C C A A M M E E R R A A S S E E P P A A R R A A T T O O R R I I A A wydanie specjalne 3S(2011): III Podlaskie Spotkanie Chromatograficzne
CCCAAAMMMEEERRRAAA SSSEEEPPPAAARRRAAATTTOOORRRIIIAAA
wydanie specjalne 3S(2011):
III Podlaskie
Spotkanie Chromatograficzne
III Podlaskie
Spotkanie Chromatograficzne
Reymontówka – Kotuń/Chlewiska
POD HONOROWYM PATRONATEM PREZYDENTA MIASTA SIEDLCE
I REKTORA UNIWERSYTETU PRZYRODNICZO-HUMANISTYCZNEGO
25 – 28 września 2011
Materiały konferencyjne
2
KOMITET NAUKOWY
Przewodniczący Komitetu Naukowego
Bronisław K. Głód – Siedlce
Członkowie
Tadeusz Dzido – Lublin
Marian Kamiński – Gdańsk
Piotr Słomkiewicz – Kielce
Andrzej Stołyhwo – Warszawa
Monika E. Waksmundzka-Hajnos – Lublin
Paweł K. Zarzycki – Koszalin
KOMITET ORGANIZACYJNY
Przewodnicząca Komitetu Organizacyjnego
Iwona Kiersztyn
Członkowie
Bronisław K. Głód
Anna Lamert
Paweł Piszcz
Paweł M. Wantusiak
3
PPRROOGGRRAAMM
NIEDZIELA (25.09.2011)
16:00 – 19:00 Rejestracja uczestników
19:00 – … Bankiet powitalny
PONIEDZIAŁEK (26.09.2011)
8:00 – 9:00 Śniadanie
9:00 – 9:20 Otwarcie konferencji
4
SESJA WYKŁADOWA I
Prowadzący obrady – prof. dr hab. Paweł K. Zarzycki
9:20 – 10:00
1. CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA Z BIODETEKCJĄ W BADANIU
EKSTRAKTÓW ROŚLINNYCH NA OBECNOŚĆ ZWIĄZKÓW O POTENCJALNEJ
AKTYWNOŚCI FARMAKOLOGICZNEJ
Monika E. WAKSMUNDZKA-HAJNOS, Łukasz CIEŚLA
10:00 – 10:30
2. PROCEDURA ROZDZIELANIA I OTRZYMYWANIA STAFYLOKOKCYNY T
Z ZASTOSOWANIEM WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
Michał LASKOWSKI, Beata FURMANEK-BLASZK,
Daniel JASTRZĘBSKI,
Marian KAMIŃSKI
10:30 – 11:00 przerwa na kawę
SESJA WYKŁADOWA II
Prowadząca obrady – prof. dr hab. Monika E. Waksmundzka-Hajnos
11:00 – 11:40
3. IMMUNO-CHROMATOGRAFIA - PRZEGLĄD ZASTOSOWAŃ, STOSOWANYCH
IMMUNO-SORBENTÓW I METOD IMMOBILIZACJI
Krystyna GRYGORYSHYN,
Marcin M. KAMIŃSKI, Grzegorz BOCZKAJ,
Mariusz JASZCZOŁT, Marian KAMIŃSKI
11:40 – 12:20
4. EXTRACTION STUDY OF SPIRULINA AND HERB DYES FROM SELECTED
PHARMACEUTICAL FORMULATIONS AND FOOD PRODUCTS
Magdalena B. ZARZYCKA, Paweł K. ZARZYCKI, Vicki L. CLIFTON,
Jerzy ADAMSKI, Bronisław K. GŁÓD
12:20 – 12:50
5. NOWE METODYKI OZNACZANIA DODATKÓW DO PALIW SILNIKOWYCH
Z ZASTOSOWANIEM ROZDZIELANIA WIELOWYMIAROWEGO LC-GC
Grzegorz BOCZKAJ, Mariusz JASZCZOŁT, Marian KAMIŃSKI
13:00 – 14:00 Obiad
5
SESJA WYKŁADOWA III
Prowadzący obrady – prof. dr hab. Piotr Słomkiewicz
14:00 – 14:30
6. OPTYMALNE WARUNKI ROZDZIELANIA I IZOLACJI FLAWONOIDÓW
I NAFTOCHINONÓW Z METANOLOWYCH EKSTRAKTÓW ROŚLINNYCH
Z ZASTOSOWANIEM PREPARATYWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
W ODWRÓCONYCH I NORMALNYCH UKŁADACH FAZ
Anita SKRZYPCZAK, Mariusz JASZCZOŁT, Rafał BANASIUK, Tycjan KOLANKO,
Aleksandra KRÓLICKA, Marian KAMIŃSKI
14:30 – 15:00
7. APPLICATION OF MICRO-TLC PLATFORM FOR FRACTIONATION OF HIGHLY
ORGANIC COMPOUNDS LOADED MATERIALS
Paweł K. ZARZYCKI
15:00 – 15:40
8. WIELOWYMIAROWE ROZDZIELANIE ORAZ BEZ-KALIBRACYJNE OZNACZENIE
SKŁADU ZŁOŻONYCH MIESZANIN SKŁADNIKÓW W CHROMATOGRAFII
CIECZOWEJ
Marian KAMIŃSKI, Marcin M. KAMIŃSKI
15:40 – 16:10
9. CHROMATOGRAFICZNE METODY ROZDZIELEŃ SKŁADNIKÓW CIECZY
JONOWYCH
Piotr STEPNOWSKI
16:10 – 17:00 przerwa na kawę
SESJA POSTEROWA
17:00 – 18:30 Moderator – Prof. dr hab. Marian Kamiński, dr Iwona Kiersztyn
19:00 – … OGNISKO / DYSKOTEKA
6
WTOREK (27.09.2011)
8:00 – 9:00 Śniadanie
9:00 – …. WYCIECZKA DO GRABARKI, MIELNIKA NAD BUGIEM I/LUB
(w zależności od pogody) KORONACYJNEGO MIASTA DROHICZYNA
WRAZ Z ZAMKNIĘTĄ CZĘŚCIĄ KLASZTORU JEZUITÓW
Obiad w trakcie wycieczki
PREZENTACJE FIRM (SHIMADZU, KNAUER, MERCK, PERLAN)
17.00 – 18:00
SESJA POSTEROWA
18:00 – 19:00 Moderator – Prof. dr hab. Paweł K. Zarzycki, dr Iwona Kiersztyn
19.00 Kolacja
ŚRODA (28.09.2011)
8:00 – 9:00 Śniadanie
SESJA WYKŁADOWA IV
Prowadzący obrady – prof. dr hab. Piotr Słomkiewicz
9:00 – 9:30
10. PROSTA METODYKA ROZDZIELANIA I OZNACZANIA SŁODZIKÓW I CUKRÓW
W PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH Z ZASTOSOWANIEM TECHNIK
WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
Paweł KWIATKOWSKI, Mariusz JASZCZOŁT, Marian KAMIŃSKI
9:30 – 10:00
11. CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA MIGRACJĘ IZOMERÓW OPTYCZNYCH
ROZDZIELANYCH METODĄ ELEKTROCHROMATOGRAFII PLANARNEJ
CIŚNIENIOWEJ (PPEC) W ODWRÓCONYM UKŁADZIE FAZ
Beata POLAK
10:00 – 10:30 przerwa na kawę
7
SESJA WYKŁADOWA V
Prowadzący obrady – dr Iwona Kiersztyn
10:30 – 11:00
12. BADANIA EMISJI LOTNYCH ZWIĄZKÓW ORGANICZNYCH Z ASFALTÓW
DROGOWYCH Z WYKORZYSTANIEM TECHNIKI DYNAMICZNEJ ANALIZY FAZY
NAD-POWIERZCHNIOWEJ I CHROMATOGRAFII GAZOWEJ I SPEKTROMETRII
MAS
Grzegorz BOCZKAJ, Marian KAMIŃSKI
11:00 – 11:30
13. SPRZĘŻENIE CHROMATOGRAFII PLANARNEJ Z SPEKTROMETRIĄ MAS
Anna KLIMEK-TUREK, Tadeusz H. DZIDO
11:30 – 12:00 ZAKOŃCZENIE I PODSUMOWANIE KONFERENCJI
13:00 Obiad
8
SESJA POSTEROWA
Poniedziałek 26.09.2011
17:00 – 18:30
Wtorek 27.09.2011
18:00 – 19:00
P 1
ANALIZA PORÓWNAWCZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH I STEROLI W MIĘŚNIU
ODWŁOKOWYM GARNELI CRANGON CRANGON W SEZONIE LETNIM W CYKLU
DWUROCZNYM
Adriana MIKA, Marek GOŁĘBIOWSKI, Edward SKORKOWSKI, Piotr STEPNOWSKI
P 2
PROFIL KWASÓW TŁUSZCZOWYCH W MIĘŚNIU ODWŁOKOWYM GARNELI
BAŁTYCKIEJ CRANGON CRANGON Z UZWGLĘDNIENIEM KWASU EPA I DHA
W CYKLU ROCZNYM
Adriana MIKA, Marek GOŁĘBIOWSKI, Edward SKORKOWSKI, Piotr STEPNOWSKI
P 3
RÓŻNORODNOŚĆ KWASÓW TŁUSZCZOWYCH I STEROLI ZIDENTYFIKOWANYCH
W TKANKACH MIĘKKICH CLUPEA HARENGUS METODĄ GC-MS I MALDI-TOF/MS
Adriana MIKA, Marek GOŁĘBIOWSKI, Edward SKORKOWSKI, Piotr STEPNOWSKI
P 4
BADANIA NAD SELEKTYWNOŚCIĄ ROZDZIELENIA WYBRANYCH FENOLOKWASÓW
W UKŁADACH RP HPLC Z RÓŻNYMI ADSORBENTAMI I MODYFIKATORAMI ELUENTU
Beata MISIOŁEK, Anna KLIMEK-TUREK, Tadeusz H. DZIDO
P 5
ZASTOSOWANIE GC I GC/MS DO ANALIZY JAKOŚCIOWEJ I ILOŚCIOWEJ MONO-
I DISACHARYDÓW W PRÓBKACH BIOLOGICZNYCH
Monika PASZKIEWICZ, Marek GOŁĘBIOWSKI, Dorota WIRKUS, Radosław OWCZUK,
Piotr STEPNOWSKI
9
P 6
ZASTOSOWANIE TECHNIK CHROMATOGRAFICZNYCH DO ANALIZY SKŁADU
LIPIDÓW POWIERZCHNIOWYCH BLATTA ORIENTALIS
Marek GOŁĘBIOWSKI, Monika PASZKIEWICZ, Agata SIKORA, Emilia WŁÓKA,
Wioletta WIELOCH, Elżbieta PRZYBYSZ, Mieczysława BOGUŚ, Piotr STEPNOWSKI
P 7
OPTYMALIZACJA ROZDZIELANIA ENANCJOMERÓW ZWIĄZKÓW POCHODNYCH
2,6-DIKETOPIPERAZYNY W CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
Kamila SZWED, Maciej DAWIDOWSKI, Anna BIELEJEWSKA
P 8
CYKLICZNE SILILOWANIE ORAZ TERT-BUTYLODIMETYLOSILILOWANIE JAKO
TECHNIKA DERYWATYZACJI β-BLOKERÓW, β-AGONISTÓW ORAZ ANTYEPILEP-
TYKÓW
Magda CABAN, Piotr STEPNOWSKI, Marek KWIATKOWSKI, Natalia MIGOWSKA,
Jolanta KUMIRSKA
P 9
ZASTOSOWANE ZŁÓŻ EKSTARKCYJNYCH O CHARAKTERZE POLIMERYCZNYM
DO WYDZIELANIA LEKÓW O WŁAŚCIWOŚCIACH ZASADOWYCH
Magda CABAN, Piotr STEPNOWSKI, Marek KWIATKOWSKI, Natalia MIGOWSKA,
Jolanta KUMIRSKA
P 10
WYZNACZANIE IZOTERM ADSORPCJI JEDNOPIERŚCIENIOWYCH WĘGLOWODORÓW
AROMATYCZNYCH NA SORBENCIE HALOIZYTOWYM METODĄ INWERSYJNEJ
CHROMATOGRAFII GAZOWEJ
Kamil CZECH, Piotr M. SŁOMKIEWICZ
P 11
OZNACZANIE WYBRANYCH FARMACEUTYKÓW W PRÓBKACH ŚRODOWISKOWYCH
POBRANYCH Z REJONÓW PRZYBRZEŻNYCH POŁUDNIOWEGO BAŁTYKU
I WOJEWÓDZTWA POMORSKIEGO PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI LC-MS/MS
Anna BIAŁK-BIELIŃSKA, Marta BORECKA, Grzegorz SIEDLEWICZ,
Kinga KORNOWSKA, Ksenia PAZDRO, Jolanta KUMIRSKA, Piotr STEPNOWSKI
10
P 12
ANALIZA JAKOŚCIOWA I ILOŚCIOWA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH, ESTRÓW
METYLOWYCH I ALKOHOLI CALLIPHORA VICINA Z WYKORZYSTANIEM HPLC-LLSD
I GC/MS
Marek GOŁĘBIOWSKI, Monika PASZKIEWICZ, Anna GRUBBA, Mieczysława I. BOGUŚ,
Piotr STEPNOWSKI
P 13
ZASTOSOWANIE GC/MS-SIM DO ANALIZY LIPIDÓW KUTIKULARNYCH SARCOPHAGA
CARNARIA
Marek GOŁĘBIOWSKI, Monika PASZKIEWICZ, Alma OLESZCZAK,
Mieczysława I. BOGUŚ, Piotr STEPNOWSKI
P 14
OPTYMALIZACJA WARUNKÓW ROZDZIELANIA CHROMATOGRAFICZNEGO
MIESZANIN POLISACHARYDÓW WYIZOLOWANYCH ZE ŚCIANY KOMÓRKOWEJ
RÓŻNYCH SZCZEPÓW BAKTERII Z RODZAJU ENTEROCOCCUS
Anna BYCHOWSKA, Małgorzata CZERWICKA, Kinga MARSZEWSKA,
Zbigniew MAĆKIEWICZ, Piotr STEPNOWSKI, Zbigniew KACZYŃSKI
P 15
DETERMINATION OF BISPHENOL A AND RELATED EDCs COMPOUNDS IN MILK
USING micro-TLC AND TEMPERATURE-DEPENDENT INCLUSION
CHROMATOGRAPHY
Paweł K. ZARZYCKI, Elżbieta WŁODARCZYK, Deborah HODGSON, Vicki L. CLIFTON
P 16
SILILOWANIE JAKO UNIWERSALNA TECHNIKA DERYWATYZACJI
FARMACEUTYKÓW W ANALIZIE GC I GC-MS
Jolanta KUMIRSKA, Natalia MIGOWSKA, Magda CABAN, Paulina ŁUKASZEWICZ,
Anna BIAŁK-BIELIŃSKA, Małgorzata CZERWICKA, Piotr STEPNOWSKI
P 17
ZASTOSOWANIE DETEKTORA AZOTOWO-FOSFOROWEGO (NPD) DO OZNACZANIA
FARMACEUTYKÓW TECHNIKĄ GC
Jolanta KUMIRSKA, Natalia MIGOWSKA, Magda CABAN, Mirko WEINHOLD,
Anna BIAŁK-BIELIŃSKA, Jorg TÖMING, Piotr STEPNOWSKI
11
P 18
WYKORZYSTANIE TECHNIK CHROMATOGRAFICZNYCH DO WYODRĘBNIANIA
I ANALIZY STRUKTURALNEJ POLISACHARYDOWYCH SKŁADNIKÓW ŚCIANY
KOMÓRKOWEJ BAKTERII ENTEROCOCCUS FAECIUM
Zbigniew KACZYŃSKI, Anna BYCHOWSKA, Małgorzata CZERWICKA,
Kinga MARSZEWSKA, Piotr STEPNOWSKI
P 19
WYKORZYSTANIE TECHNIK CHROMATOGRAFICZNYCH DO OKREŚLENIA SKŁADU
CUKROWEGO O-POLISACHARYDÓW WYODRĘBNIONYCH Z WYBRANYCH SZCZEPÓW
BAKTERII RODZAJU CRONOBACTER
Kinga MARSZEWSKA, Małgorzata CZERWICKA, Anna BYCHOWSKA,
Jadwiga WIŚNIEWSKA, Janusz RAK, Piotr STEPNOWSKI, Zbigniew KACZYŃSKI
P 20
ANALIZA CHROMATOGRAFICZNA WOSKÓW POWIERZCHNIOWYCH
Beata SZAFRANEK, Elżbieta SYNAK, Piotr STEPNOWSKI
P 21
WPŁYW POŁOŻENIA PODSTAWNIKA NA ADSORPCJĘ Z FAZY WODNEJ
CHLOROPOCHODNYCH ANILINY NA SORBENTACH HALOIZYTOWYCH
Magdalena GARNUSZEK, Beata SZCZEPANIK, Piotr SŁOMKIEWICZ, Bożena SYZDÓŁ
P 22
ZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII W ANALIZIE STRUKTURY O-POLISACHARYDÓW
BAKTERII PECTOBACTERIUM ATROSPETICUM
Małgorzata CZERWICKA, Jolanta KUMIRSKA, Jerzy GAJDUS, Anna BYCHOWSKA,
Kinga MARSZEWSKA, Jadwiga WIŚNIEWSKA, Piotr STEPNOWSKI,
Zbigniew KACZYŃSKI
P 23
METODYKA ROZDZIELANIA, IDENTYFIKACJI I OZNACZANIA KUMARYNY
W NAPOJACH ALKOHOLOWYCH ORAZ MACERATACH Z TURÓWKI WONNEJ -
WYKORZYSTANIE ODWRÓCONYCH UKŁADÓW FAZ, DETEKCJI UV/DAD
I PRZEPŁYWU ZWROTNEGO W KOLUMNIE
Anita SKRZYPCZAK, Marian KAMIŃSKI
12
P 24
IDENTYFIKACJA PRODUKTÓW ELEKTROCHEMICZNEGO ROZKŁADU CIECZY
JONOWYCH ZA POMOCĄ TECHNIKI GC-MS
Aleksandra FABIAŃSKA, Marek GOŁĘBIOWSKI, Piotr STEPNOWSKI,
Ewa Maria SIEDLECKA
P 25
METODY BADANIA CAŁKOWITEGO POTENCJAŁU ANTYOKSYDACYJNEGO
PRODUKTÓW PSZCZELARSKICH
Elwira LEWCZUK, Katarzyna CIOŁEK, Paweł M. WANTUSIAK, Paweł PISZCZ,
Iwona KIERSZTYN, Bronisław K. GŁÓD, Paweł K. ZARZYCKI
P 26
ZASTOSOWANIE TECHNIK HPLC-UV I LC-MS DO IDENTYFIKACJI PRODUKTÓW
ELEKTROCHEMICZNEGO ROZKŁADU WYBRANYCH CIECZY JONOWYCH
Aleksandra FABIAŃSKA, Marek GOŁĘBIOWSKI, Jadwiga WIŚNIEWSKA,
Piotr STEPNOWSKI, Ewa Maria SIEDLECKA
P 27
- i - CYKLODEKSTRYNY ROZPUSZCZONE W CIECZY JONOWEJ JAKO FAZY
STACJONARNE W CHROMATOGRAFII GAZOWEJ
Monika SOBÓTKA, Monika ASZTEMBORSKA, Janusz LIPKOWSKI
P 28
OZNACZANIE AKTYWNOŚCI PRZECIWUTLENIAJĄCEJ OLEJÓW ROŚLINNYCH
Piotr KOŚCIESZA, Rafał JURCZAK, Paweł PISZCZ, Paweł M. WANTUSIAK,
Iwona KIERSZTYN, Bronisław K. GŁÓD
P 29
WPŁYW CIECZY JONOWYCH JAKO DODATKÓW DO CYKLODEKSTRYNOWEJ FAZY
RUCHOMEJ NA CHIRALNE ROZDZIELENIE W WYSOKOSPRAWNEJ
CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
Agata PAPIERZ, Monika ASZTEMBORSKA
P 30
PRO- I ANTYOKSYDANTY W PROCESIE FERMENTACJI MIODÓW
Adrian SZABRAŃSKI, Paweł M. WANTUSIAK, Paweł PISZCZ, Bronisław K. GŁÓD
13
SSEESSJJAA WWYYKKŁŁAADDOOWWAA
14
CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA Z BIODETEKCJĄ
W BADANIU EKSTRAKTÓW ROŚLINNYCH NA OBECNOŚĆ ZWIĄZKÓW
O POTENCJALNEJ AKTYWNOŚCI FARMAKOLOGICZNEJ
Monika WAKSMUNDZKA-HAJNOS, Łukasz CIEŚLA
Zakład Chemii Nieorganicznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie,
ul. Chodźki 4a, 20-093 Lublin
e-mail: [email protected] (Monika Waksmundzka-Hajnos)
[email protected] (Łukasz Cieśla)
Przebadano wiele ekstraktów roślinnych i związków z nich wyizolowanych pod kątem ich
zastosowania jako leków. Na przykład w przypadku choroby Alzheimer’a aby zmniejszyć
symptomy tej dolegliwości stosuje się leki z klasy inhibitorów acetylocholinoesterazy. Jednocześnie
stwierdzono, że stres oksydacyjny odgrywa istotną rolę w rozwoju i postępie chorób
neurodegradacyjnych. Stres oksydacyjny i stała akumulacja wolnych rodników w komórkach
żywych organizmów prowadzi do uszkodzeń komórkowych organelli i w końcu do patologii
związanej z takimi chorobami jak: rak, astma, zapalenie, choroby neurodegradacyjne. Tak więc
istnieje potrzeba poszukiwań naturalnych surowców na obecność zmiataczy wolnych rodników
(związków o charakterze antyoksydantów), które mogą przeciwdziałać rozwojowi wyżej
wymienionych chorób.
