· Web viewประเทศไทยพบการรายงานของโรคน คร งแรกต งแต ป พ.ศ. 2515 ในช วงน นโรคน

ความสามารถในการกอโรคของเชอ Xanthomonas citri subsp. citri

สาเหตโรคแคงเกอรพชตระกลสมและการควบคมโรคดวยเชอแบคทเรยปฏปกษ

Pathogenecity of Xanthomonas citri subsp. citri Causal Agent of Citrus Canker and

Disease control by Antagonistic Bacteria

อมรรตน กสลางกรวฒน1 ปฐวภา สงกมาร 1 ศรเมฆ ชาวโพงพาง 2 และอำาไพวรรณ ภราดรนวฒน1

Amornrat Kusalangkoonwat1 Pattavipha Songkumarn1 Srimek Chowpongpang2

and Ampaiwan Paradornuwat11 ภาควชาโรคพช คณะเฏษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรงเทพ 10900

2 สำานกงานพฒนาวทยาศาสตรและเทคโนโลยแหงชาต (สวทช) กระทรวงวทยาศาสตร เทคโนโลยและนวตกรรม

1Department of Plant Pathology, Faculty of Agriculture, Kasetsart University, Bangkok, 10900

2 National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Ministry of Science, Technology and Innovation

ABSTRACTSamples of lime, kiffer lime, mandarin and

pummelo showing canker symptoms are collected from economic plantation areas. Totally 113 isolates of disease pathogens are cultured. Morphology, biochemical tests as well as diagnosis using molecular technique are applied for pathogen identification. The pathogens are identified as bacteria, Xanthomonas citri subsp. citri. (Xcc.) All isolates are gram-negative and rod shape bacteria. On NA NGA and YDC agar, colonies with a yellow circular convex and yellow pigment of Xanthomonadin are reported. Those bacteria are aerobic bacteria. They produce catalase enzyme but not urease enzyme with ability to digest starch and gelatin. They produce acids from glucose, lactose and

sucrose. Polymerase Chain Reaction (PCR) using universal primers for 16S rDNA gene is investigated. Nucleotides of 512 bp. are reported. The hypersensitivity tests are carried on tobacco (Nicotiana tabacum). All of the bacteria isolates responses with quickly acute reaction, within 48 hr. Pathogenicity tests are also performed on ‘Pan Ram Phai’ ‘Pan Phichit’, Kiffer lime and Pummelo. Disease symptoms are developed by 110 isolates only on ‘Pan Ram Phai’, but not on ‘Pan Phichit’, kiffer lime and pumelo. At the same time, 3 isolates from kiffer lime are caused disease symptoms on ‘Pan Ram Phai’, ‘Pan Phichit’, Kiffer lime, and Pummelo. Research works on biological control using antagonistic bacteria are studied. Baciilus subtilis (BS), PSD-2 isolate is responded on growth inhibition of all isolates of Xcc. with the highest percentage of 85.29 %.Keywords : Canker, citrus, Xanthomonas citri subsp. citri., antagonistic bacteria

บทคดยอ

แยกเลยงเชอบรสทธจากมะนาว มะกรด สมสายนำาผง และสมโอ ทเปนโรคแคงเกอรจากแหลงปลก สำาคญของประเทศไทย ไดเชอแบคทเรยจำานวน 113 ไอโซเลท เมอศกษาคณสมบตทางสณฐานวทยา คณสมบตทางชวเคม และการตรวจสอบเชอโดยเทคนคชวโมเลกล พบวาเปนแบคทเรย Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc.) เปนแกรมลบ รปรางเปนทอน บนอาหารเลยงเชอ NA NGA และ YDC เชอ Xcc. ทกไอโซเลทสรางโคโลนมสเหลองออนถงเขม สราง pigment สเหลอง (Xanthomonadin) รปรางกลมนน ขอบเรยบ เชอทกไอโซเลทตองการใชออกซเจน สามารถสรางเอนไซม catalase แตไมสรางเอนไซม urease ยอยแปงและเจลาตน สรางกรดจากนำาตาล glucose lactose และ sucrose ได การตรวจสอบเชอดวยเทคนค Polymerase Chain Reaction โดยใชคไพรเมอรสำาหรบยน 16S rDNA พบแถบดเอนเอ

ขนาด 512 bp. ในการทดสอบปฏกรยาตอบสนองอยางเฉยบพลน (hypersensitivity test) บนยาสบใบใหญ (Nicotiana tabacum) พบวาทกไอโซเลทเกดปฏกรยาตอบสนองภายใน 48 ชม. เมอทดสอบความสามารถในการกอใหเกดโรคบนมะนาวพนธแปนร ำาไพ พนธแปนพจตร มะกรด และสมโอพนธขาวแตงกวา พบวาเชอ จำานวน 110 ไอโซเลทสามารถกอโรคกบมะนาวพนธแปนรำาไพ แตไมกอใหเกดอาการของโรคบนมะนาวพนธแปนพจตร มะกรด และสมโอ ในขณะเดยวกน เชอ Xcc. จำานวน 3 ไอโซเลททแยกไดจากมะกรด สามารถกอใหเกดโรคกบมะนาวทงสองสายพนธ มะกรด และสมโอได จากการศกษาการควบคมโรคดวยชววธ พบวาเชอแบคทเรยปฏปกษ (antagonistic bacteria) Baciilus subtilis (BS) สายพนธ PSD-2 สามารถควบคมการเจรญเตบโตของเชอ Xcc. ทกไอโซเลท โดยมประสทธภาพการยบยงสงสดถง 85.29 %

