VIRUS PAPILOMA HUMANO (HPV): IRUS PAPILOMA HUMANO (HPV): Etiopatogenia Etiopatogenia Diagnóstico molecular y utilidad clínica Diagnóstico molecular y utilidad clínica de la tipificación viral de la tipificación viral Vigilancia Vigilancia Vacunas Vacunas Servicio Virus Oncogénicos Laboratorio Nacional de Referencia de Papilomavirus Laboratorio Regional de Referencia de Papilomavirus- OPS/OMS Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas- ANLIS "Dr. Malbrán" Bioq. Jorge A. Basiletti
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VVIRUS PAPILOMA HUMANO (HPV):IRUS … · CITO – HISTOLOGIA ESTUDIOS VIROLOGICOS ¿CUÁNDO TIENE VALOR CLÍNICO? AYUDA AL DIAGNÓSTICO: discordancia o duda clínico-cito-histo-colposcópica.
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Diagnóstico molecular y utilidad clínica Diagnóstico molecular y utilidad clínica
de la tipificación viralde la tipificación viral
VigilanciaVigilancia
VacunasVacunas
Servicio Virus OncogénicosLaboratorio Nacional de Referencia de Papilomavirus Laboratorio Regional de Referencia de Papilomavirus- OPS/OMS Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas- ANLIS "Dr. Malbrán"
Bioq. Jorge A. Basiletti
Virus papiloma humano (HPV)
•• Familia Familia PapilomaviridaePapilomaviridae
•• Tropismo epitelial: infecta piel y mucosas Tropismo epitelial: infecta piel y mucosas
100 nm
(Adaptado de Burd EM. Clin Microbiol Rev 2003; 16:1–17. )
El punto donde se unen las células escamosas y las células columnares se denomina la ‘unión escamo-columnar’'
Endocervix
Trompas de Falopio
Ovario
Matriz
Útero
Ectocervix Unión escamo-columnar
Cuello uterino
La zona de transformación
Epitelio escamoso
Unión escamo-columnarEpitelio columnar
Unión escamo-columnar: blanco preferido del HPV
CLASIFICACION DE LOS HPVCLASIFICACION DE LOS HPV
Los HPV se clasifican en genotipos en base a diferencias en su secuencia de DNA
Tipo viralTipo viral divergencia en > 10% de divergencia en > 10% de homología en L1homología en L1
(de Villiers y col, Virology, 2004)
HPV: 100 genotipos y vienen más ...HPV: 100 genotipos y vienen más ...
Tracto anogenital: Tracto anogenital: 40 tipos de HPV40 tipos de HPVNo todos los tipos virales No todos los tipos virales
son igualmente oncogénicosson igualmente oncogénicos
POTENCIAL ONCOGÉNICO DE LOS HPVPOTENCIAL ONCOGÉNICO DE LOS HPV
HPVs de Bajo riesgo : 6,11,40,42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 y CP6108
HPVs de Alto riesgo : 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 y 59
(Muñoz et al, Vaccine 2006)
PATOGENIA DE LAS INFECCIONES POR HPV
Piel Piel Verrugas
Epidermodisplasia verruciforme (EV)Cáncer cutáneo no melanoma (CCNM)
Tropismo epitelial
Cáncer cutáneo no melanoma (CCNM)
MucosaMucosa Condilomas anogenitales
Lesiones preneoplásicas
Cáncer anogenital
INTERRELACIÓN ENTRE E6 Y E7 INTERRELACIÓN ENTRE E6 Y E7 EN LA INTERFERENCIA CELULAREN LA INTERFERENCIA CELULAR
HPV E7�Captura pRB ylibera E2F
� Progresión de G1 a S
�
Estabiliza p53�Captura p53 y
la degradaHPV E6�
E6 y E7 de los HPV de alto riesgo pueden inmortalizar
células humanas en forma independiente, pero
muestran complementariedad y sinergismo
la degrada�
Activación de los genes para la replicación del ADN celular
(Münger y Howley, 2002)
ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUDORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD
AGENCIA INTERNACIONAL DE INVESTIGACIÓN SOBRE CANCERAGENCIA INTERNACIONAL DE INVESTIGACIÓN SOBRE CANCER
Los HPV deLos HPV de alto riesgo alto riesgo son carcinogénicos en humanos . son carcinogénicos en humanos .