Chromatografia cienkowarstwowa powiązana z biodetekcją daje możliwość przebadania
ekstraktów roślinnych na obecność antyoksydantów, inhibitorów różnorodnych enzymów takich
jak: acetylocholinoesterazy, glikozydazy, związków antybakteryjnych i przeciwgrzybicznych.
W obecnej pracy pokazane są przykłady zastosowań chromatografii cienkowarstwowej w różnych
układach chromatograficznych i rozwijanych różnymi technikami dla rozdzielania ekstraktów
roślinnych i zastosowanie różnych metod biodetekcji w celu stwierdzenia obecności
antyoksydantów oraz inhibitorów AChE. Dyskutowane są też praktyczne problemy związane
z wpływem różnorodnych czynników – adsorbentów, użytych rozpuszczalników, czasu trwania
reakcji wolny rodnik – antyoksydant na wyniki badań.
15
PROCEDURA ROZDZIELANIA I OTRZYMYWANIA STAFYLOKOKCYNY T
Z ZASTOSOWANIEM WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII
CIECZOWEJ
Michał LASKOWSKI1, Beata FURMANEK-BLASZK
2, Daniel JASTRZĘBSKI
1,
Marian KAMIŃSKI1*
/wysalanie/odsalanie, GPC/SEC-HPLC, RP-HPLC, HILIC-HPLC, IExC-HPLC,
krystalizacja, re-krystalizacja/
1Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska,
ul. G. Narutowicza 11/12 80-233 Gdańsk, PL, *[email protected];
2Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24 80-822 Gdańsk, PL
Proces oczyszczania peptydów lub białek, powstałych w warunkach naturalnego metabolizmu
bakterii, albo w rezultacie tzw. nadprodukcji biotechnologicznej, składa się zawsze z serii operacji
jednostkowych, mających na celu izolację określonego indywiduum o wysokiej aktywności
biologicznej, z mieszaniny o złożonym lub bardzo złożonym składzie molekularnym. Wysoki
stopień czystości izolowanego indywiduum ma kluczowe znaczenie dla jednoznacznego określenia
struktury, dokładnego zbadania funkcji biologicznych, a szczególnie, dla zapewnienia wysokiej
aktywności przeciw-bakteryjnej. Zwykle procedury oczyszczania peptydów / białek posiadają kilka
etapów, z użyciem głównie, technik chromatografii w różnych układach faz. Opracowanie
optymalnej procedury separacyjnej jest, więc, zawsze poważnym problemem z powodu złożonego
składu supernatantu otrzymanego w rezultacie wykonania hodowli bakteryjnej oraz, dodatkowo,
z powodu konieczności uniknięcia denaturacji peptydu/białka, jako efektu zastosowania
nieodpowiednich technik, albo niekorzystnych warunków rozdzielania i izolacji.
W pracy przedstawiono nową procedurę oczyszczania bakteriocyny produkowanej przez
szczep Staphylococcus cohnii T, opracowaną z zastosowaniem wysokosprawnej kolumnowej
chromatografii cieczowej - HPLC. Stafylokocyna T, to peptyd zbudowany z 22 aminokwasów
wykazujący szczególnie wysoką aktywność bakteriobójczą wobec Staphylococus aureus.
Porównano efektywność izolacji Stafylokokcyny T z zastosowaniem HPLC względem „tradycyjnej”
metodyki opisanej w pracy doktorskiej [1] oraz w artykule [2] i opartej, po wysoleniu peptydu, na:
filtracji żelowej (Sephadex G-100®) i chromatografii jonowymiennej. Procedura, opracowana w
ramach niniejszej pracy, została zrealizowana w skali modelowej wysokosprawnej chromatografii
cieczowej (HPLC) w warunkach bez oraz przeładowania kolumny. Jest dużo mniej praco-
i czasochłonna od tradycyjnej. W konsekwencji, może zostać wykorzystywana w skali procesowej
do izolacji stafylokokcyny T z płynu pohodowlanego. Autorzy pracują obecnie nad opracowaniem
optymalnych warunków hodowli, a także nad przeniesieniem opracowanej procedury rozdzielania
do skali preparatywnej, a być może, procesowej.
[1]. B. Furmanek, Rozprawa doktorska „Charakterystyka bakteriocyny wytwarzanej przez szczep Staphylococcus sp.T”,
Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Geografii i Oceanologii, Gdańsk 1995.
[2] B. Furmanek, T. Kaczorowski, R. Bugalski, K. Bielawski, J. Bohdanowicz and A.J. Podhajska: Identification,
characterization and purification of the lantibiotic staphylococcin T, a natural gallidermin variant. J. Appl. Microbiol.
1999, 87, 856-866.
[3] Zgłoszenie patentowe: R. Bugalski, A.J. Podhajska: Nowy szczep bakterii zawierający plazmid i wytwarzający
substancje o charakterze antybiotycznym A1(21) 299566 (22) 93 07 01 6(51) C12N 1/20.
16
IMMUNO-CHROMATOGRAFIA - PRZEGLĄD ZASTOSOWAŃ,
STOSOWANYCH IMMUNO-SORBENTÓW I METOD IMMOBILIZACJI
Krystyna GRYGORYSHYN1, Marcin M. KAMIŃSKI
2, Grzegorz BOCZKAJ
1,
Mariusz JASZCZOŁT1, Marian KAMIŃSKI
1*,
/chromatografia powinowactwa (AC), chromatografia immuno-powinowactwa
(IAC), przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, immobilizacja,
reaktywacja sorbentu/
1Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska,
ul. G. Narutowicza 11/12 80-233 Gdańsk, PL, *[email protected],
2Krebs-Forschung Zentrum, Heidelberg, D, [email protected]
Szczególna selektywność, a często wręcz, wysoka specyficzność rozdzielania
z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa (Affinity Chromatography (AC)), powoduje, że ta
technika, znajduje szerokie zastosowanie do oczyszczania określonych peptydów i białek,
szczególnie enzymów, w skali preparatywnej, a także procesowej. Z wykorzystaniem specjalnie
przygotowanych sorbentów warstwowych (core surface paricles (CSP)), o ferromagnetycznym
rdzeniu, może być także stosowana jako technika specyficznej sorpcji służąca do wyodrębniania
z przestrzeni bio-rektora, określonych produktów bio-technologii. Chromatografia immuno-
powinowactwa (IAC) jest odmianą chromatografii powinowactwa o najwyższej specyficzności.
W pracy, na tle ogólnych zasad przygotowania sorbentu i dokonywania rozdzielania oraz
regeneracji powierzchni sorpcyjnej w chromatografii powinowactwa, zostały przedstawione
techniki „unieruchamiania” (immobilizacji) przeciwciał na powierzchni nośnika. Dokonano
przeglądu najczęściej stosowanych w tym celu nośników oraz metod unieruchamiania przeciwciał
na powierzchni szeroko porowatego „immobilizatora” z zachowaniem specyficznej aktywności
powierzchni sorpcyjnej. Umiejętność zastosowania warunków zapewniających wysoką aktywność
immobilizowanych makromolekuł, ma największy wpływa na uzyskiwanie wysokiej specyficzności
otrzymanego w ten sposób sorbentu. Ogromne znaczenie posiada też umiejętność doboru
optymalnych warunków „odszczepiania” sorbatu, a następnie, odtwarzania jego aktywności
sorpcyjnej.
Przedstawiono przykłady najważniejszych zastosowań poszczególnych odmian
chromatografii powinowactwa oraz immuno-powinowactwa, do otrzymywania określonych
peptydów lub białek w skali preparatywnej lub procesowej. Przedstawiono też perspektywy
dalszego rozwoju różnych odmian chromatografii powinowactwa, w tym szczególnie,
chromatografii immuno-powinowactwa.
17
EXTRACTION STUDY OF SPIRULINA AND HERB DYES
FROM SELECTED PHARMACEUTICAL FORMULATIONS
AND FOOD PRODUCTS
Magdalena B. ZARZYCKAa, Paweł K. ZARZYCKI
a, Vicki L. CLIFTON
b,
Jerzy ADAMSKIc, Bronisław K. GŁÓD
d
/Stosowana w pracy technika rozdzielania: micro-TLC/
aSection of Toxicology and Bioanalytics, Department of Civil and Environmental Engineering, Koszalin
University of Technology, Śniadeckich 2,75-453 Koszalin, Poland. bThe Robinson Institute, School of Paediatrics and Reproductive Health, Lyell MCEwin Hospital, University
of Adelaide, Haydown Rd, Elizabethvale 5112 SA, Australia. cHelmholtz Zentrum Muenchen, Institute of Experimental Genetics, Genome Analysis Center, Ingolstaedter
Landstr.1, 85764 Neuherberg, Germany. dDepartment of Analytical Chemistry, Institute of Chemistry, Faculty of Science, University of Podlasie,
3 Maja 54, 08–110 Siedlce, Poland.
This work is continuation of our research focusing on development of micro-TLC platform
for the fast analysis of low-molecular mass compounds from spirulina samples [1-5]. Based on our
previous research examining the fractionation of spirulina dyes using number of water and organic
liquids, in this study the target compounds were extracted using three relatively low-parachor
liquids: methanol, acetone and tetrahydrofuran. We analyzed a number of the spirulina samples,
which were originated from pharmaceutical formulations and food products as well as rich in
chlorophyll dyes herb samples used as the reference materials. Quantitative data derived from
micro-plates under visible light conditions and after iodine staining were explored using simple
chemometrics tools including cluster analysis and principal components analysis (PCA). Using this
method we could easily distinguish genuine spirulina and non-spirulina samples (Figure 1) as well
as fresh from expired commercial products. It has been found that comparison of the PCA patterns
derived from different extraction liquids can be usefull for preliminary chemotaxonomic
classification of the samples investigated. Described approach allows non-expensive fractionation
of target substances including cyanobacteria pigments in raw biological or environmental samples.
Due to the low consumption of the mobile phase, micro-TLC method can be considered as
environmentally friendly and green chemistry analytical tool.
Figure 1. Principal component plots showing relationships between samples investigated with respect to 1, 2
and 3 factor scores, using methanol, acetone and tetrahydrofurane extraction liquids. Objects marked as
black balls correspond to genuine spirulina products. References
[1] P. K. Zarzycki, M. B. Zarzycka, J. AOAC Int. 91 (2008) 1196. [2] P. K. Zarzycki, M. B. Zarzycka, B. K. Głód,
PAK, 55 (2009) 276. [3] P. K. Zarzycki, M. B. Zarzycka, M. M. Ślączka, V. L. Clifton, Anal. Bioanal. Chem. 397
(2010) 905. [4] P. K. Zarzycki, M. M. Ślączka, M. B. Zarzycka, E. Włodarczyk, M. J. Baran, Anal. Chim. Acta, 688
(2011) 168. [5] P.K. Zarzycki, M.B. Zarzycka, V.L. Clifton, J. Adamski, B.K. Głód, J. Chromatogr A. In press.
18
NOWE METODYKI OZNACZANIA DODATKÓW DO PALIW
SILNIKOWYCH Z ZASTOSOWANIEM ROZDZIELANIA
WIELOWYMIAROWEGO LC-GC
Grzegorz BOCZKAJ1, Mariusz JASZCZOŁT, Marian KAMIŃSKI
2
/wysokosprawna chromatografia cieczowa, chromatografia gazowa/
Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej,
Ul. G. Narutowicza 11/12, 80-233 Gdańsk,
e-mail:[email protected], [email protected]
2
W pracy przedstawiono wyniki badań nad opracowaniem metodyki oznaczania wybranych
dodatków „myjących” w paliwie do silników diesla. Porównano metodyki jednoetapowe
z wykorzystaniem chromatografii gazowej z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (GC-FID) lub
ze spektrometrem mas (GC-MS) oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem UV
z matrycą fotodiodową (HPLC-UV-DAD), z metodykami dwuetapowymi, w których do wstępnej
izolacji składników dodatku zastosowano wysokosprawną chromatografię cieczową w normalnym
układzie faz (NP-HPLC). Frakcję dodatku zbierano z wykorzystaniem elucji normalnej, albo
z zastosowaniem przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie (eluent back-flush (EBF)). Oznaczeń
końcowych dokonywano z zastosowaniem techniki GC-FID oraz GC-MS.
Badania wykazały, że nie ma możliwości oznaczania dodatków wybranych do badań
z zastosowaniem metodyk jednoetapowych – tj. z zastosowaniem wyłącznie HPLC lub GC.
Zastosowanie dwuetapowej procedury pozwala, natomiast, na uzyskiwanie powtarzalnych wyników
oznaczeń, a wartości granicy oznaczalności (LOQ) wynoszą, w zależności od sposobu zbierania
frakcji techniką HPLC, od 1,4 - 2,2 ppm (GC-MS w trybie SIM) oraz 9,6-24,0 ppm (GC-FID).
W pracy porównano precyzję oraz dokładność, a także przedyskutowano możliwe błędy oznaczeń
i niedoskonałości opracowanych metodyk.
Słowa kluczowe: chromatografia cieczowa HPLC, chromatografia gazowa GC, przepływ zwrotny EBF,
analityka naftowa, kontrola jakości, dodatki do paliw
19
OPTYMALNE WARUNKI ROZDZIELANIA I IZOLACJI FLAWONOIDÓW
I NAFTOCHINONÓW Z METANOLOWYCH EKSTRAKTÓW
ROŚLINNYCH Z ZASTOSOWANIEM PREPARATYWNEJ
CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ W ODWRÓCONYCH I NORMALNYCH
UKŁADACH FAZ
Anita SKRZYPCZAK1, Mariusz JASZCZOŁT
1, Rafał BANASIUK
1,
Tycjan KOLANKO1, Aleksandra KRÓLICKA
2, Marian KAMIŃSKI
1
1 Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska,
ul. G. Narutowicza 11/12 80-233 Gdańsk, PL, [email protected], 2
Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu
Medycznego, Wydział Biotechnologii, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk
Preparatywna chromatografia cieczowa jest techniką rozdzielania i oczyszczania użytecznych
ilości substancji z różnych skomplikowanych mieszanin. Po rozdzieleniu należy wykonać izolację
składników ze stosunkowo rozcieńczonych frakcji eluatu. Czasem operacja wydzielania
rozdzielonych składników z frakcji eluatu, może przebiegać w ten sposób, by to – dodatkowo –
sprzyjało oczyszczaniu produktu. Szczególne znaczenie ma opracowanie procedur rozdzielania
i otrzymywania o minimalnych kosztach jednostkowych, zwłaszcza, w skali procesowej.