คำาสำาคญ : โรคแคงเกอร พชตระกลสม Xanthomonas citri subsp. citri เชอแบคทเรยปฏปกษ

คำานำา

พชตระกลสม (Citrus spp.) สามารถแบงออกไดหลายชนด ไดแก สมเขยวหวาน (Tangerine) (Citrus reticulata Blanco) สมตรา (Sweet orange) (C. sinensis (L.) Oskeck) มะนาว (Lime) (C. aurantifolia Swingle) สมโอ (Pummelo) (C. maxima Burm) และ มะกรด (kaffir lime) (C. hystrix) (ไชยา, 2531) นอกจากนยงมพชทจดอยในพชวงศสมและพบเหนกนไดทวไป นนคอ ตนแกว (Murraya paniculata) หรอ แมแต มะขวด (Feronia limonia) เปนตน

  สมมถนกำาเนดอยในเขตตดตอระหวางพนทของประเทศจนตอนใต อนเดย คาบสมทรมะลาย ซงรวมถงประเทศไทยทงหมดดวย จากเอกสารรายงานของ มองซเออร เดอลาลแบร (Monsieur  De  La Loubere) ทเขยนไวในหนงสอ A New

Historical Relation with the King of Siam ทไดเขามาในประเทศไทยในระหวางวนท 27 กนยายน พ.ศ. 2230 (ค.ศ. 1687) ถงวนท 3 มกราคม พ.ศ. 2231 (ค.ศ. 1688) หรอมากกวา 300 ปทผานมา ในเอกสารนไดกลาวถงพชหลายชนดรวมทง สมโอ  (Soum-O หรอ Pompelmousees) สมแกว (Soum –Keou) และมะกรด  (Ma-Crout)  สวนกลมสมเปลอกลอน คาดวาไดมการนำาเขามาในประเทศไทยกวา  100  ปทผานมา พรอมกบชาวจนทอพยพ และไดมการปลกและขยายพนธจนไดเปน   สมเขยวหวาน“ ”  ในทสด

โรคแคงเกอรเกดจากเชอแบคทเรย Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc.) สามารถกอใหเกดลกษณะอาการไดกบทกสวนของตนพชและมกพบระบาดรนแรงในฤดฝน (อำาไพวรรณ, 2527) เปนโรคทสำาคญทางกกกนพชของหลายประเทศ อาทเชน สหภาพยโรป อเมรกา ออสเตรเลย และญปน โดยเฉพาะสหภาพยโรป โดยเชอนถอเปนเชอโรคพชกกกนทรายแรงของการนำาเขาพชตระกลสม (Citrus spp.) ในตางประเทศจงมกฎหมายและระเบยบควบคมการนำาเขาอยางเขมงวด (EPPO/CABI, 2005)

ประเทศไทยพบการรายงานของโรคนครงแรกตงแตป พ.ศ. 2515 ในชวงนนโรคนไดสรางความเสยหายใหกบสมเขยวหวานเปนจำานวนมาก (วเชยร, 2519) จนถงปจจบนยงพบวามการระบาดของโรคอยางกวางขวาง โดยเฉพาะในแหลงปลกมะนาวทมกพบการระบาดรนแรงของโรคน ถอไดวาเปนโรคทสำาคญและยากแกการปองกนกำาจด เนองจากแบคทเรยสาเหตโรคนจะอาศยอยตามทอนำาและทออาหารของพช และสามารถแพรกระจายเชอไปไดทวทกสวนของตน สำาหรบการควบคม ตงแตอดตจนถงปจจบนมการนำาสารเคมทมสวนประกอบของทองแดง ในกลมของคอปเปอร (Copper) มาใชในการฉดควบคม ไดแก คอปเปอรออกซคลอไรด (copper oxychloride) คอปเปอรออกไซด (copper oxide) และ บอรโดมกซเจอร (Bordeaux mixture) โดยในชวงแรกของการนำาสารกลมนมาใชสามารถควบคมการเขาทำาลายของเชอได แตเมอมการนำา

สารกลมนมาใชในปรมาณมากเกนความจำาเปนหรอเกนปรมาณทกำาหนดพบวาเกดการดอยา

ในปจจบนการควบคมโรคแคงเกอรนทำาไดยาก สบเนองจากการดอยาของพช การวจยนจงมวตถประสงคเพอศกษาความสามารถในการกอโรคของเชอแบคทเรย Xanthomonas citri subsp. citri บนพชตระกลสม (Citrus spp.) และเพอทดสอบประสทธภาพในการควบคมโรคโดยใชเชอจลนทรยปฏปกษในระดบหองปฏบตการ เพอใชเปนขอมลทางเลอกและนำาไปใชประโยชนตอไป

อปกรณและวธการ

รวบรวมสายพนธของเชอแบคทเรยสาเหตโรคแคงเกอรเกบตวอยางพชตระกลสมทแสดงอาการของโรคแคงเกอรจากแหลง

