., Groot, A. C.-d., & DeRuiter, M. C. (2005). Histological evaluation of decellularised porcine aortic valves: matrix changes due to different decellularisation methods. European Journal of Cardio-thoracic Surgery , 27, pp. 566-571.
Hidalgo-Bastida, L. A., & Cartmell, S. H. (2010). Mesenchymal Stem Cells, Osteoblasts and Extracellular Matrix Proteins: Enhancing Cell Adhesion and Differentiation for Bone Tissue Engineering. Tissue Engineering: Part B , 16 (4), pp. 405-412.
Hopkins, R. A., Jones, A. L., Wolfinbarger, L., Moore, M. A., Bert, A. A., & Lofland, G. K. (Abril de 2009). Decellularization reduces calcification while improving both durability and 1-year functional results of pulmonary homograft valves in juvenile sheep. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery , 137 (4), pp. 907-913.
Hosoya, A., Hoshi, K., Sahara, N., Ninomiya, T., Akahane, S., Kawamoto, T., et al. (2005). Effects of fixation and decalcification on the immunohistochemical localization of bone matrix proteins in fresh-frozen bone sections. Histochem Cell Biol , 123, pp. 639-646.
Hudson, T. W., Liu, S. Y., & Schmidt, C. E. (2004). Engineering an Improved Acellular Nerve Graft via Optimized Chemical Processing. Tissue Engineering , 10 (9/10), pp. 1346-1358.
Hynes, R. O. (27 de Novembro de 2009). The Extracellular Matrix: Not Just Pretty Fibrils. Science , 326, pp. 1216-1219.
Junqueira, L. C., & Carneiro, J. (1995). Histologia Básica (8 ed.). Rio de Janeiro, RJ: Guanabara Koogan S.A.
Kupiec-Weglinski, J. W., Coito, A. J., Gorski, A., & Sousa, M. d. (Janeiro de 1995). Lymphocyte Migration and Tissue Positioning in Allograft Recipients: The Role Played by Extracellular Matrix Proteins. Transplantation Reviews , 9 (1), pp. 29-40.
Liao, J., Joyce, E. M., & Sacks, M. S. (2008). Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet. Biomaterials , 29, pp. 1065-1074.
Lovekamp, J. J., Simionescu, D. T., Mercuri, J. J., Zubiate, B., Sacks, M. S., & Vyavahare, N. R. (2006). Stability and function of glycosaminoglycans in porcine bioprosthetic heart valves. Biomaterials , 27, pp. 1507-1518.
Narita, Y., Kagami, H., Matsunuma, H., Murase, Y., Ueda, M., & Ueda, Y. (2008). Decellularized ureter for tissue-engineered small-caliber vascular graft. J Artif Organs , 11, pp. 91-99.
Potts, J. R., & Campbell, I. D. (1996). Structure and Function of Fibronectin Modules. Matrix Biology , 15, pp. 313-320.
Rieder, E., Kasimir, M.-T., Silberhumer, G., Seebacher, G., Wolner, E., Simon, P., et al. (Fevereiro de 2004). Decellularization protocols of porcine heart valves differ importantly in efficiency of cell removal and susceptibility of the matrix to recellularization with human vascular cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery , 127 (2), pp. 399-405.
Schenke-Layland, K., Vasilevski, O., Opitz, F., König, K., Riemann, I., Halbhuber, K., et al. (2003). Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves. Journal of Structural Biology , 143, pp. 201-208.
Schmidt, C. E., & Baier, J. M. (2000). Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering. Biomaterials , 21, pp. 2215-2231.
Simon, P., Kasimir, M., Seebacher, G., Weigel, G., Ullrich, R., Salzer-Muhar, U., et al. (2003). Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT in pediatric patients. European Journal of Cardio-thoracic Surgery , 23, pp. 1002-1006.
Uchimura, E., Sawa, Y., Taketani, S., Yamanaka, Y., Hara, M., & Miyake, H. M. (2003). Novel method of preparing acellular cardiovascular grafts by decellularization with poly(ethylene glycol). J Biomed
STUDY OF TISSUE DECELLULARIZATION IN THE PRODUCTION
OF BIOLOGICAL SCAFFOLDS FOR GRAFTING
Haroldo A. Osório Jr.1, José S. P. Silva1, Carlos A. G. Barboza2, Hugo A. O. Rocha3
1Departament of Dentistry, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal (RN), Brazil2Departament of Morphology, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal (RN), Brazil
3Departament of Biochemistry, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal (RN), Brazil E-mail: [email protected]
Abstract: The regeneration of bone defects with loss of substance remains as a therapeutic challenge in the medical field. There are basically four types of grafts: autologous, allogenic, xenogenic and isogenic. Of these, only autogenous and isogenic grafts are freed from antigenic character, since allogeneic and xenogenic grafts are potential promoters of the immune response. It is a consensus that autologous bone is the most suitable material for this purpose, but there are limitations to its use, especially the insufficient amount in the donor. Surveys show that the components of the extracellular matrix (ECM) are generally conserved between different species and are well tolerated even in xenogenic recipient. Thus, many studies have been conducted in the search for a scaffold that can replace autogenous bone. To obtain these scaffolds, the tissue must undergo a process of cell removal (decellularization), minimizing any adverse effects on the composition, biological activity and mechanical integrity in the extracellular matrix remaining. There is not, however, a conformity among researchers about the best protocol for decellularization. The efficiency of cell removal of a tissue depends on its origin and the physical, chemical or specific enzyme based methods used. Each of these treatments affects the biochemical composition, the ultrastructure of the scaffold and mechanical behavior of extracellular matrix (ECM) remaining, which in turn affects the immune response to the material. The methods vary greatly even between different types of tissues subjected to the same. Further down the arsenal of research involving decellularization bone tissue represents another obstacle to the arrival of a consensus protocol. This design aims at assessing the influence of three of the most common methods of decellularization (SDS, Triton X-100 or trypsin based) to produce organic scaffold from organs of mice bone, identifying the protocol most effective in removing cells, and better preserves the structure of bone ECM.