Praca prezentuje optymalne warunki rozdzielania i otrzymywania wybranych flawonoidów
oraz naftochinonów z metanolowych ekstraktów roślin Dionaea muscipula, Drosera aliciae
i Drosera capensis oraz Drosera binata hodowanych w warunkach in vitro. Zastosowano techniki
chromatografii cieczowej w skali preparatywnej w odwróconych (RP-PLC (C18)) i normalnych
(NP-PLC (SiO2, lub DIOL)) układach faz, dążąc do warunków przeładowania kolumny.
Rozdzielanie i kolekcja frakcji, zawierających obie grupy metabolitów, może być wykonywane
jedynie w odwróconych układach faz, z zastosowaniem elucji skokowej i etapu
re-kondycjonowania aktywności sorpcyjnej kolumny. Jednak, selektywność rozdzielania
naftochinonów jest niekorzystna, mimo ich wysokiej retencji. Do rozdzielenia naftochinonów
zdecydowanie bardziej korzystne są warunki NP, niekorzystne dla flawonoidów, które, mimo
zakwaszenia eluentu, charakteryzują się w warunkach NP bardzo asymetrycznymi pikami
i niekorzystną selektywnością rozdzielania, szczególnie dla żelu krzemionkowego, jako fazy
stacjonarnej. W ceku otrzymywania naftochinonów z ekstraktów metanolowych, pierwszym etapem
rozdzielania powinna być ich ekstrakcja do cykloheksanu, a następnie - rozdzielanie w normalnych
układach faz. Stosowanie elucji gradientowej jest niekorzystne w skali preparatywnej. Wiąże się
to ze znacznymi kosztami odzysku składników eluentu, w porównaniu z warunkami elucji
izokratycznej lub skokowej.
20
APPLICATION OF MICRO-TLC PLATFORM FOR FRACTIONATION
OF HIGHLY ORGANIC COMPOUNDS LOADED MATERIALS
Paweł K. ZARZYCKI
/Stosowana w pracy technika rozdzielania: micro-TLC, HPLC/
Section of Toxicology and Bioanalytics, Department of Civil and Environmental Engineering,
Koszalin University of Technology, Śniadeckich 2,75-453 Koszalin, Poland
The main scope of this communication is to summarize the latest research of our group
concerning application of micro-thin-layer chromatography (micro-TLC) as a simple fractionation
tool for fast screening of raw extracts derived from complex biological, pharmaceutical and
environmental samples [1-5]. The problem of qualitative and quantitative determination of bioactive
substances from highly organic compounds loaded materials will be discussed from practical point
of view. Particularly, results of fractionation of complex matrices originated from food samples,
birds’ feathers, fatty oils, milk components, fresh and hydrolyzed fish bile as well as soot residues
in dust samples derived from biomass fuel and fossils home heating systems will be presented.
Moreover, chemometric investigations based on micro-TLC involving fluorescence detection and/or
PMA visualization of SPE extracts derived from surface water ecosystems and treated sewage water
samples discharged by the municipal wastewater treatment plant will be reported in comparison
with UV-DAD HPLC generated data [6, 7].
References:
[1] M.J. Baran, P.K. Zarzycki, “Fast method for fractionation of lipids and related non-polar substances
from birds’ feathers using thermostated micro-TLC”, Camera Separatoria, 3 (1) (2011) 221-227.
[2] P.K. Zarzycki, M.M. Ślączka, M.B. Zarzycka, E. Włodarczyk, M.J. Baran, T. Heese, B.K. Głód, “Fast
separation and detection of main components in complex raw biological materials using temperature-
controlled planar micro-chromatography (micro-TLC)”, Measurement Automation and Monitoring
(Pomiary Automatyka Kontrola), 56 (4) (2010) 360-364.
[3] P.K. Zarzycki, M.M Ślączka, M.B. Zarzycka, M.A. Bartoszuk E. Włodarczyk, M.J. Baran;
“Temperature-controlled micro-TLC: a versatile green chemistry and fast analytical tool for separation
and preliminary screening of steroids fraction from biological and environmental samples”, Journal of
Steroids Biochemistry and Molecular Biology, (2011) DOI: 10.1016/j.jsbmb.2011.05.007.
[4] P.K. Zarzycki, M.B. Zarzycka, V.L. Clifton, J. Adamski, B.K. Głód, “Low parachor solvents extraction
and thermostated micro-TLC separation for fast screening and classification of spirulina from
pharmaceutical formulations and food samples”, J. Chromatogr. A, 1218 (2011) 5694-5704.
[5] P.K. Zarzycki, M.M. Ślączka, M.B. Zarzycka, E. Włodarczyk, M.J. Baran; “Application of micro-thin-
layer chromatography as a simple fractionation tool for fast screening of raw extracts derived from
complex biological, pharmaceutical and environmental samples”, Anal. Chim. Acta, 688 (2011)
168-174.
[6] P.K. Zarzycki, E. Włodarczyk, M.J. Baran, “Determination of endocrine disrupting compounds using
temperature-dependent inclusion chromatography I. Optimization of separation protocol”,
J. Chromatogr. A, 1216 (2009) 7602-7611.
[7] P.K. Zarzycki, E. Włodarczyk, M.J. Baran; “Determination of endocrine disrupting compounds using
temperature-dependent inclusion chromatography II. Fast screening of free steroids and related low-
molecular-mass compounds fraction in the environmental samples derived from surface waters, treated
and untreated sewage waters as well as activated sludge material”; J. Chromatogr. A, 1216 (2009)
7612-7622.
21
WIELOWYMIAROWE ROZDZIELANIE ORAZ BEZ-KALIBRACYJNE
OZNACZENIE SKŁADU ZŁOŻONYCH MIESZANIN SKŁADNIKÓW
W CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
Marian KAMIŃSKI1*
, Marcin M. KAMIŃSKI2
1Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska,
ul. G. Narutowicza 11/12 80-233 Gdańsk, PL, *[email protected];
2 Krebs-Forschung Zentrum, Heidelberg, Niemcy
W pracy przedstawiono założenia i koncepcję, zależności matematyczne oraz praktyczną
weryfikację - wykonaną na przykładach wybranych produktów technicznych, stanowiących
mieszaniny wielu różnych składników o nieznanych wartościach współczynników kalibracyjnych -
dla bez-kalibracyjnej procedury oznaczania składu wieloskładnikowych mieszanin o nieznanych
składnikach, znajdujących się w mieszaninie w zawartościach nie-śladowych. Idea jest oparta na
wykorzystaniu rozdzielania wielowymiarowego, z wykorzystaniem rozdzielania tej samej
mieszaniny w co najmniej dwóch kolumnach o różnych wypełnieniach, z zastosowaniem
co najmniej dwóch różnych eluentów i rozpuszczalników próbki w postaci eluentu oraz stosowania
przepływu zwrotnego eluentu w dowolnej kolumnie. W konsekwencji, dla mieszaniny złożonej
z N składników otrzymuje się co najmniej N równań liniowych z N niewiadomymi, z których każda
oznacza zawartość innego składnika w badanej mieszaninie składników. Korzystnie jest uzyskać
N+M (M>=1) równań z N – niewiadomymi oraz na tej podstawie dokonać w sposób iteracyjny
minimalizacji wartości błędu oznaczenia zawartości poszczególnych N składników mieszaniny.
Dodatkowo, do obliczania składu mieszaniny można wykorzystać koncepcję Synowiec’a, albo
z wykorzystaniem rozdzielania z dwoma eluentami o różnych, znanych wartościach współczynnika
załamania światła, albo poprzez zastąpienie drugiego eluentu, wzorcem wewnętrznym o znanej
wartości współczynnika załamania światła. Można też, dodatkowo, wykorzystać znajomość
wartości molowych absorbancji tych składników mieszaniny, dla których ta ich właściwość jest
znana, a które są, albo rozdzielone w postaci odrębnych pików, albo są zupełnie nie rozdzielone.
W pracy wykazano, że praktyczne wykorzystanie przedstawionej koncepcji, pozwala na
poprawne określenie składu wieloskładnikowej mieszaniny, mimo nieznajomości wartości
współczynników kalibracyjnych jej składników lub grup określonych składników.
22
CHROMATOGRAFICZNE METODY ROZDZIELEŃ SKŁADNIKÓW
CIECZY JONOWYCH
Piotr STEPNOWSKI
/RP-HPLC, IC-HPLC, IP-HPLC i CE/
Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk
Ciecze jonowe to jedna z najbardziej obiecujących grup alternatywnych, nielotnych
rozpuszczalników. Głównym zastosowaniem cieczy jonowych na skalę przemysłową staje się
synteza organiczna, a zwłaszcza reakcje katalizowane przez metale przejściowe. Ciecze jonowe
znalazły także zastosowanie w procesach biokatalitycznych. Hydrofobowe ciecze jonowe, mogą
być również z powodzeniem wykorzystane jako rozpuszczalnik i elektrolit, wykazując szeroki
zakres stabilności elektrochemicznej, dobre przewodnictwo, termiczną stabilność oraz trwałość.
Udowodniono także przydatność cieczy jonowych jako elektrolitów w elektroforezie kapilarnej,
modyfikatorów faz stałych w chromatografii gazowej i cieczowej, czy jako czynników
maskujących wolne ugrupowania silanolowe w chromatografii cieczowej. Badania określające
zagrożenia związane ze stosowaniem cieczy jonowych (toksyczność, ekotoksyczność,
biodegradowalność, rozprzestrzenianie i uciążliwość w środowiska i in.) wymagają prostych
i powtarzalnych technik analitycznych. Techniki te, nie tylko muszą być dostosowane do różnych
matryc pochodzenia naturalnego ale również powinny umożliwiać oznaczanie tych związków na
poziomie śladowym, przypominającym stężenia mogące występować we wcześniej eksponowanych
układach biologicznych czy zanieczyszczonych próbkach środowiskowych. Dotychczas
opracowane metody analizy kationów i anionów cieczy jonowych mają zastosowanie w badaniach
matryc pochodzenia środowiskowego, biologicznego czy materiałowego. W analityce kationów
cieczy jonowych stosuje się obecnie szereg technik separacyjnych zdolnych do rozdzielenia
analizowanego czwartorzędowego kationu alkiloimidazoliowego lub alkilopirydyniowego
od pozostałych związków, zarówno obdarzonych ładunkiem jak i obojętnych. Analizę kationów
cieczy jonowych przeprowadza się wykorzystując wysokosprawną chromatografię cieczową
w odwróconym układzie faz (RP-HPLC), chromatografię jonową (IC-HPLC) oraz jonowo-
asocjacyjną (IP-HPLC), a także elektroforezę kapilarną (CE). Analityka anionów przeprowadzana
jest wyłącznie o chromatografię jonową (IC-HPLC) z detekcją konduktometryczną, przy czym
opracowano metody zarówno z tłumieniem jak i bez tłumienia tła. Badana jest możliwość zatężania
cieczy jonowych z wysoce rozcieńczonych roztworów wodnych, w których zastosowano metodę
ekstrakcji do fazy stałej z użyciem złoża jonowymiennego, zbudowanego z polimerowego nośnika
ze związanymi ugrupowaniami kwasu benzosulfonowego. W przypadku stałych próbek
biologicznych i środowiskowych opracowano selektywną metodę izolacji cieczy jonowych
polegającą na ekstrakcji mieszaninami kwasu fosforowego lub trifluorooctowego z nasyconymi
roztworami soli amonowych.
23
PROSTA METODYKA ROZDZIELANIA I OZNACZANIA SŁODZIKÓW
I CUKRÓW W PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH Z ZASTOSOWANIEM
TECHNIK WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
Paweł KWIATKOWSKI, Mariusz JASZCZOŁT, Marian KAMIŃSKI
*
/RP-HPLC, HILIC, RID, UV-VIS/DAD/
1Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska,
ul. G. Narutowicza 11/12 80-233 Gdańsk, PL,*[email protected]
Produkty o obniżonej zawartości cukru wykazują wzrastający udział w produkcji środków
spożywczych. Dodatkowo zwiększa się liczba produktów spożywczych, w których cukier naturalny
został całkowicie zastąpiony przez inne substancje, pochodzenia naturalnego, lub syntetycznego,
zwane słodzikami. Stosowanie półsyntetycznych i syntetycznych substancji słodzących stanowi
alternatywę w stosunku do „klasycznych” substancji słodzących (węglowodanów), ze względu na
ich niską kaloryczność, a jednocześnie wysoką „słodkość” (są od 100 do 1000 razy słodsze, niż
sacharoza (zwana ostatnio – „cukrozą”) i wiele innych węglowodanów. Jednak słodziki wykazują
również właściwości niekorzystne, do których można zaliczyć: występowanie ubocznych
produktów syntezy oraz powstawanie w organizmie człowieka produktów będących wynikiem
przemian metabolicznych, szczególnie słodzików syntetycznych. Z drugiej strony, ze względu na
znacznie niższy koszt, słodziki bywają dodawane do produktów spożywczych zamiast cukru, co
oznacza - w istocie - fałszowanie produktu. Z tych powodów szczególnie ważne jest dysponowanie
prostymi metodami identyfikacji i oznaczania jednocześnie podstawowych cukrów stosowanych
w przemyśle spożywczym, szczególnie sacharozy, a także glukozy i fruktozy, jak i głównych
słodzików, dopuszczonych tam do stosowania. Korzystne by było dysponowanie także metodyką
identyfikacji oraz oznaczania „ubocznych” składników powstających podczas syntezy głownie
stosowanych słodzików.
Praca stanowi pierwszą z serii prac dotyczących powyższej problematyki. Przedstawiono
wyniki badań nad opracowaniem optymalnych warunków rozdzielania oraz oznaczania wybranych
słodzików, dopuszczonych do stosowania na terenie RP oraz wybranych cukrów. Zastosowano
rozdzielanie wielowymiarowe z elucją izokratyczną i technikę wysokosprawnej chromatografii
cieczowej w warunkach odwróconych układów faz (RP-HPLC) oraz z zastosowaniem oddziaływań
hydrofilowych (HILIC), w połączeniu z detekcją refraktometryczną (RID) oraz
spektrofotometryczną (UV-VIS/DAD). W warunkach odwróconych układów niemożliwe jest
rozdzielanie i oznaczanie poli-oli, którymi są niektóre słodziki, a także cukrów. Natomiast,
w warunkach oddziaływań hydrofilowych (HILIC), z elucją izokratyczną i z zastosowaniem
przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie ulegają rozdzieleniu w satysfakcjonującym stopniu
wszystkie badane substancje. słodzące. Dzięki zastosowaniu prostego i mało kosztownego detektora
RID, można je następnie oznaczyć.
24
CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA MIGRACJĘ IZOMERÓW OPTYCZNYCH
ROZDZIELANYCH METODĄ ELEKTROCHROMATOGRAFII
PLANARNEJ CIŚNIENIOWEJ (PPEC)
W ODWRÓCONYM UKŁADZIE FAZ
Beata POLAK
Zakład Chemii Fizycznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej,
Uniwersytet Medyczny w Lublinie, ul. Chodźki 4a, 20-093 Lublin;
e-mail: [email protected]
Enancjomery są grupą izomerów o takiej samej budowie ilościowej i jakościowej. Różnią się
jedynie przestrzennym rozmieszczeniem grup funkcyjnych występujących w ich cząsteczkach.
Ta cecha cząsteczki powoduje odmienny sposób oddziaływania poszczególnych enancjomerów
ze środowiskiem wykazującym podobne właściwości. Za takie środowisko można uważać każdy
żywy organizm. Można, więc spotkać się ze różnicowaną reakcją organizmu na poszczególne
enancjomery. Z tego względu izolacja i dokładne badanie poszczególnych enancjomerów jest
koniecznością.
Jedną z metod służących do tego celu jest elektrochromatografia planarna ciśnieniowa
(PPEC). W tej metodzie przepływ fazy ruchomej względem fazy stacjonarnej odbywa się dzięki
procesowi elektroosmozy, zaś migracja stref różnych substancji jest wywołana połączeniem
efektów elektroforetycznego i podziału pomiędzy dwie fazy. Dzięki takiemu połączeniu, nowa
technika zyskała wiele zalet. Należą do nich między innymi zwiększenie sprawności układu
i znaczne skrócenie czasu trwania eksperymentu. Zalety te są również wykorzystywane podczas
rozdzielania enancjomerów. Sam mechanizm chiralnego różnicowania poszczególnych par
enancjomerów polega na utworzeniu połączeń diastereoizomerycznych z chiralnym selektorem.
Takie diastereoizomery powstawać mogą podczas procesu chromatograficznego (metoda
bezpośrednia) lub też przed procesem chromatograficznym (metoda pośrednia). Każdy
z diastereoizomerów cechuje się inną szybkością migracji w układzie i w ten sposób dochodzi do
ich rozdzielania. Na przykładzie rozdzielania enancjomerów, obydwoma przedstawionymi powyżej
sposobami, zostaną omówione czynniki wpływające na migrację stref substancji w PPEC. Można je
podzielić na dwie grupy. Do pierwszej należą, związane z fazą ruchomą, takie jak pH, stężenie
i rodzaj zastosowanego buforu, czy rodzaj i stężenie czynnika organicznego w wodno-organicznej
fazie ruchomej. Natomiast drugą grupę stanowią czynniki związane z warunkami prowadzenia
eksperymentu. Są nimi różnica potencjałów przykładana do elektrod; czas trwania eksperymentu
czy temperatura układu separacyjnego.