HPV HPV agente etiológico del cáncer de cuello uterinoagente etiológico del cáncer de cuello uterino
La carcinogénesis por los La carcinogénesis por los HPV de alto riesgoHPV de alto riesgo está sustentada en evidencias está sustentada en evidencias experimentales que indican que proteínas de esos v irus interfieren en el experimentales que indican que proteínas de esos v irus interfieren en el
control de la proliferación celularcontrol de la proliferación celular
Human Papillomaviruses. Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. International Agency for Research on Cancer (IARC-WHO) Vol 64 (1995).
El cáncer de cuello de útero en el mundo
• 500.000mujeres diagnosticadas por año1
• A nivel mundial, cada 2 minutos muere una mujer por cáncer de cuello de útero1
(Bernard y col, 1994; Jacobs y col., 1997;Gravitt y col, 1998; Kleter y col, 1999)
Electrophoresis of amplified products
ADN amplificado por PCR
Estrategias de Estrategias de tipificaióntipificaión de HPV a de HPV a travestraves de de primersprimers consensoconsenso
RFLP
Patrones de restricción
Hibridación por Dot-blot
Dot-blot
Secuenciación
Patrones de restricciónHibridación reversa
Probe Probe Probe Probe Probe Probe
Detección y tipificación de HPV por Detección y tipificación de HPV por PCR tipo específicaPCR tipo específica
Primers tipo-específicos
– Regiones blanco: fragmentos de E6 o E7
– PCR convencional o
Primers tipo-específicos
– Regiones blanco: fragmentos de E6 o E7
– PCR convencional o – PCR convencional o PCR en tiempo real
– PCR convencional o PCR en tiempo real
Requiere una reacción de PCR para cada tipo viralRequiere una reacción de PCR para cada tipo viral
(Gravitt y col., J. Virol Methods 2003)
��������ATENCIÓNATENCIÓN
PARA UN DIAGNÓSTICO MOLECULAR CONFIABLE , SE DEBE TENER EN CUENTA EL CONTROL DE CALIDAD :
Muestras patronesMuestras patrones
Reactivos validados
Protocolos estandarizados
Operadores entrenados
Paneles de control de calidad
APLICACIÓN CLINICA DE LA TIPIFICACIÓN DE HPV:CONCEPTOS ACTUALES
DIAGNÓSTICO DE LESIONES ANOGENITALESDIAGNÓSTICO DE LESIONES ANOGENITALESINDUCIDAS POR HPV.INDUCIDAS POR HPV.
�EVALUACION CLINICA
�COLPO / PENESCOPIA�COLPO / PENESCOPIA
�CITO – HISTOLOGIA
�ESTUDIOS VIROLOGICOS
¿CUÁNDO TIENE VALOR CLÍNICO?¿CUÁNDO TIENE VALOR CLÍNICO?
�AYUDA AL DIAGNÓSTICO : discordancia o duda clínico-cito-histo-colposcópica.
DETECCIÓN Y GENOTIPIFICACIÓN DE HPVDETECCIÓN Y GENOTIPIFICACIÓN DE HPV
�ESCLARECIMIENTO DE ASCUS
�ORIENTACIÓN TERAPÉUTICA Y DE SEGUIMIENTO
�CONTROL POST-TRATAMIENTO
�MEJORA EL SCREENING
PERSPECTIVAS EN LA PREVENCIÓN:VACUNAS CONTRA VIRUS PAPILOMA HUMANO
Vacunas contra HPV
+VLP HPV16 VLP HPV18
Antígenos AS04 adyuvante
AS04 – contenido en vacuna
+Sal
Aluminio(Al(OH) 3)
MPLInmuno-
estimulante
+ Sal Aluminio(Hidroxifosfato sulfato
de aluminio amorfo [AAHS])
VLP HPV16 VLP HPV18 VLP HPV6 VLP HPV11
Antígenos
AS04 – contenido en vacuna
AAHS-contenido en vacuna
Adyuvante
CervarixTM es una marca del grupo de compañías GlaxoSmithKline.