ปลกตามภาคตางๆ ของประเทศไทย สมเกบตวอยางจากทกสวนทพบอาการของโรค ไดแก ใบ ลำาตน และ ผล เปนตน โดยเลอกเกบสวนทแสดงอาการแผลสะเกด นน ฟ ฉำานำา รอบแผลมสเหลอง (halo) ลอมรอบ แผลมสแดงเขม ถงนำาตาล นำาตวอยางพชทแสดงอาการโรคเกบแยกใสถงพลาสตกทมความชน บนทกขอมลในรายละเอยดเกยวกบสถานท ลกษณะอาการ วนท สายพนธพช อายพช และถายภาพประกอบ

แยกใหไดเชอบรสทธ ดวยวธ tissue transplanting ตดชนพชใหมขนาดประมาณ 0.5 x 0.5 มลลเมตร แชดวยสารละลาย โซเดยมไฮเปอรคลอไรท (sodium hyperchlorite) 10% นาน 2-3 นาท ลางตามดวยนำากลนนงฆาเชอ 2 ครง และใชคมคบ (forcept) วางชนพชบนอาหาร NA โดยกอนวางควรทำาการซบชนพชลงบนกระดาษกรองทปลอดเชอทเตรยมไวในจานอาหารเลยงเชอ (plate) บมเชอทอณหภมหอง (28-30 องศาเซลเซยส) ตรวจวดการเจรญของเชอท 24 - 48 ชวโมง และคดเลอกโคโลนทมลกษณะกลม มนวาว มสเหลอง นำามา Cross Streak ซำาลงบนอาหารเลยงเชอ Nutrient Agar (NA) 2-3 ครง จนไดเชอบรสทธ เกบเชอลงในอาหาร NA slant ทอณหภม 4-7 องศาเซลเซยส

หรอเกบใน glycerol 15 - 20% ใสใน micro centrifuge tube เกบรกษาทอณหภม -20 องศาเซลเซยส เพอใชเปน stock culture ไวใชในการศกษาตอไปการแยกและคดเลอกแบคทเรยปฏปกษ

เกบดนบรเวณรอบรากพชตระกลสม เลอกตนทสมบรณ ไมแสดงอาการของโรค มาทำาการแยกเชอแบคทเรยดวยวธ soil dilution plate โดยนำาตวอยางดนจำานวน 10 กรม ผสมลงในนำากลนนงฆาเชอ 90 มลลลตร แชและเขยาดวยเครอง Incubator shaker ทงไวบนเครองเขยา 120 รอบตอนาท นาน 15-30 นาท เพอใหเชอแบคทเรยเคลอนออกมาผสมกบนำา เขยาดวยเครอง vortex mixer และปลอยใหดนตกตะกอนและเกบเฉพาะสวนของนำามาทำาการเจอจางดวยนำากลนนงฆาเชอดวยวธ 10-fold dilution ความเขมขนจนถงระดบท 10-8 จากนนใช micropipette ดดเซลล suspension ของตวอยางดนทความเขมขน 10-4 10-6 และ 10-8 ปรมาตร 100 ไมโครลตร เกลยโดยใชแทงแกวใหทวผวหนาอาหาร nutrient agar (NA) ทำา 3 ซำา บมเชอไวทอณหภมหอง นาน 24-48 ชวโมง จนแบคทเรยเจรญบนอาหาร ทำาการแยกเชอใหบรสทธโดยการเลอกโคโลนเดยวๆของเชอนนมา cross streak บนอาหาร nutrient agar (NA) ประมาณ 2-3 ครง เกบเชอระยะสนในอาหารเอยง และเกบระยะยาวดวย glycerol 20% ทแชไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส เพอใชศกษาและทำาการทดสอบประสทธภาพตอไปการจำาแนกเชอโดยการศกษาคณสมบตทางสณฐานวทยา และชวเคมบางประการ

นำาเชอทแยกไดบรสทธแลว มาทดสอบลกษณะทางสณฐานวทยาดวยการยอมแกรม ศกษาลกษณะโคโลนของเชอแบคทเรยสาเหตโรคทแยกไดบนอาหารเลยงเชอชนดตางๆ คอ Nutrient agar (NA), Nutrient glucose agar (NGA) และ yeast extract dextrose-calcium carbonate agar (YDC) (Schaad, 2006) และศกษาลกษณะทางชวเคมดวยการทดสอบตางๆตาม Bergey’ s manual of

Determinative Bacteriology (1974) ไดแก การทดสอบการเคลอนท (Motility test) ทดสอบการสรางเอนไซมออกซเดส (Oxidase test), การทดสอบการยอยแปง (Starch hydrolysis) ทดสอบการยอยเจลาตน (Gelatin hydrolysis) และทดสอบการใชนำาตาลชนดตางๆ เปนตนการทดสอบความสามารถในการกอโรคของเชอ Xanthomonas citri subsp. citri บนพชตระกลสม

การเตรยมเซลลแขวนลอยนำาเชอแบคทเรยทเลยงในอาหารเหลว nutrient broth (NB)