25
BADANIA EMISJI LOTNYCH ZWIĄZKÓW ORGANICZNYCH
Z ASFALTÓW DROGOWYCH Z WYKORZYSTANIEM TECHNIKI
DYNAMICZNEJ ANALIZY FAZY NAD-POWIERZCHNIOWEJ
I CHROMATOGRAFII GAZOWEJ I SPEKTROMETRII MAS
Grzegorz BOCZKAJ1, Marian KAMIŃSKI
2
/dynamiczna analiza fazy nad-powierzchniowej, chromatografia gazowa/
Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej,
ul. G. Narutowicza 11/12, 80-233 Gdańsk,
e-mail:[email protected]; [email protected]
2
Asfalty drogowe pochodzenia naftowego są wytwarzane z pozostałości z destylacji
próżniowej ropy naftowej w procesie tzw. „oksydacji”. Częściowy kraking termiczny mający
miejsce na etapie destylacji próżniowej oraz w procesie utleniania (oksydacji) pozostałości
próżniowej, prowadzi do powstania lotnych związków organicznych częściowo rozpuszczających
się w finalnym produkcie, tzw., asfalcie. Podczas dalszego wykorzystania asfaltu, tak na etapie jego
ekspedycji, jak również, budowy dróg, ma miejsce częściowe uwalnianie rozpuszczonych w niej
lotnych związków organicznych (LZO) z gorącej masy bitumicznej. Od wielu lat prowadzone są
badania nad oceną oddziaływania budowy dróg asfaltowych na środowisko, w tym głównie, na
zdrowie ludzi pracujących podczas budowy. Bada się głównie emisję wielopierścieniowych
węglowodorów aromatycznych (WWA). Nie oznacza się zawartości LZO, a także mgły asfaltowej
w powietrzu, którym oddychają pracownicy, ani emisji tych substancji do otoczenia. Ze względu na
wysoką złowonność emitowanych składników, a także ich toksyczność, konieczne jest opracowanie
standardowych procedur oznaczania wielkości emisji LZO, w tym, kluczowych grup lotnych
związków organicznych tj. związków chemicznych z grupy BTX, pirydyny i jej pochodnych, i
innych, a także zbadanie charakterystyki granulometrycznej i stężenia mgły asfaltowej.
W pracy przedstawiono wyniki badań nad składem fazy lotnej w powietrzu nad powierzchnią
lustra gorących asfaltów drogowych. Porównano zawartość zidentyfikowanych związków
chemicznych w fazie nad-powierzchniowej czterech próbek mas bitumicznych, tzn., tzw.
pozostałości próżniowej oraz trzech asfaltów utlenionych o różnym stopniu przetworzenia. Wyniki
badań wykazały znaczne różnice w składzie oraz zawartości LZO dla tych produktów. Największą
grupę związków powstałych w wyniku krakingu termicznego stanowią olefiny i węglowodory
aromatyczne, jednak, w procesie tzw. „oksydacji” powstają z nich alkohole i kolejno, związki
karbonylowe i karboksylowe – aldehydy i ketony oraz lotne kwasy organiczne. W fazie lotnej
zidentyfikowano także ważne, z punktu widzenia oceny toksyczności oparów asfaltu, związki
aromatyczne, tzn., benzen, toluen oraz 4-etylo-1,2-dimetylo-benzen.
Słowa kluczowe: asfalty, lotne związki organiczne (LZO), dynamiczna analiza fazy nad-
powierzchniowej (DHS), chromatografia gazowa (GC), spektrometria mas (MS)
26
SPRZĘŻENIE CHROMATOGRAFII PLANARNEJ
Z SPEKTROMETRIĄ MAS
Anna KLIMEK-TUREK*, Tadeusz H. DZIDO
Zakład Chemii Fizycznej Katedry Chemii, Uniwersytet Medyczny w Lublinie,
ul. Chodźki 4A, 20-093 Lublin, *e-mail: [email protected]
Chromatografia planarna / cienkowarstwowa (TLC) jest techniką chromatograficzną, która
posiada ugruntowane zastosowanie w wielu laboratoriach. Możliwość analizowania wielu próbek
jednocześnie, brak konieczności wstępnego oczyszczania analizowanych związków, oszczędność
rozpuszczalników, prostota wykonania analizy oraz niższe koszty w porównaniu do cieczowej
chromatografii kolumnowej czynią z chromatografii planarnej metodę cieszącą się wciąż
niesłabnącym zainteresowaniem [1-2]. Według szacunkowych obliczeń chromatografia
cienkowarstwowa jest stosowana m.in. w następujących dziedzinach: w farmacji- ok. 30%,
biochemii i medycynie- ok. 25%, analizie zanieczyszczeń środowiska- ok. 15%, analizie żywności-
ok. 10% oraz w analizie związków nieorganicznych – ok. 5% [3]. Stosuje się ją średnio w 75%
ogólnej liczby analiz opracowanych w różnych Farmakopeach. Sprzężenie chromatografii planarnej
z jednym z najbardziej efektywnych narzędzi analitycznych jakim jest spektrometria mas (MS),
daje tej technice ogromne możliwości związane z bezpośrednią analizą związków. Wiąże się to
jednak z koniecznością pokonania wielu problemów związanych, przede wszystkim,
z przeniesieniem próbki analitu z płytki do spektrometru. Na dzień dzisiejszy wiele różnych technik
łączenia TLC z MS jest opisanych w literaturze [4]. Ze względu na operacje związane
z przeniesieniem próbki, można je podzielić na dwie grupy: metody pośrednie, w których próbka
jest zdrapywana lub ekstrahowana z płytki chromatograficznej, a następnie przenoszona do źródła
jonów oraz metody bezpośrednie, w których strefy rozdzielanych substancji z płytki
chromatograficznej są kierowane wprost do spektrometru mas. Metody bezpośrednie mogą być
prowadzone w próżni oraz pod ciśnieniem atmosferycznym. W prezentacji zostaną omówione
najnowocześniejsze techniki łączenia chromatografii cienkowarstwowej ze spektrometrią mas,
a także perspektywy tej metody, szczególnie w świetle możliwości połączenia jej
z elektrochromatografią planarną.
Literatura:
1. J. Sherma, B. Fried, Handbook of Thin Layer Chromatography, Marcel Dekker, New York, 2003.
2. P. E. Wall: Thin Layer Chromatography: A Modern Practical Approach, Springer-Verlsag, RSC,
Cambridge, 2006.
3. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa 2000.
4. S.Ch Chenga, M.Z. Huangb, J. Shiea, J. Chromatogr. A, 1218 (2011) 2700-2711.
27
SSEESSJJAA PPOOSSTTEERROOWWAA
28
ANALIZA PORÓWNAWCZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH I STEROLI
W MIĘŚNIU ODWŁOKOWYM GARNELI CRANGON CRANGON
W SEZONIE LETNIM W CYKLU DWUROCZNYM
Adriana MIKA1,2
, Marek GOŁĘBIOWSKI3, Edward SKORKOWSKI
1,
Piotr STEPNOWSKI2
/HPLC-LLSD, GC-MS, MALDI-TOF/MS/
1Wydział Biologii, Uniwersytet Gdański, Stacja Biologiczna, ul. Ornitologów 26, 80-680 Gdańsk,
[email protected] 2Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, Katedra Analizy Środowiska, ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk,
[email protected] 3Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, Pracownia Chemometrii Środowiska, ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk,
O różnorodności wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w tym niezbędnych
nienasyconych kwasów (NNKT) i steroli decydują czynniki biologiczne, chemiczne, fizyczne
i geograficzne. Należą do nich: dostępność pokarmu powiązana z sezonem i warunkami
klimatycznymi, w tym z pogodą, temperaturą wody i miejscem bytowania. Znaczna ilość NNKT
omega - 3 i steroli pochodzi ze świeżej materii organicznej czerpanej z fitoplanktonu z toni wodnej,
w kwasy omega – 6 obfitują algi i nadbrzeżna roślinność, natomiast detrytus, składowany w części
przydennej, dostarcza nasyconych kwasów tłuszczowych [1]. Wzrost czasu nasłonecznienia wody
powoduje zwiększenie ilości kwasów nasyconych w stosunku do wielonienasyconych [2]. Typ
analizowanej tkanki decyduje również o rodzaju i ilościach NNKT. Najwięcej niezbędnych kwasów
tłuszczowych i steroli zawiera tkanka mięśniowa z powodu dużego powinowactwa do gromadzenia
tego typu związków lipidowych w postaci fosfolipidów. Ponadto fosfolipidy obfitujące w NNKT są
główną składową błon komórkowych. Wysokie stężenie NNKT u organizmów w słonej wodzie
morskiej wpływa na przetrwanie i tolerancję w zmianach zasolenia u skorupiaków. Obecność tych
kwasów modyfikuje przepuszczalność błony komórkowej i kształtuje działalność pompy potasowo-
sodowej, jako niezbędny osmoregulatorowy mechanizm [3].
Latem 2008 profil kwasów tłuszczowych zawierał kwasy od C10 do C18, zarówno we frakcji
triacylogliceroli (TAG), jak i wolnych kwasów tłuszczowych (FFA), zaś frakcja lipidów polarnych
(fosfolipidy) przeanalizowana techniką GC-MS obejmowała kwasy od C14 do C18. Dopiero
zastosowanie metody MALDI-TOF/MS uwidoczniło duże zróżnicowanie frakcji FA łącznie
z kwasami n-3 i n-6 oraz z ich prekursorami - kwasem α-linolenowym 18:3n-3 (ALA) i linolowym
18:2n-6 (LA). Frakcja TAG latem 2009 była niemal identyczna, jednak istotne zmiany odnotowano
w grupie FFA. Zidentyfikowano kwasy 20:5 (EPA) i 22:6 (DHA) należące do rodziny n-3 oraz
kwas 20:4 (AA), będący przedstawicielem grupy n-6. Pomijając kwas palmitynowy C16:0, który
dominował w każdej frakcji lipidów, te dwa przedstawiciele kwasów n-3 dominowały w całym
profilu kwasów tłuszczowych latem 2009, przyjmując wartości 276 mg*g-1
dla EPA i 69 mg*g-1
dla
DHA. W podtypie Crustacea zostało określonych 16 steroli, wszystkie pochodzenia roślinnego [4].
Cholesterol, którego ilości kształtują się w granicach 90-95%, jest prekursorem hormonów
płciowych oraz hormonów lnienia i jest niezbędny dla wzrostu i przeżycia skorupiaków. W sezonie
letnim 2008 prócz cholesterolu, który stanowił prawie 95%, zidentyfikowano desmosterol
i kampesterol w ilościach po 2,7%. Rok później liczba zidentyfikowanych steroli wzrosła do 11.
Cholesterol stanowił 60% wszystkich steroli, a drugim najbardziej licznym sterolem był 22-
dehydrocholesterol.
[1] Abad M., (1995), Comp Biochem Phys C, 110,109–118
[2] Kasai T., (2004), Fisheries Sci, 70, 527–529
[3] Maazouzi C., (2007), Comp Biochem Phys A, 147, 868–875
[4] Kanazawa A. ,(2001), Fish Sci, 67, 997–1007
29
PROFIL KWASÓW TŁUSZCZOWYCH W MIĘŚNIU ODWŁOKOWYM
GARNELI BAŁTYCKIEJ CRANGON CRANGON Z UZWGLĘDNIENIEM
KWASU EPA I DHA W CYKLU ROCZNYM
Adriana MIKA1,2
, Marek GOŁĘBIOWSKI3, Edward SKORKOWSKI
1,
Piotr STEPNOWSKI2
/HPLC-LLSD, GC-MS, MALDI-TOF/MS/ 1Wydział Biologii, Uniwersytet Gdański, Stacja Biologiczna, ul. Ornitologów 26, 80-680 Gdańsk,
[email protected] 2Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, Katedra Analizy Środowiska, ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk,
[email protected] 3Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, Pracownia Chemometrii Środowiska, ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk,
Analiza profilu kwasów tłuszczowych obejmowała 4 sezony. Wykazano duże zróżnicowanie
ilościowe i jakościowe w obrębie każdej z analizowanych frakcji lipidów. Techniką użytą
do separacji tej niezwykle bogatej grupy związków była HPLC-LLSD, w wyniku której uzyskano
takie grupy jak triacyloglicerole (TAG), wolne kwasy tłuszczowe (FFA), sterole oraz lipidy polarne
(fosfolipidy). Grupę FFA i sterole poddano spochodnieniu za pomocą mieszaniny sililującej
BSTFA:TMCS (99:1), zaś frakcję TAG i fosfolipidów procesowi estryfikacji. Tak przygotowane
próbki materiału biologicznego poddano analizie GC-MS. Celem potwierdzenia lipidów polarnych
oraz szerszej identyfikacji ich przedstawicieli użyto techniki MALDI-TOF/MS. Materiałem
badawczym był mięsień odwłokowy (abdomen) Crangon crangon, garnela bałtycka. Według wielu
autorów największym bogactwem NNKT są ryby i owoce morza, dlatego celem pracy było
przeanalizowanie jakościowe i ilościowe profilu kwasów tłuszczowych. Ponadto z powodu dużego
zainteresowania kwasami tłuszczowymi (FA) zarówno nasyconymi, jak i nienasyconymi, a pośród
nich kwasami należącymi do rodzin omega-3 i omega-6 (NNKT) kolejnym zadaniem było ustalenie
zmienności sezonowej FA w poszczególnych frakcjach lipidów w ciągu roku. Czynniki takie jak
dostępność pokarmu powiązana z sezonem oraz pogoda, temperatura wody, miejsce bytowania,
czas nasłonecznienia wody, jak również typ analizowanej tkanki, wywierały znaczny wpływ na
zróżnicowanie lipidów w cyklu rocznym [1-2].
W okresie wiosny odnotowano największe ilości lipidów, 32,2 mg*g-1
mokrej masy tkanki,
a pośród nich frakcja FFA wynosiła 20,3 mg wolnych kwasów tłuszczowych*g-1
mokrej masy
tkanki mięśniowej. Sezon później, latem 2009 ilość lipidów kształtowała się w granicach 7 mg*g-1
mokrej masy tkanki, zaś ilość odnotowanych FFA wynosiła 1,34 mg*g-1
. Zanotowano znacznie
mniej kwasów tłuszczowych zarówno we frakcji TAG, FFA jak również pośród fosfolipidów. Ilości
NNKT, kwasu EPA (20:5n-3) zmniejszyły się z 276 mg mg*g-1
(wiosna) na 224 mg*g-1
(lato).
Odwrotna sytuacja miała miejsce w przypadku kwasu AA (20:4n-6) należącego do konkurencyjnej
rodziny kwasów omega - 6. Nastąpiła zmiana ilości z 9,9 mg*g-1
na 22 mg*g-1
. Wzrost niezbędnych
nienasyconych kwasów tłuszczowych koreluje z cyklem rozwojowym garneli bałtyckiej - w okresie
wiosny i lata wpływa na rozwój i wzrost młodych stadiów larwalnych [1], stąd wartości NNKT
powinny być najwyższe, a wahania wartości lipidów i poszczególnych frakcji uzasadnione są
właśnie zużyciem kwasów tłuszczowych na wymienione procesy. Potwierdzeniem tego są analizy
z okresu zimy, kiedy to profil FA był bardzo ubogi, a kwasów AA, EPA i DHA nie odnotowano.
Potwierdza to fakt, iż najniższe wskazania składników energetycznych i tym samym najniższe
wskazania energii notowane są w okresie listopad - marzec [3].
[1] Abad M., (1995), Comp Biochem Phys C, 110,109–118.
[2] Kasai T., (2004), Fisheries Sci, 70, 527–529.
[3] Campos J., (2009), J Sea Res, 62 (2009) 106–113.
30
RÓŻNORODNOŚĆ KWASÓW TŁUSZCZOWYCH I STEROLI
ZIDENTYFIKOWANYCH W TKANKACH MIĘKKICH CLUPEA
HARENGUS METODĄ GC-MS I MALDI-TOF/MS
Adriana MIKA1,2
, Marek GOŁĘBIOWSKI3, Edward SKORKOWSKI
1,
Piotr STEPNOWSKI2
/HPLC-LLSD, GC-MS, MALDI-TOF/MS/ 1Wydział Biologii, Uniwersytet Gdański, Stacja Biologiczna, ul. Ornitologów 26, 80-680 Gdańsk,
[email protected] 2Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, Katedra Analizy Środowiska, ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk,
[email protected] 3Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, Pracownia Chemometrii Środowiska, ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk,
W komórce cholesterol używany jest jako ważny budulec przy jej regeneracji oraz pomaga
w podtrzymaniu jej życiowych funkcji. Receptory, które znajdują się na powierzchni ściany
komórkowej kontrolują dostarczanie cholesterolu w zależności od zapotrzebowania komórki.
Cholesterol utrzymuje płynność błony komórkowej, jak również jest prekursorem hormonów
steroidowych. Sterole takie jak 22-dehydrocholesterol, brassikasterol, ergosterol i izofukosterol są
niezbędne dla narybku do dalszego wzrostu [1]. Z kolei kwasy nasycone stanowią główne źródła
energii niezbędnej do wzrostu ryb i tworzenia ikry u samic, wielonienasycone kwasy są zaś źródłem
energii w procesie reprodukcji i rozwoju gonad. Pobudzają wzrost ryby i wpływają na utrzymanie
błony komórkowej oraz na jej funkcje. Kwas arachidonowy, AA (20-4n-6) mimo, iż ma podobne
znaczenie biologicznie jak EPA (20:5n-3) i DHA (22:6n-3), często u ryb jest pomijany,
prawdopodobnie z powodu niskich zawartości w organizmie, w przeciwieństwie do ssaków. AA ma
istotny wpływ na różne funkcje fizjologiczne, w tym na osmoregulację, funkcję układu sercowo-
naczyniowego i funkcjonowania systemów układu rozrodczego [2].
Ryby stanowią główny magazyn niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych dla
inhibicji chorób sercowo-naczyniowych i neurodegeneracyjnych. Na rynku istnieje wiele
suplementów kwasów omega-3 i omega-6, jednak według naukowców kwasy te są lepiej
przyswajalne bezpośrednio z ryb, pomimo, iż w suplemencie diety notuje się większe ilości
kwasów EPA i DHA. Ryba zawiera kwasy n-3 i n-6 w postaci triacylogliceroli, które w tej postaci
mogą być przyswajane przez organizm, zaś oleje rybne obfitują w estry etylowe tych kwasów [3].