Gardasil® es una marca registrada de Merck & Co. Inc.
Las vacunas contra HPV son eficaces(Seguimiento promedio de 7 años)
(Kohen, Science, 2005)
Cuadrivalente (Gardasil; Merck): licenciada por ANMAT en octubre 2006Bivalente (Cervarix; GSK): licenciada por ANMAT en marzo 2008
(Villa y col, Lancet, 2005; Harper y col, Lancet 2006; Joura y col., Lancet 2009)
VACUNAS CONTRA HPV: MODO DE ACCION
• La vacuna induceAc neutralizantes
IgG anti L1, tipo-específico, que evitan que el virus ingrese a la célula⇒⇒⇒⇒
VPH
Canal cervical
Anticuerpo neutralizante
TRANSUDACIÓNingrese a la célula⇒⇒⇒⇒IMPIDEN LA NFECCIÓN .
• No es una vacuna terapéutica, NO tiene acción sobre infecciones preexistentes
Vaso sanguíneo
Daño epitelial
Membrana basal
Epiteliocervical
1. Parr EL, et al. J Virol 1997; 71:8109–8115; 2. Nardelli-Haefliger D, et al. J Natl cáncer Inst 2003; 95:1128–1137; 3. Schiller JT, et al. Nat Rev Microbiol 2004; 2:343–347; 4. Kemp TJ, et al. Clin vacuna inmunol 2008; 15:60–64; 5. Poncelet, et al. ESPID, Poto, Potugal, 2007;
Resumen 37, Sesión ES2; 6. David MB, et al.Poster presentado at ESPID, 2008; 7. Fraser C, et al. vacuna2007; 25:4324–4333; 8. Stanley M. VPH Today2007; 11:1–16; 9. Einstein M. Cancer Inmunol Inmunother 2007; 57:443–451.
10,000
1,000
100
10
Ser
um c
LIA
GM
T (
mM
U/m
l)(E
scal
a lo
g 10)
vaccination
Gardasil®Infección natural
Nivel del anticuerpos más alto que el de la infección
natural
VPH 16
Gardasil® Estudio fase II: niveles de anticuerpos hasta 7 años.
10
Ser
um c
LIA
GM
T (
mM
U/m
l)
6054363024181276320 1
* * * vaccination
10,000
1,000
100
10
Ser
um c
LIA
GM
T (
mM
U/m
l)E
scal
a (la
rga)
6054363024181276320 1
meses
* * * vaccination
Nivel del anticuerpos similar al nivel de la
infección natural
VPH 18
Gardasil®Infección natural
Adaptado de Olsson SE, et al. Vaccine 2007; 25:4931–4939; Villa LL, et al. Vaccine 2006; 24:5571–5583.
Cervarix® Estudio fase IIb: niveles de anticuerpos hasta 9,4 años
No se decarta la vacunación en mujeres adultas mayo res
(Wright y col., Vaccine, 2006; CDC´advisory committee recomends HPV vaccination)
VACUNA CONTRA HPV:VACUNA CONTRA HPV:
Algunas respuestas pendientesAlgunas respuestas pendientes
� Reemplazo de gentipos: Ocupación de los “nichos” de lo s
virus vacunales por otros hasta ahora menos disemin ados ?
Virus estable, larga coevolución con su hospedador
La competencia por nichos es poco probable↓
En un mismo individuo, las infecciones por distinto s tipos virales son independientes unas de otras
���� La vigilancia post-vacunal dará la última palabra
(Stanley y col, Vaccine, 2006)
VACUNA CONTRA HPV:VACUNA CONTRA HPV:
Algunas respuestas pendientesAlgunas respuestas pendientes
� Impacto en los programas de screening ?