ปรมาตร 5 มลลลตร บมเชอทอณหภมหอง นาน 24 ชวโมง บนเครองเขยาในอตราเรว 120 รอบตอนาท เตรยมเซลลแขวนลอยของเชอ (cell suspension) ปรบดวยนำากลนนงฆาเชอปรบความเขมขนใหมคา optical-density (O.D.) เทากบ 0.2 ทความยาวคลน 600 นาโนเมตร ดวยเครอง spectrophotometer จะไดเชอ 108 เซลลตอมลลลตร

การทดสอบปฏกรยาการตอบสนองอยางเฉยบพลน (Hypersensitive response: HR)

พชทดสอบ ไดแก ยาสบใบใหญ (Nicotiana tabacum L.) ดดเซลลแขวนลอยของเชอสาเหตโรคทเตรยมไวปรมาตร 1 มลลลตร ฉดเขาสเนอใบของพชทดสอบโดยไมใหเกดฟองอากาศ จนเกดอาการใบชำาฉำานำาตรงบรเวณทฉดเชอ ตรวจสอบปฏกรยาการตอบสนองอยางเฉยบพลนภายในระยะเวลา 24-48 ชวโมง (Klement et al., 1990)

ความสามารถในการกอใหเกดโรคบนพชอาศยทดสอบกบพช 4 ชนด คอ มะนาวพนธแปนรำาไพ มะนาวพนธแปน

พจตร มะกรด และสมโอ ทดสอบความสามารถในการกอใหเกดโรคตามหลก Koch’s postulation โดยตดใบพชใตนำาแลวนำาสำาลพนรอบกานใบเปนวธตดชำาใบ (detached leaf technique) (Duan et al.,1999) จากนนนำามาใสในกลองพลาสตกทมกระดาษรองใหความชน

ทำาการปลกเชอลงบนใบ โดยนำาเขมทอบฆาเชอแลวไปจมลงในเซลลแขวนลอยของเชอทเตรยมไว เจาะทำาแผลบนใบพชทดสอบ (a pin prick inoculation method) เกบกลองไวภายใตอณหภมหอง ตรวจสอบผลการเกดโรคหลงจากปลกเชอแบคทเรยทกๆ 3 วน การจำาแนกชนดของเชอแบคทเรย Xanthomonas citri subsp. citri ดวยเทคนค PCR

สกดดเอนเอจากเชอ โดยเลยงเชอ Xanthomonas citri subsp. citri ในอาหารเหลว NB ปรมาตร 9 มลลลตร เขยาดวยเครอง Incubator shaker ทความเรว 125 รอบตอนาท ทอณหภม 28 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง ดดสารแขวนลอยแบคทเรย 1 มลลลตร ใสใน microcentifuge tube ป นเหวยงทความเรวรอบ 13,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท เทนำาทงเกบตะกอน เตม homogenization buffer (0.1 M Nacl, 0.2 M sucrose, 0.01 M EDTA, 30 mM Tris-HCl, pH 8.0) ปรมาตร 200 ไมโครลตร พลกกลบหลอด 10 ครง เตม Plasmid buffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 1% SDS, pH 8.0) ปรมาตร 200 มลลลตรและเตม 5M Potassium Acetate Solution (5 M potassium acetate, 3 M acetic acid) ปรมาตร 200 ไมโครลตร และ chloroform 100 ไมโครลตร พลกกลบหลอด 10 ครง ปนเหวยงทความเรวรอบ 13,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท นำาสวนใสทไดมาดดใสในหลอด microcentifuge tube ปรมาตร 600 ไมโครลตร เตม Isopropanal 600 ไมโครลตร ป นเหวยง ทความเรวรอบ 13,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท เทสวนใสทง แลวเกบตะกอน ลางดวย 70% ethanol ปรมาตร 100 ไมโครลตรและละลายตะกอน DNA ดวย distilled water + RNase ความเขมขน 1 มลลกรมตอมลลลตรปรมาตร 50 ไมโครลตร

เพมปรมาณ DNA ดวยเทคนค PCR นำาเชอแบคทเรยทมแนวโนมวาจะเปนเชอสาเหตโรคแคงเกอรทสกดดเอนเอแลวมาตรวจสอบโดยใชคไพรเมอร XACF (5’-CGTCGCAATACGATTGGAAC-3’) และ XACR (5’- CGGAGGCATTGTCGAAGGAA-3’) (Park et al.

2006) ในปรมาตร 25 ไมโครลตร ประกอบดวย มดงน DNA เปาหมาย 1 ไมโครลตร, 10X PCR buffer 2.5 ไมโครลตร 2.5dNTP 1 ไมโครลตร, เอนไซม Taq DNA polymerase 0.5 ไมโครลตร และไพรเมอรอยางละ 1 ไมโครลตร ปรบปรมาตรดวยนำากลนนงฆาเชอใหได 25 ไมโครลตร ทำาการเพมชนสวนของดเอนเอดวยเครอง (Thermal cycle) ทำาปฏกรยาดวยรอบการทำาปฏกรยา ดงน ขนท 1 อณหภม 94 องศาเซลลเซยส นาน 2 นาท ขนท 2 อณหภม 94 องศาเซลลเซยส นาน 30 วนาท ขนตอนท 3 อณหภม 55 องศาเซลลเซยส นาน 30 วนาท ขนท 4 อณหภม 72 องศาเซลลเซยส นาน 1 นาท และขนตอนสดทาย อณหภม 72 องศาเซลลเซยส นาน 5 นาท จำานวน 35 รอบ (ขนท 1-4) ตรวจสอบแถบดเอนเอดวยเครอง Gel electrophoresis โดยใช 1% agarose gel ดวย TE buffer ภายใตกระแสไฟฟา 100 โวลต เปนเวลา 15 นาท การทดสอบประสทธภาพของเชอแบคทเรยปฏปกษในการยบยงการเจรญของเชอแบคทเรย Xanthomonas citri subsp. citri