Celem pracy było określenie różnorodności kwasów tłuszczowych w poszczególnych
tkankach, zarówno w mięśniu, tak chętnie spożywanym, wątrobie, gdzie zachodzi proces
lipogenezy de novo, jak również w plemnikach i płynu nasiennym, na które to rozwój mają duży
wpływ wszystkie wymienione kwasy. W każdej tkance, prócz płynu nasiennego, dominowała
frakcja kwasów tłuszczowych. W mięśniu odnotowano największe ilości steroli i NNKT. Pomimo
procesu lipogenezy zachodzącego w wątrobie, cechowała się ona mniejszym zróżnicowaniem
ilościowym i jakościowym kwasów tł., natomiast wyodrębniono z niej aż 10 steroli. W pozostałych
tkankach w granicach 100 % dominował cholesterol. Metodą MALDI-TOF/MS zidentyfikowano
polarne lipidy, a pośród nich fosfolipidy, które w największym stopniu magazynują
wielonienasycone kwasy tłuszczowe [4]. Profil FA zawierał kwasy od C10:0 (płyn nasienny) do C24:1
(wszystkie analizowane tkanki). Zarówno w profilu kwasów tłuszczowych wyznaczonym techniką
GC-MS jak i MALDI-TOF/MS dominowały kwasy EPA i DHA. Zgodnie z literaturą kwas AA
przyjmował nawet 10-krotnie niższe wartości w porównaniu z kwasami omega-3.
[1] Kanazawa A., (2001), Fish Sci, 67, 997–1007.
[2] Huynh M., (2007), Comp Biochem Phys B, 146, 504–511.
[3] Elvevoll E.O., (2006), Lipids, 41, 1109-1114.
[4] Limbourn A.J., (2009), Comp Biochem Phys B, 152, 292-298.
31
BADANIA NAD SELEKTYWNOŚCIĄ ROZDZIELENIA
WYBRANYCH FENOLOKWASÓW W UKŁADACH RP HPLC
Z RÓŻNYMI ADSORBENTAMI I MODYFIKATORAMI ELUENTU
Beata MISIOŁEK*, Anna KLIMEK-TUREK, Tadeusz H. DZIDO
Zakład Chemii Fizycznej, Katedra Chemii, Uniwersytet Medyczny w Lublinie,
ul. Chodźki 4a, 20- 093 Lublin,
*e-mail: [email protected]
Fenolokwasy, wtórne metabolity roślin wyższych, są hydroksylowymi pochodnymi kwasu
benzoesowego i cynamonowego. Źródłem tych związków są głównie owoce i warzywa. Substancje
te odgrywają kluczową rolę w procesach biologicznych roślin oraz, dzięki właściwościom
antyoksydacyjnym, w ochronie zdrowia człowieka. Fenolokwasy przyczyniają się do usuwania
wolnych rodników, chelatowania jonów metali, a także przeciwdziałają chorobie wieńcowej,
nowotworom, stanom zapalnym oraz cukrzycy.
W związku z tak istotnym znaczeniem fenolokwasów, ważne jest ich właściwe oznaczanie,
które najczęściej wykonuje się metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym
układzie faz.
W poprzednich publikacjach prezentowaliśmy wpływ organicznego składnika fazy ruchomej
na selektywność rozdzielenia węglowodorów aromatycznych z polarnymi grupami [1, 2] oraz
fenolokwasów [3] dla odwróconego układu faz chromatografii cieczowej z jednym rodzajem
adsorbentu, typu C-18. Badania wykazały wyraźną zależność zmian selektywności rozdzielenia od
rodzaju modyfikatora (metanol, acetonitryl, tetrahydrofuran) w wodnej fazie ruchomej. Do
wyjaśniania tych zmian zostało zastosowane podejście, które uwzględnia oddziaływania
międzycząsteczkowe substancji tylko ze składnikami adsorpcyjnej warstwy fazy stacjonarnej.
W tej prezentacji chcielibyśmy przedstawić przydatność wspomnianego podejścia do
wyjaśniania zmian selektywności rozdzielenia substancji dla układów z adsorbentami niepolarnymi,
różniącymi się długością łańcuchów alifatycznych.
Literatura:
[1] T.H. Dzido, H. Engelhardt, Chromatographia, 1994, 39, 51-61.
[2] T.H. Dzido, T.E. Kossowski, D. Matosiuk, J. Chromatogr. A, 2002, 947, 167-183.
[3] A. Klimek- Turek, T.H. Dzido, H. Engelhardt, LC- GC Europe, 2008, 21, 33-42.
32
ZASTOSOWANIE GC I GC/MS DO ANALIZY JAKOŚCIOWEJ
I ILOŚCIOWEJ MONO- I DISACHARYDÓW W PRÓBKACH
BIOLOGICZNYCH
Monika PASZKIEWICZ1*
, Marek GOŁĘBIOWSKI1, Dorota WIRKUS
1,
Radosław OWCZUK2, Piotr STEPNOWSKI
1
/GC, GC-MS/
1Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18, 80-952 Gdańsk,
2Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Gdański Uniwersytet Medyczny,
ul. Dębinki 7, 80-211 Gdańsk *e-mail: [email protected]
Bariera jelitowa oddziela jałowe tkanki jamy brzusznej od treści przewodu pokarmowego,
który jest fizjologicznie skolonizowany przez niezbędną dla prawidłowego funkcjonowania ustroju
florę bakteryjną. Zabiegi operacyjne z zakresu chirurgii naczyniowej przeprowadzane w obrębie
jamy brzusznej związane są bardzo często z koniecznością zaciśnięcia tętnicy głównej. Zamknięcie
światła aorty prowadzi do szeregu zmian hemodynamicznych oraz zaburzeń perfuzji narządów
zlokalizowanych w jamie brzusznej. Bardzo niewiele jest danych, które pozwoliłyby na określenie
czy towarzyszące zaciśnięciu aorty zmiany perfuzji jelit mogą skutkować zaburzeniami ich
czynności. Otwarte pozostaje pytanie, czy stosowanie do zabiegów na tętnicy głównej znieczulenia
zewnątrzoponowego, będzie miało korzystne następstwa u chorych z potencjalnym upośledzeniem
czynności bariery jelitowej związanym z zakładaniem zacisku na tętnicę główną.
Diagnostyka przepuszczalności jelitowej oparta jest na pomiarze stężenia w moczu wcześniej
spożytych substancji, które mają pewne właściwe cechy związane z ich wchłanianiem a nie są
metabolizowane w organizmie. Zastosowanie odpowiedniej kombinacji mono- i disacharydów
umożliwia ocenę stopnia nasilenia uszkodzeń jelita a także ich lokalizację. Do analizy jakościowej
i ilościowej cukrów wydalonych z moczem, ze względu na odpowiednią selektywność i czułość,
wykorzystuje się techniki chromatograficzne, takie jak HPLC i GC. Wymagają one odpowiedniego
oczyszczenia próbki oraz przeprowadzenia cukrów w odpowiednie pochodne.
W ramach niniejszej pracy opracowano dwie metody oznaczania mono- i disacharydów
w wykorzystaniem chromatografii gazowej. Do oczyszczania próbek moczu zastosowano
mieszaninę żywic jonowymiennych (Amberlite XAD-2 i DEAE Sephadex A-25). Cukry oznaczono
w postaci acetylowych pochodnych alditoli oraz trimetylosililowych pochodnych oksymów.
Dokonano optymalizacji parametrów prowadzenia obu reakcji derywatyzacji (czas reakcji,
temperatura). Dla obu opracowanych metod wyznaczono wybrane parametry walidacyjne.
Opracowane metody zastosowano do oznaczenia: L-ramnozy, D-ksylozy, 3-O-metylo-D-glukozy
i laktulozy w próbkach moczu pacjentów Oddziału Chirurgii Naczyniowej Akademii Medycznej
w Gdańsku.
33
ZASTOSOWANIE TECHNIK CHROMATOGRAFICZNYCH DO ANALIZY
SKŁADU LIPIDÓW POWIERZCHNIOWYCH BLATTA ORIENTALIS
Marek GOŁĘBIOWSKI1, Monika PASZKIEWICZ
1*, Agata SIKORA
1,
Emilia WŁÓKA2, Wioletta WIELOCH
2, Elżbieta PRZYBYSZ
3,
Mieczysława BOGUŚ2, Piotr STEPNOWSKI
1
/GC-MS/
1Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18, 80-952 Gdańsk,
2 Instytut Parazytologii, Polska Akademia Nauk, ul. Twarda 51/55, 00-818 Warszawa,
3 Instytut Przemysłu Organicznego, ul. Annopol 6, 03-236 Warszawa
*e-mail: [email protected]
Lipidy powierzchniowe i wewnętrzne znajdujące się na powierzchni owadów odgrywają
bardzo ważną rolę w prawidłowym ich funkcjonowaniu w środowisku naturalnym. Do zadań
lipidów kutikularnych należy przede wszystkim ochrona organizmów przed szkodliwym działaniem
czynników zewnętrznych, oraz nadmierną utratą wody. Umożliwiają one również owadom
komunikację z innymi osobnikami tego samego gatunku. Oprócz tego, lipidy powierzchniowe
mogą zapewniać ochronę przed infekcjami grzybowymi, czy bakteryjnymi. Określenie czy istnieje
korelacja pomiędzy składem lipidów powierzchniowych, a wrażliwością na infekcje grzybowe jest
niezwykle istotne. Zdefiniowanie składu lipidów powierzchniowych oraz określenie ich wpływu na
rozwój i patogeniczność grzybów entomopatogennych może mieć duże znaczenie praktyczne
i umożliwić w przyszłości opracowanie skutecznych metod ograniczania liczebności populacji
owadów szkodliwych.
Zastosowanie ekstrakcji oraz chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas
pozwoliło na analizę jakościową i ilościową składu lipidów powierzchniowych i wewnętrznych,
dorosłych owadów Blatta orientalis przed i po infekcji grzybowej. Owady Blatta orientalis zostały
poddane ekstrakcji eterem naftowym przez 60 s a następnie dichlorometanem przez 5 minut.
Otrzymane ekstrakty odparowano do sucha, a następnie poszczególne związki przeprowadzono
w pochodne (sililowanie, BSTFA TMCS, 99:1, 1 h, 100°C), aby można było je rozdzielić
i zidentyfikować przy pomocy techniki GC/MS.
Porównując zawartość alkanów u samic Blatta orientalis, wykazano, że w przypadku owadów
poddanych infekcji grzybowej, zawartość związków w lipidach powierzchniowych jest dwa razy
większa, niż u samic niezakażonych. Oprócz większej zawartości alkanów, samice po infekcji
zawierają również większą różnorodność tych związków pod względem jakościowym.
W ekstraktach stwierdzono obecność związków (hentriakontanu- C31H64 oraz oktakozanu- C28H58),
których nie zidentyfikowano w próbce otrzymanej po ekstrakcji samic zdrowych. U samic nie
poddanych infekcji, występuje natomiast większe stężenie pentakozanu, heksakozanu oraz
nonakozanu. Porównując zawartość kwasów tłuszczowych w lipidach powierzchniowych samic
Blatta orientalis, można zauważyć, że u samic po infekcji grzybowej większość związków
występuje w niskich stężeniach (wyjątek stanowi kwas C18:1). Jest ich również znacznie mniej pod
względem jakościowym - w lipidach powierzchniowych samic zdrowych zidentyfikowano aż 24
kwasy, a u samic zainfekowanych, jedynie 14. W badanych ekstraktach stwierdzono również
obecność estrów zawierających od 15 do 19 atomów węgla. W największym stężeniu związki te
występowały w ekstrakcie samic Blatta orientalis. W lipidach powierzchniowych badanego
gatunku owada zidentyfikowano również sterole oraz śladowe ilości alkoholi.
Badania zostały sfinansowane przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego, grant nr N N303 504238
34
NH
NO
O
PhH
H
OPTYMALIZACJA ROZDZIELANIA ENANCJOMERÓW ZWIĄZKÓW
POCHODNYCH 2,6-DIKETOPIPERAZYNY W CHROMATOGRAFII
CIECZOWEJ
Kamila SZWED1*
, Maciej DAWIDOWSKI
2 , Anna BIELEJEWSKA
1
1Instytut Chemii Fizycznej PAN, ul. Kasprzaka 44/52, 02-224 Warszawa,
2Uniwersytet Medyczny, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa
*e-mail: [email protected]
Cyklodekstryny są to cykliczne oligosacharydy zbudowane z pierścieni D-glukozowych,
połączonych między sobą mostkami tlenowymi -(1,4). Dzięki temu, że posiadają one
stereoselektywne zdolności inkludowania cząsteczek wykorzystuje się je m. in.
do chromatograficznego rozdzielania enancjomerów jako dodatek do fazy ruchomej [1].
-cyklodekstryna charakteryzuje się wysoką stereoselektywnością w porównaniu z i
-cyklodekstryną, jednak jej słaba rozpuszczalność ogranicza jej zastosowanie w HPLC. Jednym
ze sposobów zwiększenia rozpuszczalności -cyklodekstryna jest zastosowanie dodatku kwasu
winowego lub cytrynowego [2].
W niniejszej pracy podjęto próbę opracowania optymalnej metody rozdzielania
enancjomerów grupy związków pochodnych 2,6-diketopiperazyny (2,6-DKP) o stwierdzonym
działaniu przeciwdrgawkowym in vivo. Z dotychczasowych badań prowadzonych w tej grupie
związków wynika, iż ich aktywność farmakologiczna jest w dużej mierze zdeterminowana przez
chiralność [3].
CY-Z-SS CY-Z-RR
Rysunek 1. Wzory chemiczne pochodnych 2,6-diketopiperazyny (2,6-DKP).
W prezentowanej pracy badano zmianę retencji i enacjoselektywności pochodnych
2,6-diketopiperazyny pod wpływem zwiększenia stężenia -CD w obecności hydroksykwasów.
Użycie kwasu DL-winowego wpływa na wyraźną poprawę rozdziału chiralnego, podczas gdy
kwasy D, L-winowe zastosowane oddzielnie nie miały znaczącego wpływu
na rozdział enancjomerów. Dla kwasu cytrynowego uzyskano znaczne pogorszenie rozdziału
enancjomerów.
Badania częściowo wspierane przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju
Regionalnego, dzięki dotacji Innowacyjna Gospodarka (POIG.01.01.02-14-102/09).
Literatura:
1. Saenger W., Chem. Int. Ed. Engl., 1980, 19(5), 344-362.
2. Fenyvesi E., Vikmon M., Szeman J., Redenti E., Delcanale M., Ventura P., Szejtli M., J. Incl. Phenom.
Macro, 2007, 58, 227-235.
3. Kamiński K., Obniska A., J. Bioorg. Med. Chem., 2008, 16, 4921–4931.
NH
NO
O
PhH
H
35
CYKLICZNE SILILOWANIE ORAZ
TERT-BUTYLODIMETYLOSILILOWANIE JAKO TECHNIKA
DERYWATYZACJI β-BLOKERÓW, β-AGONISTÓW
ORAZ ANTYEPILEPTYKÓW
Magda CABAN*, Piotr STEPNOWSKI, Marek KWIATKOWSKI,
Natalia MIGOWSKA, Jolanta KUMIRSKA
/chromatografia gazowa z detekcją FID i MS/
Katedra Analizy Środowiska, Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19,
80-952 Gdańsk
*e-mail: [email protected]
Analityka polarnych związków w próbkach środowiskowych metodą chromatografii gazowej
związana jest z koniecznością chemicznej konwersji analitów do lotnych pochodnych. Dotychczas
najczęściej stosowane w tym celu były odczynniki trimetylosililujęce jak MSTFA (N-metylo-N-
(trimetylosililo)trifluoroacetamid) i BSTFA (N,O-bis(trimetylosililo)trifluoroacetamid). Warto
jednak zwrócić uwagę na odczynniki mniej popularne, które mogą zwiększyć selektywność
oznaczania. Dla przykładu CMDMSDEA ((chlorometylo)dimetylosililo-dietyloamina) jest
ciekawym odczynnikiem służącym do cyklicznej derywatyzacji leków z grupy β-blokerów i β-
agonistów. Widma mas uzyskane dla tego rodzaju pochodnych są bardzo charakterystyczne dla obu
grup leków a droga fragmentacji prosta do wyjaśnienia. Tert-butylodimetylosililowanie
z użyciem MTBSTFA jest z kolei ciekawą alternatywą dla derywatyzacji leków
antyepileptycznych. Część z nich posiada stosunkowo małe masy cząsteczkowe
i podstawienie dużego ugrupowania TBDMS do cząsteczki niweluje problem koelucji
z rozpuszczalnikiem. Zarówno w przypadku β-blokerów, β-agonistów jak
i antyepileptyków przy użyciu MTBSTFA obniża granicę wykrywalności przy detekcji FID
(większa ilość atomów węgla w podstawniku TBDMS w porównaniu z TMS) oraz rejestrowane są
bardzo charakterystyczne widma masowe. Uzyskane pochodne charakteryzują się również dużą
stabilnością hydrolityczną.
W niniejszej pracy przedstawiono wyniki analiz GC-FID oraz GC-MS trzech grup leków
z użyciem alternatywnych technik sililowania, tj. cyklicznego sililowania
(β-blokerów i β-agonistów) oraz tert-butylodimetylosililowania (β-blokerów, β-agonistów oraz
antyepileptyków). Określono aplikatywność tego rodzaju reakcji spochadniania do jakościowego
i ilościowego oznaczania wybranych farmaceutyków. Proces z użyciem MTBSTFA
zoptymalizowano pod kątem temperatury i czasu reakcji. Wybrano również odpowiednie medium
reakcyjne. Rozdziału i analizy pochodnych dokonano przy użyciu chromatografu gazowego
wyposażonego w kolumnę DB5 stosując detekcję FID oraz MS. Określono również granice
wykrywalności i porównano je z wcześniej uzyskanymi dla pochodnych TMS.
Praca finansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego, projekt badawczy numer N N204 260237
(2009-2012).