Una vez iniciada la vacunación, se requerirán década s para poder observar los efectos sobre la incidencia del cáncer cervicalcervical
No todos los tipos virales carcinogénicos están inc luidos en las vacunas
⇓⇓⇓⇓
SE DEBE CONTINUAR EL SCREENING, PERO REDISEÑADO
���� Nuevo rol laboratorial de la detección de DNA de HP V(Franco y col, Vaccine, 2006)
PREVENCION SECUNDARIA:tamizaje
Se propone reducir la incidencia y mortalidadpor CC a través de la detección temprana, mediante la implementación de estrategiasparalograrla altacoberturade la poblaciónparalograrla altacoberturade la poblaciónobjetivo, la alta calidad del test de tamizaje, y el adecuado seguimiento y tratamientode laslesiones precancerosas y cáncer.
que puedan realizar una efectiva vigilanciay monitoreo del impacto de la vacunacióncontra HPV, a través de la actualización, capacitación y el establecimiento de un programa de control de calidad”
2 2 LabsLabs..
Mundiales de Mundiales de
ReferenciaReferencia
Suecia y EEUUSuecia y EEUU
Red Global de Laboratorios de HPV: Estructura
Inicio: 2006
3 niveles de responsabilidad
Centro colaborador: Inst. Nac. de Estándares Biológicos y Control, UK
Argentina, Australia, India, Japón Argentina, Australia, India, Japón
Sudáfrica, Suiza, Tailandia y TúnezSudáfrica, Suiza, Tailandia y Túnez
Laboratorios Nacionales Laboratorios Nacionales
de Referenciade Referencia
HPV HPV LabNetLabNet LaboratoriesLaboratories
GLOBAL WHO HPV REFERENCE LABORATORIESGLOBAL WHO HPV REFERENCE LABORATORIESProf. Joakim Dillner Dr. Elizabeth UngerUniversity of Lund Centers for Disease ControlSE-20502 Malmö, SWEDEN Atlanta, GA 30333, USA
REGIONAL WHO HPV REFERENCE LABORATORIESREGIONAL WHO HPV REFERENCE LABORATORIES
Prof. Anna-Lise Williamson Dr. Maria Alejandra PicconiInstitute of Infectious Disease and Molecular Medicine Oncogenic Viruses ServiceFaculty of Health Sciences National Reference Laboratory for PapillomavirusUniversity of Cape Town Natl. Institute of Infectious Diseases - ANLIS "Dr. Malbran" Cape Town, SOUTH AFRICA Buenos Aires, ARGENTINACape Town, SOUTH AFRICA Buenos Aires, ARGENTINARegion: Africa Region: America (PAHO) (Since March 2009)
Dr. Emna Ennaifer-Jerbi Assistant Prof. Denise Nardelli-HaefligerTunis Pasteur's Institute Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV)Belvédère, TUNISIA Lausanne, SWITZERLANDRegion: Eastern Mediterranean Region: Europe
Dr. Alok Chandra BhartiDivision of Molecular Oncology Dr. Sukhon SukvirachInstitute of Cytology and Preventive Oncology National Cancer InstituteNoida - 201 301, INDIA Rajthewe, Bangkok 1040, THAILANDRegion: South-East Asia Region: South-East Asia
Prof. Suzanne Garland Dr. Iwao KukimotoDepartment of Microbiology and Infectious Diseases Center for Pathogen GenomicsThe Royal Women's Hospital National Institute of Infectious Diseases (NIID)Parkville, VIC 3052, AUSTRALIA Tokyo 208-0011, JAPANRegion: Western Pacific Region: Western Pacific
1) Asesoramiento científico y técnico
2) Garantía de Calidad (QA/QC)
Red Global de Laboratorios de HPV:
Actividades
3) Entrenamiento
4) Comunicación(HPV LabNet Newsletter)
5) Vigilancia virológica
El trabajo se desarrolla en estrecha relación con las
autoridades sanitarias locales.