นำาเชอแบคทเรยทแยกไดมาทำาการคดเลอกสายพนธของเชอแบคทเรยปฏปกษทมคณสมบตในการควบคมเชอแบคทเรย Xanthomonas citri subsp. citri สาเหตโรคแคงเกอร โดยวธ Agar diffusion และนำามาเปรยบเทยบกบการใชเชอ Bacillus spp. สองไอโซเลท ไดแก PSD-2 และ B23 (นฤมล, 2560)

เลยงเชอในอาหารเหลว NB ปรมาตร 9 มลลลตร เลยงแยกหลอดระหวางเชอสาเหตโรคแคงเกอรและเชอแบคทเรยปฏปกษ บนเครอง Incubator shaker เขยาทมความเรว 125 รอบตอนาท เปนเวลา 24 ปรบคาความขนของ cell suspension ของเชอดวยเครอง Spectrophotometer ดวยนำากลนทผานการนงฆาเชอ ใหเซลลแขวนลอยของเชอทงสองมคา O.D. เทากบ 0.2 จะมเชอโดยประมาณ 108cfu/มลลลตร ทความยาวคลน 600 นาโนเมตร

ทดสอบโดยการหลอมอาหาร NA ทงไวใหอณหภมประมาณ 45 องศาเซลเซยส และใช micropipette ดดเซลลแขวนลอยของเชอ

แบคทเรยสาเหตโรคแคงเกอรปรมาตร 200 มลลลตร ผสมใหเขากบอาหารและเทอาหารในจานอาหารเลยงเชอ พกทงไวใหหนาอาหารแหง จากนนใช cork borer ขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5 เซนตเมตร เจาะลงไปทหนาอาหาร เจาะ 4 หลมตอ 1 จานอาหาร และใช micropipette ดดเซลลแขวนลอยของเชอแบคทเรยปฏปกษปรมาตร 30 ไมโครลตร หยดลงในแตละหลม บมเชอทอณหภมหอง ตรวจเชคผลการเกดบรเวณยบยง (inhibition zone) บนผวหนาอาหารทดสอบและเปรยบเทยบเสนผานศนยกลางของบรเวณยบยงทเวลา 24-48 ชวโมง

ผลการทดลองและวจารณ

รวบรวมสายพนธของเชอแบคทเรยสาเหตโรคแคงเกอรจากการสำารวจและเกบตวอยางจากสวนของใบ กง และผล ของ

มะนาว มะกรด สมสายนำาผง และ สมโอ ทแสดงอาการของโรคแคงเกอรจากแหลงปลกตามภาคตางๆในประเทศไทย จำานวนทงหมด 26 จงหวด รวมจำานวนตวอยางทเกบได เทากบ 113 ไอโซเลท สามารถรวบรวมเชอไดจากมะนาว 92 ไอโซเลท สมสายนำาผง 4 ไอโซเลท จากมะกรด 3 ไอโซเลท และจากสมโอ 4 ไอโซเลท ลกษณะอาการทพบ เปนแผลสะเกดเลก-ใหญ ทงดานหนาและหลงใบ แผลแตกนนฟ รอบแผลมสเหลอง (halo) ลอมรอบ ดานหลงเปนจดฉำานำา แผลมสแดงเขม ถงนำาตาล พบทงในสวนของใบ กง และผล โดยพชทสำารวจพบโรคมากทสดคอ มะนาว ซงแหลงทพบโรคนไดมากทสดสวนใหญอยในแปลงปลกมะนาวของภาคกลาง เนองจากในพนทนนยมปลกมะนาวเปนจำานวนมาก (ภาพท 1)

ภาพท 1 ลกษณะอาการโรคแคงเกอรของพชตระกลสมทแสดงอาการ บน ใบ กง และ ผล

(ก) ใบสมสายนำาผง (ข) ผลสมสายนำาผง (ค) ใบมะกรด (ง) ขวและผลมะนาว

ก

ฉ

จ

ค ง

ข

ช

(จ) ใบมะนาว (ฉ) ใบสมโอ (ช) เปลอกและผลสมโอ

จากการสำารวจและแยกเชอแบคทเรยปฏปกษจากดน สามารถเกบไดจาก 3 จงหวด ไดแก ราชบร สพรรณบร และ สมทรสงคราม รวมทงหมด 17 ไอโซเลท โดยแบงลกษณะของเชอแบคทเรยปฏปกษไดเปน 3 กลม กลมท 1 เชอแบคทเรยปฏปกษมลกษณะรปรางไมแนนอน ขอบหยก สขาวผวดาน กลมท2 เชอแบคทเรยปฏปกษมลกษณะโคโลนมน นน ขอบเรยบ สขาวขน และกลมท 3 เชอแบคทเรยปฏปกษมลกษณะผวดาน ตรงกลางยบตว ขอบเรยบ สขาวขน (ภาพท 2)