36
ZASTOSOWANE ZŁÓŻ EKSTARKCYJNYCH O CHARAKTERZE
POLIMERYCZNYM DO WYDZIELANIA LEKÓW
O WŁAŚCIWOŚCIACH ZASADOWYCH
Magda CABAN*, Piotr STEPNOWSKI, Marek KWIATKOWSKI,
Natalia MIGOWSKA, Jolanta KUMIRSKA
/chromatografia gazowa z detekcją FID i MS/
Katedra Analizy Środowiska, Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19,
80-952 Gdańsk
*e-mail: [email protected]
W ostatnich latach notuje się wzrost zużycia β-blokerów oraz β-agonistów. Obie te grupy
farmaceutyków służą do leczenia chorób cywilizacyjnych. Pierwsze mają szerokie zastosowanie
w leczeniu chorób układu krążenia, tj. chorobie wieńcowej, nadciśnieniu tętniczym i zaburzeniach
rytmu serca. Drugie są podawane przy nawracających napadach duszności do rozkurczania oskrzeli
w astmie oskrzelowej. Duża konsumpcja tych leków przekłada się na pojawienie się ich
pozostałości w wodach powierzchniowych oraz gruntowych. Ich obecność wykryto również
w wodach pitnych. Uzasadniona jest więc ocena ryzyka obecności wspomnianych farmaceutyków
w matrycach środowiskowych. Jednym z głównych elementów takiej oceny muszą być sprawne,
wiarygodne, powtarzalne i tanie metody analityczne umożliwiające oznaczanie tych związków
na możliwie niskich poziomach z uwzględnieniem złożoności matryc.
Jednym z najważniejszych etapów analizy śladowej jest proces ekstrakcji. Odpowiednie
zatężenie i oczyszczenie próbki zmniejsza późniejsze problemy analityczne. Proces ekstrakcji
powinien być zoptymalizowany w kierunku uzyskania jak największego odzysku analitów.
W przedstawionej pracy skupiono się nad doborem odpowiedniego złoża do ekstrakcji
do fazy stałej (SPE) sześciu β-blokerów i dwóch β-agonistów, posiadających właściwości
zasadowe. Wykorzystano złoża zbudowane z polimeru PS-DVB, w tym zmodyfikowane
ugrupowaniami polarnymi oraz działające na zasadzie wymieniaczy jonowych. Próbki poddano
derywatyzacji z użyciem BSTFA i analizowano za pomocą chromatografu gazowego z detekcją
FID. Określono rodzaj oddziaływań są kluczowych dla adsorpcji tego rodzaju analitów. W wyniku
porównania odzysków absolutnych wybrano najefektywniejszą kolumienkę ekstrakcyjną.
Praca finansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego, projekt badawczy numer N N204 260237
(2009-2012).
37
WYZNACZANIE IZOTERM ADSORPCJI JEDNOPIERŚCIENIOWYCH
WĘGLOWODORÓW AROMATYCZNYCH NA SORBENCIE
HALOIZYTOWYM METODĄ INWERSYJNEJ CHROMATOGRAFII
GAZOWEJ
Kamil CZECH1, Piotr M. SŁOMKIEWICZ
2
/inwersyjna chromatografia gazowa/
Zakład Fizyki Chemicznej, Instytut Chemii,
Uniwersytet Humanistyczno-Przyrodniczy Jana Kochanowskiego w Kielcach,
ul. Świętokrzyska 15G, 25-406 Kielce
Haloizyt jest krzemianem warstwowym, stosowanym do otrzymywania sorbentów
mineralnych. W odróżnieniu od pozostałych minerałów z grupy kaolinitu, charakteryzuje się
większą powierzchnią właściwą oraz większą zdolnością do wymiany jonów. Zbudowany jest
z płytek o powierzchni płaskiej i częściowo zwiniętej. Zbudowany jest z nanorurek o średnicy
kilkudziesięciu nanometrów i długości kilku mikrometrów. Ten minerał jest stosowany
do pochłaniania węglowodorów i ich pochodnych z powietrza.
W niniejszej pracy zbadano sorbent haloizytowy do pochłaniania jednopierścieniowych
węglowodorów aromatycznych. Haloizyt poddawano aktywacji kwasowej [1]. Izotermy adsorpcji
wyznaczono metodą profilu piku wykorzystując inwersyjną chromatografię gazową. Obliczenia
ciśnienia parcjalnego oraz ilości zaadsorbowanego węglowodoru wykonywano na podstawie
danych podziału profilu piku. Do obliczeń powierzchni adsorpcyjnej, powierzchni poszczególnych
segmentów piku adsorpcyjnego i czasu retencji zastosowano Pakiet Programów Komputerowych
[2]. Na podstawie wyznaczonych izoterm adsorpcji obliczono i zestawiono wartości stałych
równowagi adsorpcji.
Literatura:
[1] M.
Garnuszek, K. Czech, B. Szczepanik, P.M. Słomkiewicz
Adsorpcja 4-chloroaniliny
z fazy wodnej na sorbencie haloizytowym (w druku).
[2] K. Czech, P. M. Słomkiewicz, Zastosowanie pakietów oprogramowania komputerowego do wyznaczania
izoterm adsorpcji metoda inwersyjnej chromatografii gazowej (w druku).
Praca finansowana z projektu nr 6/1/821/POKL 2009 „Stypendia naukowe dla doktorantów kierunków
istotnych dla rozwoju regionu”
38
OZNACZANIE WYBRANYCH FARMACEUTYKÓW W PRÓBKACH
ŚRODOWISKOWYCH POBRANYCH Z REJONÓW PRZYBRZEŻNYCH
POŁUDNIOWEGO BAŁTYKU I WOJEWÓDZTWA POMORSKIEGO
PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI LC-MS/MS
Anna BIAŁK-BIELIŃSKA1, Marta BORECKA
1, Grzegorz SIEDLEWICZ
2,
Kinga KORNOWSKA3, Ksenia PAZDRO
2, Jolanta KUMIRSKA
1,
Piotr STEPNOWSKI1
1Katedra Analizy Środowiska, Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19,
80-952 Gdańsk, [email protected], 2Zakład Chemii i Biochemii Morza, Instytut Oceanologii Polskiej Akademii Nauk,
ul. Powstańców Warszawy 55, 81-712 Sopot, 3Zespół Pracowni Fizykochemicznych
, Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19,
80-952 Gdańsk
Od ponad 15 lat obszar chemii i ekotoksykologii środowiska coraz częściej obejmuje ocenę
obecności tak zwanych nowopojawiających się zanieczyszczeń organicznych (ang. new emergening
pollutants), które stanowią potencjalne zagrożenie zarówno dla całych ekosystemów jak
i bezpośrednio dla zdrowia człowieka. Do tego rodzaju zanieczyszczeń zaliczone zostały między
innymi pozostałości różnych klas farmaceutyków. Wśród wielu różnych grup środków leczniczych
największe zagrożenie niosą pozostałości leków o działaniu przeciwbakteryjnym, głównie
ze względu na możliwość przyczyniania się do niebezpiecznego zjawiska lekooporności. Mimo,
iż w chwili obecnej w wielu ośrodkach naukowych na całym świecie prowadzone są liczne badania
związane z analityką pozostałości tych związków w próbkach środowiskowych, a co za tym idzie
oceną narażenia na obecność tych związków, w Polsce w dalszym ciągu liczba informacji na ten
temat jest ograniczona. Dlatego też w ramach niniejszej pracy opracowane zostały nowe metodyki
analityczne oznaczania wybranych antybiotyków i chemioterapeutyków z grupy penicylin,
chinolonów, fluorochinolonów, sulfonamidów i innych w wybranych próbkach środowiskowych
pobranych na terenie naszego kraju. Do tego celu wykorzystano, najbardziej czułą i selektywną
metodę oznaczania pozostałości farmaceutyków w próbkach środowiskowych na bardzo niskich
poziomach stężeń rzędu kilku g/l lub ng/l – chromatografię cieczową sprzężoną z tandemową
spektrometrią mas (LC-MS/MS). Ponadto, w celu zwiększenia czułości, obniżenia granic
oznaczalności oraz skrócenia czasu analizy na etapie przygotowania próbek do analizy zastosowano
technikę ekstrakcji do fazy stałej (SPE). Badania obejmowały także: opracowanie metod
przygotowania próbek środowiskowych do analizy tych związków w różnych matrycach (wody
powierzchniowe, w tym wody morskie oraz gleby i osady morskie), ich optymalizację oraz
walidację. Za pomocą opracowanych metod przeprowadzone zostały pionierskie badania nad
obecnością pozostałości tych leków w wybranych próbkach środowiskowych pobranych z rejonów
przybrzeżnych południowego Bałtyku i województwa pomorskiego.
Praca naukowa współfinansowana ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego,
w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki, Priorytetu IV, projekt pt. „Program wdrożenia nowoczesnych
elementów kształcenia w Uniwersytecie Gdańskim”, Zadanie „Stypendia naukowe dla doktorantów szansą na rozwój gospodarki” oraz grantu MNiSW N N306 300536 (2009-2011).
39
ANALIZA JAKOŚCIOWA I ILOŚCIOWA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH,
ESTRÓW METYLOWYCH I ALKOHOLI CALLIPHORA VICINA
Z WYKORZYSTANIEM HPLC-LLSD I GC/MS
Marek GOŁĘBIOWSKI1*
, Monika PASZKIEWICZ1, Anna GRUBBA
1,
Mieczysława I. BOGUŚ2, Piotr STEPNOWSKI
1
/HPLC-LLSD i GC/MS/
1Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk,
2Instytut Parazytologii, Polska Akademia Nauk, ul. Twarda 51/55, 00-818 Warszawa,
*e-mail: [email protected]
W skład lipidów kutikularnych owadów często wchodzą nasycone i nienasycone kwasy
tłuszczowe, których zawartość w zależności od gatunku, waha się od kilku do kilkudziesięciu
procent. Różnice w ich zawartości mogą występować w zależności od stadium rozwojowego lub też
od płci owada. Estry metylowe kwasów karboksylowych w lipidach kutikularnych owadów
występują rzadko. Różnice w składzie jakościowym i ilościowym estrów występują w zależności
od stadium rozwojowego, a także między samcami i samicami. W skład lipidów kutikularnych
owadów wchodzą zarówno alkohole I-rzędowe jak i II-rzędowe. Alkohole I-rzędowe występujące
w lipidach kutikularnych owadów są zazwyczaj nasycone i nierozgałęzione o parzystej liczbie
atomów węgla.
Pierwszym etapem analiz lipidów wszystkich stadiów rozwojowych C. vicina była ekstrakcja
z wykorzystaniem eteru naftowego i dichlorometanu. W celu wyodrębnienia poszczególnych grup
lipidów obecnych we wszystkich stadiach rozwojowych C. vicina zastosowano HPLC
z aerozolowym detektorem promieniowania rozproszonego (laser light-scattering detector, LLSD).
Analizy HPLC zostały wykonane w normalnym układzie faz. Analizy jakościowe i ilościowe
kwasów tłuszczowych, estrów metylowych i alkoholi wykonano techniką GC/MS (TIC i SIM).
W lipidach kutikularnych larw C. vicina stwierdzono obecność 24 kwasów tłuszczowych od C8:0
do C24:0 oraz 4 estrów metylowych: C17:1, C17:0, C19:1 i C19:0. W lipidach larw, w przeciwieństwie
do pozostałych stadiów rozwojowych, nie zidentyfikowano alkoholi. W lipidach kutikularnych
poczwarek zidentyfikowano 31 kwasów tłuszczowych od C7:0 do C26:0, 6 alkoholi od C20:0 do C26:0
oraz 6 estrów metylowych: C15:0, C17:1, C17:0, C19:2, C19:1 i C19:0. Natomiast w lipidach kutikularnych
samic stwierdzono obecność 30 kwasów tłuszczowych od C7:0 do C26:0, 7 alkoholi od C14:0 do C26:0
oraz 8 estrów metylowych: C15:0, C16:0, C17:1, C17:0, C18:1, C19:2, C19:1 i C19:0. Lipidy kutikularne
samców zawierają 28 kwasów tłuszczowych od C7:0 do C26:0, 3 alkohole (C16:0, C24:0 i C26:0) oraz 9
estrów metylowych: C13:0, C15:0, C16:0, C17:1, C17:0, C18:1 , C19:2, C19:1, C19:0 i C21:0.
W lipidach wszystkich stadiów rozwojowych C. vicina w największych ilościach występują
nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe od C16:0 do C18:0. Pozostałe kwasy występują
w niewielkich ilościach. Charakterystyczna jest również obecność wielonienasyconych kwasów
tłuszczowych: C20:5, C20:4 , C20:3, C20:2, C20:1 i C20:0. Alkohole występujące w lipidach kutikularnych
C. vicina są nasycone i nierozgałęzione o parzystej liczbie atomów węgla. Tylko w lipidach
poczwarek występują dodatkowo dwa alkohole o nieparzystej liczbie atomów węgla (C23:0 i C25:0).
Estry metylowe kwasów karboksylowych zawierają nieparzystą liczbę atomów węgla,
a w największych ilościach występują nienasycone związki.
Badania zostały sfinansowane przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego, grant nr N N303 504238.
40
ZASTOSOWANIE GC/MS-SIM DO ANALIZY LIPIDÓW
KUTIKULARNYCH SARCOPHAGA CARNARIA
Marek GOŁĘBIOWSKI1*
, Monika PASZKIEWICZ1, Alma OLESZCZAK
1,
Mieczysława I. BOGUŚ2, Piotr STEPNOWSKI
1
/HPLC-LLSD, GC/MS-SIM/
1Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk,
2Instytut Parazytologii, Polska Akademia Nauk, ul. Twarda 51/55, 00-818 Warszawa,
*e-mail: [email protected]
Główną funkcją kutikularnych lipidów owadów jest zapobieganie przed utratą wody, a także
ochrona przed infekcją spowodowaną przez mikroorganizmy. Lipidy ułatwiają również chemiczną
komunikację. System rozpoznawania owadów umożliwia rozróżnienie własnego gatunku, rodziny
i płci przedstawicieli swojego gatunku oraz owadów innych gatunków. Ponadto, skład lipidów
kutikularnych wykorzystywany jest w chemotaksonomii. Z tych powodów analiza składu lipidów
kutikularnych owadów jest niesłychanie ważne. Analiza składu lipidów kutikularnych S. carnaria
może mieć duże znaczenie praktyczne i umożliwić w przyszłości opracowanie skutecznych metod
ograniczania liczebności populacji owadów szkodliwych za pomocą grzybów entomopatogennych
(np. poprzez dodawanie do preparatów zawierających zarodniki grzybów entomopatogennych
określonych związków, zidentyfikowanych w lipidach kutikularnych, zwiększających wirulencję
danego grzyba).
W celu wyodrębnienia poszczególnych grup lipidów obecnych we wszystkich stadiach
rozwojowych S. carnaria zastosowano HPLC z aerozolowym detektorem promieniowania
rozproszonego (LLSD). Do identyfikacji i analiz ilościowych lipidów S. carnaria zastosowano
chromatografię gazową połączoną ze spektrometrią mas (GC/MS). Identyfikacji poszczególnych
związków dokonano na podstawie widm mas, a także w wyniku detekcji na wybrany jon (SIM).
Charakterystyczne jony obecne na widmach mas estrów metylowych kwasów karboksylowych
są efektem przegrupowania McLafferty’ego. Identyfikacja estrów metylowych kwasów
karboksylowych odbyła się przy zastosowaniu detekcji na jon o m/z 87. Widma mas
trimetylosililowych pochodnych kwasów karboksylowych posiadają charakterystyczne jony o m/z
117, 129, 132, 145 oraz [M-15]+ i [M]
+.. W analizach GC/MS-SIM zastosowano detekcję na jon
o m/z 145 i jony molekularne, a w analizach trimetylosililowych pochodnych alkoholi zastosowano
detekcję na jon o m/z 103.
W lipidach kutikularnych S. carnaria zidentyfikowano 5 estrów metylowych kwasów
karboksylowych: C17:1, C17:0, C19:2, C19:1 i C19:0. W największych ilościach występuje ester
metylowy kwasu oktadekenowego. Stanowi on 72,2%, 59,9% i 42,1% sumy estrów w lipidach
odpowiednio: poczwarek, samców i samic. Lipidy larw zawierają jedynie 3 estry metylowe
występujące w ilościach śladowych (C17:0, C19:1 i C19:0).
Lipidy kutikularne posiadają 28 kwasów tłuszczowych od C7:0 do C26:0. W największych ilościach
występuje kwas oktadekenowy (40,4%, 41,5%, 41,2% i 39,6% sumy kwasów kutikularnych
odpowiednio: larw, poczwarek, samców i samic). W dużych ilościach występują także kwas
heksadekanowy, heksadekenowy i oktadekanowy. Lipidy kutikularne samców i samic zawierają
również kwasy wielonienasycone: eikozapentaenowy i eikozatetraenowy. Ich zawartość stanowi
około 1% sumy wszystkich kwasów tłuszczowych.
W lipidach kutikularnych S. carnaria stwierdzono obecność 9 alkoholi od C12:0 do C28:0, w tym 5
alkoholi w lipidach larw i samic oraz 8 alkoholi w lipidach poczwarek i samców. Wszystkie
zidentyfikowane alkohole są nasycone i posiadają parzystą liczbę atomów węgla. W największych
ilościach występuje oktadekanol (larwy), heksadekanol (poczwarki), dokozanol (samce) i eikozanol
(samice).
Badania zostały sfinansowane przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego, grant nr N N303 504238.
41
OPTYMALIZACJA WARUNKÓW ROZDZIELANIA
CHROMATOGRAFICZNEGO MIESZANIN POLISACHARYDÓW
WYIZOLOWANYCH ZE ŚCIANY KOMÓRKOWEJ RÓŻNYCH
SZCZEPÓW BAKTERII Z RODZAJU ENTEROCOCCUS
Anna BYCHOWSKA1, Małgorzata CZERWICKA
1, Kinga MARSZEWSKA
1,
Zbigniew MAĆKIEWICZ2, Piotr STEPNOWSKI
1, Zbigniew KACZYŃSKI
1
/sączenie molekularne, preparatywna chromatografia jonowymienna/
1Wydział Chemii, Katedra Analizy Środowiska, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19,
80-952 Gdańsk, [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected] 2Wydział Chemii, Zakład Chemii Polipeptydów, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19,
80-952 Gdańsk, [email protected]
Bakterie z rodzaju Enterococcus to Gram-dodatnie paciorkowce [1]. Stanowią one znaczną
część mikroflory fizjologicznej przewodu pokarmowego oraz dróg moczowo-płciowych człowieka.