Vigilancia laboratorial de la infección por HPV en la era vacunal
La genotipificación requiere métodos de alta sensibilidad analítica
[1-10 copias] (basados en PCR)
�Evaluacióndel impactode la vacunaciónsobrela
La genotipificación requiere métodos de alta sensibilidad analítica
[1-10 copias] (basados en PCR)
�Evaluacióndel impactode la vacunaciónsobrela �Evaluacióndel impactode la vacunaciónsobrela prevalencia de los genotiposrelacionados con la vacuna (tipos incluidosen la fórmula y proteccióncruzadacontra virus relacionados)
�Discriminación de los tipos presentes en infecciones múltiples
�Monitoreo de un potencialreemplazo de genotipos
�Evaluacióndel impactode la vacunaciónsobrela prevalencia de los genotiposrelacionados con la vacuna (tipos incluidosen la fórmula y proteccióncruzadacontra virus relacionados)
�Discriminación de los tipos presentes en infecciones múltiples
�Monitoreo de un potencialreemplazo de genotipos(Stanley y col, Vaccine 2006; Pagliusi y col, Dis Markers, 2007; Meeting Report, OMS, 2007, Eklund et al 2010 )
HPV WHO position paper
La vacuna contra HPV sebe ser La vacuna contra HPV sebe ser introducida como parte de una estrategia coordinada que incluya educación, información, tamizaje, etc.
1º Taller de genotipificacion de HPVen el marco de la HPV LabNet de OMS
Buenos Aires, 26-26 abril 2010
20 participantes de 14 países latinoamericanos
CONCLUSIONES
� Todo cáncer de cérvixes precedido por una infección persistente con tipos de HPV de alto riesgo oncogénico.
� El comportamiento biológico de los HPVs de alto y bajo riesgoes DIFERENTE:HPV de alto riesgo ⇒⇒⇒⇒ >>>> tendencia a PERSISTIR
� El HPV utiliza la maquinaria biosintética de la célula:NO hay antivirales específicos���� NO se trata la infección, sino la enfermedad asociada
>>>>� HPV � amplia distribución:>>>> 70% de mujeres tendrán contacto durante su vida sexual
� Infección TRANSITORIA: autolimitada, SIN secuelas oncopatogénicas
� Infección PERSISTENTE:condición previa para lesiones preneoplásicas
� Mujeres con HSIL están en riesgo de desarrollar cáncer cervical, esta progresión no suele ser inmediata, sino que demora años
� Vigilancia laboratorial de la infección por HPV en la era vacunalMétodos de Métodos de alta sensibilidad analíticaalta sensibilidad analíticapermitirán permitirán
evaluar con seguridad que las vacunas prevengan evaluar con seguridad que las vacunas prevengan infecciones por tipos virales específicos y sus infecciones por tipos virales específicos y sus enfermedades asociadasenfermedades asociadas
CONCLUSIONES
enfermedades asociadasenfermedades asociadas
� Tamizaje poblacional en la era vacunalMétodos deMétodos dealta sensibilidad clínica alta sensibilidad clínica para detectar para detectar enfermedad. enfermedad. AlgoritmosAlgoritmos adaptadosadaptados a a laslas situacionessituacioneslocaleslocales
La historia natural de la infección por HPV y de sus enfermedades asociadasbrinda elementos para optimizar
los programas de prevención de cáncer de cérvix
� Prevención PRIMARIA: VACUNACIÓNEdad blanco: niñas (antes de IRS)Evita la infección
� Prevención SECUNDARIA: TAMIZAJEEdad blanco: mujeres >>>> 30 años
Mayor valor predictivo positivo en la detecciónde lesiones preneoplásicas CURABLES
Laboratorio de Virus OncogénicosInstituto Malbran, Buenos Aires (Argentina)
Visita del Prof. Harald zur Hausen, premio Nobel en Medicina 2008 Nov. 2009