ภาพท 2 ลกษณะของโคโลนของเช อแบคทเรยปฏป กษ บนอาหาร Nutrient agar (NA) เปนเวลา 48 ชวโมง

(ก) สขาวดาน รปรางไมแนนอน ขอบหยก (ข) สขาวขน โคโลนมน นน ขอบเรยบ และ (ค) สขาวขน ผวดาน ตรงกลางยบตว ขอบเรยบ

การจำาแนกเชอโดยการศกษาคณสมบตทางสณฐานวทยา และชวเคมบางประการ

เมอทดสอบคณสมบตทางสณฐานวทยา สรรวทยาและคณสมบตทางชวเคม ทง 113 ไอโซเลท พบวาเปนแบคทเรยทสรางโคโลนกลมนน ขอบเรยบ สเหลองออนถงเขม สราง pigment สเหลอง (Xanthomonadin) มโคโลนสเหลองกลมนนสะทอนแสง บนอาหาร NA และ YDC สรางสาร extracellular polysaccharide ทเปน

ก ข ค

เมอกสเหลองบนอาหาร NGA เปนแบคทเรยแกรมลบ รปรางเปนทอน ตองการใชออกซเจน สามารถสรางเอนไซม catalase แตไมสรางเอนไซม urease ยอยแปงและเจลาตนได สรางกรดจากนำาตาลชนดตางๆ คอ glucose, lactose และ sucrose เปนตน ซงสอดคลองกบณสมบตทางชวเคมตาม Bergey’ s manual of Determinative Bacteriology (1974) และ สอดคลองกบเชอในกลมทมรายงานในกลมของ Xanthomonas spp. จากการทดสอบปฏกรยาตอบสนองอยางเฉยบพลน (hypersensitivity test) บนยาสบใบใหญ (Nicotiana tabacum) พบวาเชอทกไอโซเลทเกดปฏกรยาตอบสนองอยางรวดเรวภายใน 48 ชวโมงความสามารถในการกอโรคของเชอบนพชตระกลสม

จากการทดสอบการกอใหเกดโรคบนพชอาศยตามหลก Koch’s postulation เชอทกไอโซเลท สามารถกอใหเกดอาการของโรคเชนเดยวกบอาการทพบเรมตน เมอทดสอบกบพชทดสอบ ไดแก มะนาวพนธแปนรำาไพ มะนาวพนธแปนพจตร มะกรด และสมโอ พบวามเชอ Xanthomonas citri subsp. citri เพยง 3 ไอโซเลททแยกไดจากมะกรด คอ NP10 (นครปฐม) CHC04 (ฉะเชงเทรา) และ BR02 (บรรมย) ทสามารถเขาทำาลายพชทดสอบทง 4 ชนดได โดยอาการของโรค บนใบมะนาวแปนรำาไพ มะนาวแปนพจตร มะกรด และ สมโอ แสดงอาการทเหมอนกน คอเรมจากเกดจดเลกๆฉำานำาดานหลงใบและคอยๆ พฒนาเกดเปนแผลสะเกดนนฟสขาวขนดานหนาใบ พฒนาไปจนเปนสนำาตาล และมสเหลอง (halo) ลอมรอบแผล อาการของโรคเรมแสดงใหเหนในวนท 3 หลงจากการปลกเชอ (ภาพท 3)

ภาพท 3 การทดสอบความสามารถในการเกดโรคกบพชอาศย ทปลกดวยเชอ Xanthomonas citri subsp.

citri สายพนธ CHC04 ทแยกไดจากมะกรด บน (ก) มะนาวแปนรำาไพ (ข) มะนาวแปนพจตร (ค) สมโอขาวแตงกวา และ (ง) มะกรด

การจำาแนกชนดของเชอแบคทเรย Xanthomonas citri subsp. citri โดยการใชเทคนคทางดานชวโมเลกล Polymerase chain reaction (PCR)

ผลจากการเพมปรมาณดเอนเอของเชอ โดยใชเทคนค Polymerase chain reaction (PCR) เพอตรวจสอบเชอสาเหตโรคแคงเกอร โดยใชคไพรเมอร XACF (5’- CGTCGCAATACGATTGGAAC-3’ และ XACR (5’- CGGAGGCATTGTCGAAGGAA-3’) ทจำาเพาะบรเวณ ยน 16S rDNA ของเชอ Xanthomonas citri subsp. citri จากการตรวจสอบดวย 1.5% agarose gel ปรากฏแถบดเอนเอ ขนาด 561 bp. (ภาพท 4)การทดสอบประสทธภาพของเชอแบคทเรยปฏปกษในการยบยงการเจรญของเชอแบคทเรย Xanthomonas citri subsp. citri

การทดสอบประสทธภาพของเชอแบคทเรยปฏปกษ ในการควบคมเชอแบคทเรยสาเหตโรคแคงเกอร

คก งข

ทแยกไดจากพชตระกลสม ไดแก มะนาว สมโอ สมสายนำาผง และมะกรด ดวยวธ Agar diffusion (ภาพท 5)พบวา โดยเชอแบคทเรยปฏปกษ Bacillus spp. ไอโซเลท PSD-2 สามารถควบคมเชอ Xcc. ไดสงสดท 85.29 เปอรเซนต รองลงมาเปน แบคทเรยปฏปกษ Bacillus spp. ไอโซเลท R01 ควบคมได 66.66 เปอรเซนต และ Bacillus spp. ไอโซเลท B23 สามารถควบคมไดท 64.28 เปอรเซนต ตามลำาดบ