Do późnych lat 70-tych XX wieku bakterie te uznawane były za tzw. patogeny oportunistyczne
o znikomej szkodliwości [2]. Obecnie enterokoki zajmują jedno z czołowych miejsc w rankingu
najniebezpieczniejszych patogenów szpitalnych, będących przyczyną szczególnie trudnych
w leczeniu zakażeń [3]. Największy udział w wywoływaniu tego typu schorzeń mają
w szczególności dwa gatunki opisywanych drobnoustrojów: Enterococcus faecalis (około 80-90%
przypadków) oraz Enterococcus faecium (5-15% przypadków). Leczenie infekcji wywoływanych
przez te bakterie jest bardzo trudne, ponieważ enterokoki wykazują oporność na wiele
antybiotyków i chemioterapeutyków, takich jak: penicyliny, cefalosporyny, aminoglikozydy,
linkozamidy, czy też uważane za tzw. antybiotyki ostatniej szansy – wankomycynę i teikoplaninę.
Najlepszym sposobem zapobiegania schorzeń wywoływanych przez te patogeny są odpowiednie
szczepionki. Do ich opracowania niezbędne jest wykorzystanie zdefiniowanych strukturalnie
polisacharydowych antygenów, wyizolowanych ze ściany komórkowej tych bakterii.
W prezentowanym komunikacie przedstawiono etapy procesu wyodrębniania
polisacharydowych składników ściany komórkowej różnych szczepów bakterii z rodzaju
Enterococcus. W tym celu materiał bakteryjny w pierwszej kolejności poddano trawieniu
enzymatycznemu (lizozym, mutanolizyna, DNA-za, RNA-za, proteinaza K), a następnie otrzymaną
mieszaninę polisacharydów rozdzielano przy pomocy sączenia molekularnego testując różne
rodzaje złóż (Bio-Gel P-100, Sephacryl S-200) oraz różne układy faz ruchomych (woda
dejonizowana, octan amonu, węglan amonu). Procesy frakcjonowania monitorowano poprzez
zastosowanie detekcji refraktometrycznej lub wykonanie testów na obecność reszt cukrowych
i grup fosforanowych. Na podstawie uzyskanych chromatogramów wyodrębniono kilka frakcji, dla
których zarejestrowano widma protonowe techniką magnetycznego rezonansu jądrowego
(1H-NMR). Analiza widm protonowych pozwoliła wyselekcjonować kilka frakcji, które
po oczyszczeniu przy użyciu preparatywnej chromatografii jonowymiennej na anionicie
Q-Sepharose wykorzystano do analiz strukturalnych.
[1] Murray B. B. Clinical Microbiology Reviews, (1990), 3, 46-65.
[2] Murray B.E. The New England Journal of Medicine, (2000), 342, 710-721.
[3] Mascini E.M. Clin. Microbiol. Infect., (2005), 11, 43-56.
Badania finansowane w ramach grantu dla Młodych Doktorantów Wydziału Chemii Uniwersytetu Gdańskiego
Nr 538-8200-0496-1.
42
DETERMINATION OF BISPHENOL A AND RELATED EDCs COMPOUNDS
IN MILK USING micro-TLC AND TEMPERATURE-DEPENDENT
INCLUSION CHROMATOGRAPHY
Paweł K. ZARZYCKIa, Elżbieta WŁODARCZYK
a, Deborah HODGSON
b,
Vicki L. CLIFTONc
/Stosowana w pracy technika rozdzielania: micro-TLC, HPLC/
aSection of Toxicology and Bioanalytics, Department of Civil and Environmental Engineering, Koszalin
University of Technology, Śniadeckich 2,75-453 Koszalin, Poland, bSchool of Psychology, Faculty Science and IT, The University of Newcastle, Callaghan,
NSW 2308, Australia, cThe Robinson Institute, School of Paediatrics and Reproductive Health, Lyell MCEwin Hospital, University of
Adelaide, Haydown Rd, Elizabethvale 5112 SA, Australia
This research communication summarizes the results of our preliminary work concerning
optimization of simple analytical protocol for fast screening of bisphenol A and related endocrine
disrupting compounds (EDCs), which are present in milk samples. Particularly, we adapted a solid-
phase extraction (SPE) protocol that has previously been used by our group for quantification of
wide range of low-molecular mass substances, mainly steroids, from highly organic compounds
loaded materials like cord blood or untreated/treated sewage waters [1-3]. In present work we tested
if proposed SPE protocol can be effective for purification of fresh human and/or UHT milk matrices
as well as quantification of bisphenol A. Resulted extracts were separated using planar and column
isocratic systems working with UV-Vis, fluorescence and PMA detection. Particularly, we tested
micro-TLC platform [4] involving HPTLC RP18W plates and binary water/organic and
organic/organic mobile phases (Figure 1). It should be noted that contrary to column
chromatography and due to planar chromatography method principles, all sample components
including substances that are strongly retarded or chemisorbed by stationary phase on the start line,
can be visualized after plate development. This approach allows fast fractionation and detection of
main milk components for the future chemometric investigations, together with data generated by
the column technique (HPLC). Temperature-dependent inclusion chromatography involving C-18
HPLC analytical column was optimized for quantification of bisphenol A and for fingerprinting of
wide range of chemicals with polarity ranging from estetrol to progesterone. It has been found that
such isocratic separation using -cyclodextrin modified mobile phase and UV-DAD detection can
be simple methodology allowing sensitive determination of bisphenol A from different milk
matrices. Due to the low consumption of the mobile phase components for micro-TLC and
application of rich in water HPLC eluent, both described chromatographic techniques can be
considered as environmentally friendly and green chemistry analytical tools.
Figure 1. Fractionation of milk SPE extracts using different micro-TLC separation and detection conditions.
References:
[1] P.K. Zarzycki, K.M. Kulhanek, R. Smith, V.L. Clifton, Determination of steroids in human plasma using
temperature-dependent inclusion chromatography for metabolomic investigations, J. Chromatogr. A, 1104 (2006) 203-
208. [2] V. L. Clifton, A. Bisits, P.K. Zarzycki. Characterization of human fetal cord blood steroid profiles in relation to
fetal sex and mode of delivery using temperature-dependent inclusion chromatography and principal component
analysis (PCA), J. Chromatogr. B, 855(2) (2007) 249-254. [3] P.K. Zarzycki, E. Włodarczyk, M.J. Baran,
Determination of endocrine disrupting compounds using temperature-dependent inclusion chromatography I.
Optimization of separation protocol, J. Chromatogr. A, 1216 (2009) 7602-7611. [4] P.K. Zarzycki, Simple horizontal
chamber for thermostated micro-thin-layer chromatography, J. Chromatogr. A, 1187 (2008) 250-259.
43
SILILOWANIE JAKO UNIWERSALNA TECHNIKA DERYWATYZACJI
FARMACEUTYKÓW W ANALIZIE GC I GC-MS
Jolanta KUMIRSKA*, Natalia MIGOWSKA, Magda CABAN,
Paulina ŁUKASZEWICZ, Anna BIAŁK-BIELIŃSKA,
Małgorzata CZERWICKA, Piotr STEPNOWSKI
/chromatografia gazowa z detekcją FID i MS/
Katedra Analizy Środowiska, Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19,
80-952 Gdańsk, *e-mail: [email protected]
Leki tworzą różnorodną grupę analitów o odmiennej i często skomplikowanej budowie
chemicznej. Ich analiza techniką GC jest możliwa najczęściej dopiero po przeprowadzaniu ich
w lotne i termicznie stabilne pochodne. Derywatyzację stosuję się ponadto by poprawić
selektywność, czułość i sprawność układu chromatograficznego. Obecność w ich strukturze wielu
grup funkcyjnych sprawia, iż poszukuje się uniwersalnych i stosunkowo tanich odczynników
derywatyzujących umożliwiających równoczesną analizę jak największej liczby substancji
pochodzących z różnych klas leków. Do takich reagentów zaliczane są odczynniki sililujące,
których działanie polega na zastąpieniu aktywnego atomu wodoru w grupach funkcyjnych: -OH, -
NH2, -NHR, -SH, -COOH, -POH, -SOH, -NOH, -BOH, -CONH2, grupą trimetylosililową (TMS)
lub rzadziej grupą tert-butylodimetylosililową (t-BDMS). W ramach niniejszej pracy sprawdzano
użyteczność następujących odczynników sililujących jako potencjalnych odczynników
derywatyzujących: N,O-bis(trimetylosililo)trifluoroacetamidu (MSTFA), mieszaniny 99% N,O-
bis(trimetylosililo)trifluoroacetamidu (BSTFA) i 1% trimetylochlorosilanu (TMCS) i N-
trimetylosililoimidazolu (TMSI) do derywatyzacji leków pochodzących sześciu klas
farmaceutyków: niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ), hormonów estrogennych,
antydepresantów, antyepileptyków, β-blokerów i β-aderenomimetyków. Proces optymalizowano
pod kątem temperatury i czasu reakcji. Sprawdzano wpływ obecności rozpuszczalników
organicznych (pirydyny i octanu etylu) na wydajność derywatyzacji. Analizę chromatograficzną
przeprowadzono przy użyciu chromatografu gazowego wyposażonego w kolumnę DB5 stosując
detekcję FID oraz MS. Rodzaj tworzących się pochodnych oceniano na podstawie czasu retencji
i analizy widm mas, natomiast wydajność reakcji poprzez wyznaczenie współczynnika odpowiedzi
analitu względem wzorca wewnętrznego nieulegającego procesowi spochadniania. Za optymalne
warunki sililowania uznano stosowanie mieszaniny 99% BSTFA + 1% TMCS, użycie jako
rozpuszczalnika mieszaniny pirydyna/octan etylu (1:1, v/v) oraz przeprowadzenie reakcji
w temperaturze 60°C w ciągu 30 minut.
Praca finansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego w ramach projektu badawczego numer N N204
260237 (2009-2012).
44
ZASTOSOWANIE DETEKTORA AZOTOWO-FOSFOROWEGO (NPD) DO
OZNACZANIA FARMACEUTYKÓW TECHNIKĄ GC
Jolanta KUMIRSKA1*
, Natalia MIGOWSKA1, Magda CABAN
1,
Mirko WEINHOLD2, Anna BIAŁK-BIELIŃSKA
1, Jorg TÖMING
2,
Piotr STEPNOWSKI1
/chromatografia gazowa z detekcją NPD/
1Katedra Analizy Środowiska, Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19
80-952 Gdańsk, *e-mail: [email protected]
2UFT - Centre for Environmental Research and Sustainable Technology, University of Bremen
Leobener Straße UFT, D-28359 Bremen, Germany
Coraz większa produkcja środków farmaceutycznych oraz związane z nią spożycie leków,
spowodowało wzmożone zainteresowanie ich losami po przedostaniu się do środowiska
naturalnego. Pomimo, iż trwają intensywne badania dotyczących losu farmaceutyków i ich wpływu
na środowisko wiele pytań pozostaje wciąż bez odpowiedzi. Analizy te wymagają stosowania
czułych i wiarygodnych metod analitycznych, które pozwalałyby na oznaczanie analitów
na poziomie ng lub μg na litr lub kilogram. Jednym ze sposobów zwiększenia czułości metod
chromatografii gazowej jest zastosowanie detektora azotowo-fosforowego (NPD), reagującego
znacznie silniej na obecność związków zawierających w swojej budowie atomy azotu lub fosforu.
W ramach niniejszej pracy testowano użyteczność detektora NPD do oznaczania leków
pochodzących z pięciu klas leków: β-blokerów, β-agonistów, środków przeciwdepresyjnych,
antyepileptyków i niesteroidowych leków przeciwzapalnych. Wybrane farmaceutyki należą
do grupy najczęściej wykrywanych leków w matrycach środowiskowych, których obecność
stwierdzono w nie tylko w ściekach, ale też wodach powierzchniowych, wodach gruntowych,
wodzie pitnej, a także glebie i osadach. Z uwagi na charakter polarny (poza antydepresantami)
przed analizą techniką GC anality poddawane były derywatyzacji z użyciem N,O-bis-
(trimetylosililo)trifluoroacetamidu (BSTFA) z 1% dodatkiem trimetylochlorosilanu (TMCS).
Oceniano czy możliwa jest zmiana sposobu detekcji z FID na NPD, czy zwiększy się czułość
metody oraz czy będą one miały nadal charakter liniowy. Szczególną uwagę zwrócono na analizę β-
blokerów, β-agonistów i antydepresantów. Derywatyzacji poddano szereg próbek różniących się
stężeniem, powtarzając każdą analizę 5-krotnie. Uzyskane wyniki posłużyły do określenia takich
parametrów walidacyjnych jak liniowość, powtarzalność, dokładność, granica wykrywalności
i granica oznaczalności. Rezultaty tych badań zostaną przedstawione i szczegółowo omówione.
Praca finansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego w ramach projektu badawczego numer N N204
260237 (2009-2012).
45
WYKORZYSTANIE TECHNIK CHROMATOGRAFICZNYCH
DO WYODRĘBNIANIA I ANALIZY STRUKTURALNEJ
POLISACHARYDOWYCH SKŁADNIKÓW ŚCIANY KOMÓRKOWEJ
BAKTERII ENTEROCOCCUS FAECIUM
Zbigniew KACZYŃSKI*, Anna BYCHOWSKA, Małgorzata CZERWICKA,
Kinga MARSZEWSKA, Piotr STEPNOWSKI
/sączenie molekularne, chromatografia gazowa/
Katedra Analizy Środowiska, Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19,
80-952 Gdańsk, *e-mail: [email protected]
Bakterie z rodzaju Enterococcus stanowią naturalną jelitową florę bakteryjną każdego
człowieka. W ciągu ostatnich 20 lat drobnoustroje te stały się jednym z wiodących czynników
zakażeń szpitalnych, wywołujących m.in. zakażenia układu moczowego, zapalenie wsierdzia,
zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, czy też bardzo niebezpieczne zakażenia krwi (posocznice).
Leczenie tych infekcji jest bardzo skomplikowane, gdyż enterokoki wykazują silną oporność
na szereg antybiotyków, w tym również na tzw. antybiotyki ostatniej szansy – wankomycynę
i teikoplaninę.
W obliczu wciąż narastającego zagrożenia ze strony omawianych bakterii oraz mało
skutecznej terapii antybiotykowej zaistniała konieczność opracowania szczepionki przeciwko tym
patogenom. Doniesienia naukowe pokazują, że większość skutecznie działających szczepionek
wykorzystywanych w zwalczaniu różnych zakażeń bakteryjnych otrzymano w oparciu o ich
polisacharydowe składniki ściany komórkowej. W celu opracowania szczepionek przeciwko
enterokokom niezbędne jest wyizolowanie i określenie struktury chemicznej w/w polisacharydów.
W badaniach tych z kolei wysoce użyteczne są różnego rodzaju techniki chromatograficzne, takie
jak sączenie molekularne i chromatografia gazowa.
W prezentowanym komunikacie przedstawiono etapy procesu wyodrębniania i analizy
strukturalnej polisacharydowych składników ściany komórkowej bakterii Enterococcus faecium,
szczepu U0317. Komórki bakteryjne poddano trawieniu enzymatycznemu (lizozym, mutanolizyna,
DNA-za, RNA-za, proteinaza K), a wyodrębnioną mieszaninę polisacharydów rozdzielano przy
pomocy sączenia molekularnego na złożu Bio-Gel P-100. Na podstawie uzyskanego
chromatogramu wyodrębniono kilka frakcji polisacharydowych, dla których zarejestrowano widma
1H-NMR (magnetyczny rezonans jądrowy). W oparciu o uzyskane widma wyselekcjonowano
materiał, dla którego przeprowadzono badania strukturalne. W celu określania struktury chemicznej
wyizolowanego polisacharydu wykorzystano: GC-FID, GC-MS oraz NMR.
46
WYKORZYSTANIE TECHNIK CHROMATOGRAFICZNYCH DO
OKREŚLENIA SKŁADU CUKROWEGO O-POLISACHARYDÓW
WYODRĘBNIONYCH Z WYBRANYCH SZCZEPÓW BAKTERII RODZAJU
CRONOBACTER
Kinga MARSZEWSKA1*
, Małgorzata CZERWICKA1, Anna BYCHOWSKA
1,
Jadwiga WIŚNIEWSKA1, Janusz RAK
2, Piotr STEPNOWSKI
1,
Zbigniew KACZYŃSKI1
/chromatografia żelowa, chromatografia gazowa/
1Wydział Chemii, Katedra Analizy Środowiska, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19,
80-952 Gdańsk, *e-mail: [email protected],
2Wydział Chemii, Zakład Teoretycznej Chemii Fizycznej, Uniwersytet Gdański,
ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk
Bakterie z rodzaju Cronobacter są Gram-ujemnymi pałeczkami powszechnie występującymi
w środowisku naturalnym. Izolowano je z najróżniejszych próbek w tym z odżywek dla niemowląt.
Występowanie tych mikroorganizmów w produktach przeznaczonych do konsumpcji dla niemowląt
może stanowić potencjalne źródło zakażeń, a wywołane przez te organizmy choroby
(m. in. zapalenie opon mózgowych, posocznica) mają ciężki przebieg i w konsekwencji mogą
kończyć się śmiercią, w szczególności gdy narażone na nie są wcześniaki [1]. Rodzaj ten zawiera
pięć gatunków: C. sakazakii, C. malonaticus, C. turicensis, C. muytjensii, C. dublinensis. Podziału
tego dokonano na podstawie badań genetycznych nad Enterobacter sakazakii w 2007 roku [2].
Z uwagi na skutki jakie mogą wywoływać zakażenia tymi organizmami, ważnym jest dokładne
poznanie mechanizmu patogenezy tych drobnoustrojów. Pomocne w tym może okazać się ustalenie
budowy powtarzalnej jednostki O-polisacharydów (OPS-ów) izolowanych z ich ściany komórkowej
oraz porównanie tych struktur w obrębie gatunków i szczepów. O-polisacharydy stanowią swoistą
i unikatową część zewnętrznej błony bakterii Gram-ujemnych, tym samym poznanie ich budowy
może przyczynić się do stworzenia podziału chemotaksonomicznego, a w przyszłości stanowić bazę
wyjściową dla stworzenia szybkich testów immunologicznych.