จากการทดสอบประสทธภาพของเชอแบคทเรยสาเหตโรคแคงเกอรทง 4 ไอโซเลททแยกจากพชตระกลสมตางสายพนธพบวา ไอโซเลททแยกจากมะนาว เชอแบคทเรยปฏปกษทกไอโซเลทสามารถยบยงการเจรญเตบโตของเชอและเกด Inhibition zone ทกวาง ในขณะทเชอไอโซเลททแยกไดจากมะกรด มเปอรเซนตการยบยงทตำาทสด เกด Inhibition zone แคบทสด ใหระดบการยบยงอยท 37.50 เปอรเซนต (ตารางท 2)

M P+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P+ N-

ภาพท 4 แถบดเอนเอของเชอแบคทเรย Xanthomonas citri subsp. citri ขนาด 512 bp. ทเพมปรมาณ

ดวยเทคนค PCR ดวยคไพรเมอร XACF/XACR (M) ดเอนเอมาตรฐานขนาด 1 kb. (P+) Positive control (1) CN01, (2) SK02, (3) P01, (4) RB02-2, (5) NP10, (6) KB01-1, (7) RB13, (8) RB08-2, (9) NB02, (P+)= Positive และ (N-) Negative Control

ตารางท 1 เสนผานศนยกลางการยบยงการเจรญเตบโต (Inhibition zone) ของเชอแบคทเรย Xcc.

512 bp.

100 500

4 ไอโซเลท (P01, CN01, CM01-2 และ CHC04) ดวยเชอแบคทเรยปฏปกษ จำานวน 3 ไอโซเลท ไอโซเลทของ

เชอแบคทเรยปฏปกษ

เสนผานศนยกลางการยบยงการเจรญเตบโต (มม.)1/

P01 CN01 CM01-2 CHC04

PSD-2B23R01

Positive control

Negative control

3.41.31.51.20.5

2.81.41.00.90.5

1.91.11.40.80.5

2.10.90.80.40.5

1/บรเวณยบยง (มลลเมตร): เสนผานศนยกลางความกวางบรเวณทยบยงไดทงหมด เสนผานศนยกลาง–

ททำาการเจาะของ cork borer /2

ตารางท 2 เปอรเซนตการยบยงการเจรญเตบโตของเชอของเชอแบคทเรย Xcc. 4 ไอโซเลท (P01, CN01,

CM01-2 และ CHC04) ดวยเชอแบคทเรยปฏปกษจำานวน 3 ไอโซเลท ไอโซเลทของ

เชอแบคทเรยปฏปกษ

เปอรเซนตการยบยง (%)1/

P01 CN01 CM01-2 CHC04

PSD-2B23R01

Positive control

Negative control

85.2958.3366.6658.33

0

82.1464.2850.0044.44

0

44.4454.5464.2837.50

0

76.1944.4437.5025.00

0

1/เปอรเซนตการยบยง (%) = {ชดทดสอบ (R1) – ชดควบคม (R2)}/ ชดทดสอบ (R1) x 100

P01 CN01 CM01-2 CHC04

ภาพท 5 การยบยงการเจรญเตบโตของเชอ Xanthomonas citri subsp. citri 4 ไอโซเลท (P01,

CN01, CM01-2 และ CHC04) ดวยเชอแบคทเรยปฏปกษ (ก) Bacillus spp. ไอโซเลท PSD-2

COP

R0

B2

PS ก

ค

ข

ง

จH2o

(ข) Bacillus spp. ไอโซเลท B23 (ค) Bacillus spp. ไอโซเลท R01 (ง) ชดควบคมเชงบวก (สารเคมคอปเปอรไฮดรอกไซด 500 ppm.) (จ) ชดควบคมเชงลบ (นำากลนนงฆาเชอ)

สรปผลการทดลอง

จากการแยกเลยงเชอแบคทเรย Xanthomonas citri subsp. citri สามารถรวบรวมตวอยางไดทงหมด 113 ไอโซเลท แยกไดจากมะนาว 92 ไอโซเลท สมสายนำาผง 4 ไอโซเลท มะกรด 3 ไอโซเลท และสมโอ 4 ไอโซเลท จากการศกษาคณสมบตทางสณฐานวทยา ชวเคม และการตรวจสอบเชอโดยเทคนคชวโมเลกล พบวาเปนแบคทเรย Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc.) แกรมลบ รปรางทอน บนอาหารเลยงเชอ NA NGA และ YDC เชอ Xcc. ทกไอโซเลทสรางโคโลนมสเหลองออนถงเขม สราง pigment สเหลอง (Xanthomonadin) รปรางกลมนน ขอบเรยบ เชอทกไอโซเลทตองการใชออกซเจน สามารถสรางเอนไซม catalase แตไมสรางเอนไซม urease ยอยแปงและเจลาตนได สรางกรดจากนำาตาล glucose lactose และ sucrose สอดคลองกบณสมบตทางชวเคมตาม Bergey’ s manual of Determinative Bacteriology (1974) และ สอดคลองกบเชอในกลม Xanthomonas spp. การตรวจสอบเชอดวยเทคนค Polymerase Chain Reaction พบแถบดเอนเอขนาด 512 bp. ในการทดสอบปฏกรยาตอบสนองอยางเฉยบพลน (hypersensitivity test) บนยาสบใบใหญ (Nicotiana tabacum) พบวาทกไอโซเลทเกดปฏกรยาตอบสนองอยางรวดเรวใน 48 ชวโมง จากการทดสอบความสามารถในการกอโรคกบพชอาศยพบวาทง 110 ไอโซเลทสามารถแสดงอาการของโรคเชนเดยวกนอาการทพบ สวนไอโซเลททแยกไดจากมะกรดทง 3 ไอโซเลทนอกจากจะสามารถเกดโรคกบมะกรดเองแลวยงสามารถเขาทำาลายพชชนดอนๆ ในพชตระกลสมอก 3 ชนดได เมอทดสอบการควบคมโดยใชเชอแบคทเรยปฏปกษ 3 สายพนธ เปรยบเทยบกบสารเคม

คอปเปอรออกซคลอไรด ทเปนสารเคมทนยมใชในการควบคมโรคแคงเกอร พบวา เชอ Bacillus spp. ไอโซเลท PSD-2 มประสทธภาพในการยบยงการเจรญเตบโตไดสงสดถง 85.29 เปอรเซนต เมอเทยบกบคอปเปอรออกซคลอไรด ทยบยงการเจรญเตบโตไดสงสดเพยง 58.33 เปอรเซนต ทงนจะเหนไดวา สายพนธของเชอทแยกไดจากมะกรดเมอนำามาทดสอบโดยใชเชอแบคทเรยปฏปกษ เกด Inhibition zone วงแคบ มเปอรเซนตการยบยงนอยทสดเมอเทยบเทยบกบไอโซเลททแยกไดจากพชอน ทงนอนเนองมาจาก ความรนแรงในการกอโรคของเชอทแยกไดจากมะกรด ทมความรนแรงมากกวาและสามารถเขาทำาลายพชตระกลสมทนำามาทดสอบไดทกชนด

คำาขอบคณ

การศกษาวจยน ไดรบทนอดหนนการวจยระดบบณฑตศกษาจาก“สำานกงานคณะกรรมการวจยแหงชาต ประจำาป 2560” ซงไดสนบสนนทนการศกษาวจยบางสวน และมสวนทำาใหการศกษาวจยนสำาเรจไดดวยด ผวจยใครขอขอบคณสำานกงานคณะกรรมการวจยแหงชาต เปนอยางยง

เอกสารอางอง

นฤมล สขวบลย. 2560. เชอรา Sclerotium rolfsii Sacc. สาเหตโรครากเนาโคนเนาทพบในประเทศไทย:

ความสามารถในการกอโรคบนกลวยไมและสายพนธแบคทเรยปฏปกษทมประสทธภาพในการยบยงโรค. วารสารประชมวชาการครงท 54 มหาวทยาลยเกษตรศาสตร.: 131-138

วเชยร กำาจายภย. 2519. โรคแคงเกอรและโรคสแคปของสม. กสกร 49(2) : 121-125.

สำานกงานเศรษฐกจการเกษตร. 2558. ขอมลพนฐานเศรษฐกจการเกษตร ป 2558. สำานกงาน

เศรษฐกจการเกษตร กระทรวงเกษตรและสหกรณ, กรงเทพฯอำาไพวรรณ ภราดรนวฒน. 2527. โรคสมในฤดฝน. วารสารพชสวน 19(2) : 129-135.Buchanan, R.E. and Gibbon, N.E. (1974) Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 9th

Edition, Williams and Wilkins Co., Baltimore.Duan, Y.P., A.L. Castaneda, G. Zhao, and D.W. Gabriel. 1999. Expression of a single,

hostspecific, bacterial pathogenicity gene in plant cells elicits division, enlargement and cell death. Mol. Plant Microbe Interact. 12: 556-560.

EPPO/CABI. 2005. Xanthomonas axonopodis pv. citri In : Quarantine Pests for Europe.

2ndedition. (Ed. By Smith, I. M., McNamara, D.G., Scott, P.R., and M. Holderness. CABI International, Wallingford, UK.

Klement, L., K. Rudolph and D.S. Sands. 1990. Inoculation of plant tissues, in Methods in

Phytobacteriology, Part I. Identification. Diagnosis. Akademiai Kiado, Budapest (Hungary).

Park, D.S., J.W. Hyun, Y.J. Park, Kim. J.S. Kang, H. W., Han, J.H. and Go, S.J. 2006. Sensitive and

specific detection of Xanthomonas axonopodis pv. citri by PCR using pathovar specific primers based on hrpW gene sequences. Microbiol. Res., 161: 145-149.

Schaad, N.W., E. Postnikova, G. Lacy, A. Sechler, I. Agakova, P.E. Stromberg, V.K. Stromberg

and A.K. Vidaver. 2006. Emended classification of Xanthomonas pathogens on citrus. Syst. Appl. Microbiol. 29: 690-695.