Analizę składu cukrowego O-polisacharydów przeprowadzono dla czterech wybranych
szczepów: C. turicensis NTU 57, C. malonaticus NTU 33, C. sakazakii NTU 696, C. sakazakii
NTU 767. W przypadku wszystkich przedstawionych szczepów bakteryjnych schemat
postępowania był następujący: wytrącony ze ściany komórkowej kompleks lipidowo-
polisacharydowy (LPS) poddano hydrolizie z użyciem roztworu 1% kwasu octowego, po usunięciu
części lipidowej, supernatant zawierający poli- i oligosacharydy poddano rozdziałowi
z wykorzystaniem sączenia molekularnego. Dla wyselekcjonowanych frakcji wykonano analizy
z wykorzystaniem techniki magnetycznego rezonansu jądrowego 1H NMR. Rodzaj i ilość
monosacharydów wchodzących w skład jednostek powtarzalnych OPS-ów ustalono na podstawie
analiz odpowiednich acetylowych pochodnych alditoli z wykorzystaniem techniki chromatografii
gazowej (GC) oraz chromatografii gazowej połączonej ze spektrometrią mas (GC-MS).
Literatura:
[1] J.M. Farber, S.J. Forsythe, Emerging issues in food safety Enterobacter sakazakii, ASM PRESS, Washington, D.C.,
2008.
[2] Iversen C, Lehner A, Mullane N, et al.. The taxonomy of Enterobacter sakazakii: proposal of a new genus
Cronobacter gen. nov. and descriptions of Cronobacter sakazakii comb. nov. Cronobacter sakazakii subsp. sakazakii,
comb. nov., Cronobacter sakazakii subsp. malonaticus subsp. nov., Cronobacter turicensis sp. nov., Cronobacter
muytjensii sp. nov., Cronobacter dublinensis sp. nov. and Cronobacter genomospecies 1. BMC Evol Biol 7: 64, 2007.
47
ANALIZA CHROMATOGRAFICZNA WOSKÓW
POWIERZCHNIOWYCH
Beata SZAFRANEK*, Elżbieta SYNAK, Piotr STEPNOWSKI
/HPLC, GC/
Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii, Katedra Analizy Środowiska,
ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk,
*e-mail: [email protected]
Na powierzchni liści i łodyg wszystkich roślin wyższych znajduje się warstwa wosku
powierzchniowego (epikutykularnego). Warstwa wosku oddziela roślinę od jej środowiska
i umożliwia egzystencję w niesprzyjających warunkach (ogranicza niekontrolowaną utratę wody
poprzez parowanie, zapobiega infekcjom grzybowym i bakteryjnym, bierze udział
w oddziaływaniach roślina-owad). Woski powierzchniowe roślin są skomplikowanymi
mieszaninami relatywnie niepolarnych związków alifatycznych oraz cyklicznych. Skład chemiczny
wosków zależy przede wszystkim od gatunku rośliny. Analiza składu chemicznego wosków jest
wykonywana zwykle metodą chromatografii gazowej (GC/FID oraz GC/MS) po wstępnej separacji
składników za pomocą niskociśnieniowej chromatografii cieczowej. Celem pracy było
zastosowanie chromatografii cieczowej z detektorem promieniowania rozproszonego (HPLC/LSD)
do separacji i analizy wosków powierzchniowych. Zastosowanie detektora LSD umożliwia
identyfikację grupową składników wosków powierzchniowych roślin (tzw. analiza grupowa).
Poszczególne grupy związków mogą być następnie kolekcjonowane do dalszych analiz GC/FID
i GC/MS.
48
WPŁYW POŁOŻENIA PODSTAWNIKA NA ADSORPCJĘ Z FAZY WODNEJ
CHLOROPOCHODNYCH ANILINY NA SORBENTACH
HALOIZYTOWYCH
Magdalena GARNUSZEK1,2
, Beata SZCZEPANIK1,2
, Piotr SŁOMKIEWICZ1,2
,
Bożena SYZDÓŁ1,2
1Instytut Chemii, Uniwersytet Humanistyczno-Przyrodniczy Jana Kochanowskiego,
ul. Świętokrzyska 15G, 25-406 Kielce, 2Laboratorium Badań Strukturalnych, Uniwersytet Humanistyczno-Przyrodniczy
Jana Kochanowskiego, ul. Świętokrzyska 15G, 25-406 Kielce,
[email protected], [email protected], [email protected]
Pochodne chlorowe aniliny znajdują zastosowanie w produkcji leków,
barwników, tworzyw sztucznych, środków zapachowych oraz środków
ochrony roślin. Chloroaniliny oraz produkty ich rozpadu ulegają
akumulacji w glebie i wodzie, co jest szkodliwe dla środowiska oraz
człowieka ze względu na ich trwałość oraz toksyczność [1].
Rys. 1. p – Chloroanilina.
Haloizyt o wzorze ogólnym Al4[Si4O10](OH)8•10H2O charakteryzuje się
wysoką odpornością chemiczną w szerokim zakresie pH, dużą
powierzchnią właściwą (60-500 m2/g w zależności od sposobu
przetwarzania) oraz dużą jonowymiennością, co czyni go przydatnym
do usuwania toksycznych substancji z wody oraz gleby. Ze względu na
dostępność i stosunkowo niski koszt produkcji, modyfikowany minerał
może być wykorzystany do usuwania m. in. takich związków jak
chloroaniliny z powodzeniem jako konkurencyjny w stosunku do
innych dostępnych na rynku sorbentów [2].
Rys. 2. Haloizyt aktywowany
60% m/m roztworem H2SO4.
Przeprowadzono badania adsorpcji z fazy wodnej o-, m-, p-chloroaniliny oraz
2,6-dichloroaniliny na haloizycie aktywowanym jednokrotnie 10%, 60% oraz dwukrotnie 10%
i 60% m/m roztworem kwasu siarkowego (VI) w układzie przepływowym. Stwierdzono, że
najlepsze właściwości sorpcyjne wykazuje haloizyt aktywowany jednokrotnie 60% m/m roztworem
kwasu siarkowego (VI). Położenia podstawnika chlorowego wywiera wpływ na sorpcję badanych
amin. Najlepsze wyniki uzyskuje się dla izomerów para- i meta-, natomiast w przypadku
pochodnych z podstawnikiem w położeniu orto- (o- oraz 2,6-dichloroanilina) stopień adsorpcji
wyraźnie się obniża.
Literatura:
[1] Zhang T., Ren H.-F., Liu Y., Zhu B.-L., Liu Z.-P., A novel degradation pathway of
chloroaniline In Diaphorobacter sp. PCA 039 entails initial hydroxylation, World J. Microbiol.
Biotechnol., (2010) 26: 665 -673.
[2] Kuczyńska H., Kamińska – Tarnawska E., Sołtys J., Kopalina z pokładów „Dunino” jako
nanosurowiec do otrzymywania farb, Przemysł chemiczny, 90/1 (2011).
49
ZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII W ANALIZIE STRUKTURY
O-POLISACHARYDÓW BAKTERII PECTOBACTERIUM ATROSPETICUM
Małgorzata CZERWICKA*, Jolanta KUMIRSKA, Jerzy GAJDUS,
Anna BYCHOWSKA, Kinga MARSZEWSKA, Jadwiga WIŚNIEWSKA,
Piotr STEPNOWSKI, Zbigniew KACZYŃSKI
/sączenie molekularne, chromatografia gazowa/
Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk
*e-mail: [email protected]
Bakterie należące do rodzaju Pectobacterium atakują ważne z gospodarczego punktu
widzenia gatunki roślin takie jak: ziemniaki, trzcina cukrowa, marchew, pomidory, ananasy oraz
niektóre rośliny ozdobne. Bakterie gatunku Pectobacterium atrosepticum związane są głównie z
infekcjami ziemniaków. Powodują one więdnięcie i żółknięcie całej rośliny bądź tylko podstawy
łodygi tzw. czarna nóżka, a także gnicie sadzeniaków podczas ich przechowywania. Gatunek
Pectobacterium atrosepticum po raz pierwszy został opisany w 1902 roku przez van Hall’a jako
Bacillus atrosepticus. W literaturze najdłużej był opisywany jako podgatunek Erwinia carotovora
subsp. atroseptica. Już w 1945 roku zaproponowano zaklasyfikowanie tych pektynolitycznych
Gram-ujemnych bakterii do nowego rodzaju Pectobacterium. Propozycja ta jednak została
zaakceptowana dopiero pod koniec lat 90-tych ubiegłego wieku. Trudności z identyfikacją
i klasyfikacją baterii rodzaju Pectobacterium, świadczą o występowaniu w tej grupie dużej
heterogenności, a obowiązujący w tej chwili podział taksonomiczny z całą pewnością nie jest
ostateczny. W diagnostyce oraz identyfikacji gatunków i podgatunków bakterii rodzaju
Pectobacterium nie wykorzystano dotychczas pełnej struktury antygenów O-polisacharydowych.
Określenie struktury pierwszorzędowej powtarzalnych jednostek polisacharydowych antygenów
bakteryjnych jest procesem praco- i czasochłonnym, w którym istotną rolę odgrywają techniki
chromatograficzne.
Z trzech wybranych szczepów bakteryjnych (Pectobacterium atrosepticum SCRI 1039,
Pectobacterium atrosepticum SCRI 1043, Pectobacterium atrosepticum SCRI 1055) wyodrębniono
i oczyszczono O-polisacharydy (OPS-y). W tym celu wykonano ekstrakcję suchej masy bakteryjnej
z zastosowaniem różnych metod (np. w układzie fenol-woda, fenol-chloroform-eter naftowy),
usunięto kwasy nukleinowe, wyizolowano lipopolisacharydy, które następnie poddano hydrolizie
i po usunięciu lipidu A wydzielono frakcje polisacharydowe z zastosowaniem metody sączenia
molekularnego (GPC - gel permeation chromatography). Następnie zidentyfikowano wchodzące
w skład OPS-ów reszty cukrowe, określono konfiguracje anomerycznych atomów węgla, wielkości
pierścieni cukrowych, przynależność do szeregu konfiguracyjnego D lub L, sposób i kolejność
powiązania reszt cukrowych oraz rodzaj i miejsce występowania podstawników niecukrowych.
W tym celu skorzystano z klasycznych metod chemicznych takich jak: analiza cukrowa, analiza
metylacyjna (metody: Ciukanu-Kerek’a i Hakomori), reakcja z optycznie czynnym (S)-(+)-butan-2-
olem, de-O-acetylacja. Uzyskane w wyniku powyższych reakcji chemicznych produkty poddano
analizie jakościowej i ilościowej z wykorzystaniem techniki chromatografii gazowej
oraz chromatografii gazowej połączonej ze spektrometrią mas. Dla otrzymanych O-polisacharydów
wykonano pełną interpretację zarówno widm jednowymiarowych 1H i
13C NMR,
jak i dwuwymiarowych homokorelacyjnych COSY, TOCSY, NOESY oraz heterokorelacyjnych:
HSQC, HMBC i HMQC-TOCSY. Wyniki uzyskane metodami chemicznymi oraz analiza kompletu
widm NMR były podstawą do określenia I-rzędowej struktury wszystkich wyodrębnionych antygenów
powierzchniowych.
50
METODYKA ROZDZIELANIA, IDENTYFIKACJI I OZNACZANIA
KUMARYNY W NAPOJACH ALKOHOLOWYCH ORAZ MACERATACH Z
TURÓWKI WONNEJ - WYKORZYSTANIE ODWRÓCONYCH UKŁADÓW
FAZ, DETEKCJI UV/DAD I PRZEPŁYWU ZWROTNEGO W KOLUMNIE
Anita SKRZYPCZAK1, Marian KAMIŃSKI
1*
1Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska,
ul. G. Narutowicza 11/12 80-233 Gdańsk
*e-mail: [email protected]
Kumaryna (1,2-benzopiron) jest naturalną substancją, posiadającą szczególne właściwości
aromatyczne. Występuje m.in. w roślinach stosowanych jako dodatki smakowe i aromatyczne
do napojów alkoholowych. Bywa też dodawana do niektórych innych produktów spożywczych,
w tym, do napojów bezalkoholowych. W wyniku doniesień o toksyczności kumaryny, ograniczono
dopuszczalne jej zawartości w żywności i napojach. Maksymalny poziom zawartości kumaryny,
bezpieczny dla ludzi w żywności i napojach bezalkoholowych, wynosi 2 mg/kg, a w napojach
alkoholowych - 10 mg/kg. Stąd, niezwykle ważne jest dysponowanie łatwą metodyką oznaczania
zawartości kumaryny, zarówno w napojach alkoholowych, jak i w maceratach turówki wonnej,
stosowanych do produkcji smakowych napojów alkoholowych, a także w napojach
bezalkoholowych.
Praca prezentuje wyniki badań nad warunkami rozdzielania, identyfikacji na podstawie
widma w zakresie UV oraz oznaczania kumaryny w napojach alkoholowych i maceratach z turówki
wonnej, wykorzystywanych do produkcji wódek ziołowych. Dobrano warunki analityczne
zapewniające optymalną selektywność rozdzielania w krótkim czasie. Zastosowano odwrócony
układ faz (RP-HPLC) do rozdzielania oraz detektor UV typu DAD, do identyfikacji i oznaczania
analitu. W przypadku rozdzielania i oznaczania kumaryny w maceracie z turówki wonnej
zastosowano, dodatkowo, przepływ zwrotny eluentu w kolumnie (E-BF), co pozwala na ominięcie
etapu wstępnego oczyszczania próbki np. techniką ekstrakcji do fazy stałej (SPE), a także zapewnia
całkowite usunięcie z kolumny związków silnie oddziałujących z fazą stacjonarną, co zapewnia
powtarzalność wyników oznaczania i długi „czas życia” kolumny.
Wyniki wstępnych badań wskazują, że opracowana tu metodyka, może też znaleźć też
zastosowanie do identyfikacji oraz oznaczania kumaryny w innych produktach spożywczych,
jednak ustalenie pełnej listy produktów, które mogą być badane z zastosowaniem prezentowanej
metodyki wymaga jeszcze badań oraz walidacji procedury dla różnych produktów żywnościowych.
51
IDENTYFIKACJA PRODUKTÓW ELEKTROCHEMICZNEGO ROZKŁADU
CIECZY JONOWYCH ZA POMOCĄ TECHNIKI GC-MS
Aleksandra FABIAŃSKA*, Marek GOŁĘBIOWSKI, Piotr STEPNOWSKI,
Ewa Maria SIEDLECKA
Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii, Katedra Analizy Środowiska,
ul. Sobieskiego 18, 80-952 Gdańsk
*e-mail: [email protected]
Najbardziej skuteczne metody usuwania toksycznych i trudno biodegradowalnych
zanieczyszczeń należą do Pogłębionych Procesów Utleniania (ang. Advanced Oxidation Process,
AOP). Jedną z tych metod jest utlenianie z wykorzystaniem elektrod o wysokim potencjale
utleniania. Mechanizm elektrochemicznej degradacji polega na anodowym rozkładzie wody do
rodników hydroksylowych, które w zależności od rodzaju elektrody pozostają chemicznie
(elektrody „aktywne”) lub fizycznie (elektrody „nieaktywne”) zaadsorbowane na jej powierzchni,
a następnie reagują ze związkami organicznymi. Kontrola procesu utylizacji zanieczyszczeń
poprzez identyfikację produktów rozpadu jest istotnym elementem w określaniu jego skuteczności
oraz daje możliwości poznania mechanizmu tego procesu. Identyfikacja produktów degradacji
pozwala również na ocenę potencjalnej toksyczności i biodegradowalności mieszaniny
podegradacyjnej. Metodą pozwalającą na wstępne rozpoznanie produktów rozpadu jest technika
GC-MS. Mieszanina produktów zostaje rozdzielona na kolumnie chromatograficznej, a detektor,
jakim jest spektrometr mas pozwala na identyfikację poszczególnych związków. Szczególnie ważne
są badania nad drogą rozkładu cieczy jonowych, których właściwości dają możliwość szerokiego
zastosowania w przemyśle. W związku z tym, przypuszcza się, że w najbliższych latach będą one
obecne jako zanieczyszczenia w ściekach i odpadach.
W prezentowanej pracy wykorzystano technikę GC-MS do wstępnego rozpoznania
produktów elektrochemicznego rozkładu chlorku 1-butylo-3-metyloimidazolowego (IM14Cl).
Identyfikacja produktów pozwoliła na zaproponowanie prawdopodobnej drogi elektrochemicznej
degradacji tego związku. Zastosowanie techniki GC-MS umożliwiło również porównanie procesu
rozkładu IM14Cl na elektrodach „aktywnych” (IrO2) i „nieaktywnych” (BDD, PbO2).
Badania finansowano z Grantu NN523 42 3737 i BW Nr 538820005091.
52
METODY BADANIA CAŁKOWITEGO POTENCJAŁU
ANTYOKSYDACYJNEGO PRODUKTÓW PSZCZELICH
Elwira LEWCZUK1, Katarzyna CIOŁEK
1, Paweł M. WANTUSIAK
1,
Paweł PISZCZ1, Iwona KIERSZTYN
1,
Bronisław K. GŁÓD1, Paweł K. ZARZYCKI
2
/chromatografia cienkowarstwowa TLC/
1Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny, Wydział Nauk Ścisłych, Zakład Chemii Analitycznej,
ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce, URL: dach.ich.uph.edu.pl, e-mail: [email protected]
2Politechnika Koszalińska, Wydział Budownictwa i Inżynierii Środowiska,
Zakład Toksykologii i Bioanalityki, ul. Śniadeckich 2,75-453 Koszalin, e-mail: [email protected]
W ostatnich latach wiele uwagi poświęca się lepszemu poznaniu wpływu wolnych rodników
(WR) i reaktywnych form tlenu (RFT) na organizm ludzki. Wolnym rodnikom przypisuje się
powstawanie wielu chorób zwyrodnieniowych oraz przyspieszanie procesu starzenia. Są one
usuwane z organizmów żywych przez (występujące w owocach, warzywach, miodach czy ziołach)
antyoksydanty i/lub zmiatacze wolnych rodników.
Opracowane przez nas zostały nowe (udoskonalone) metody oznaczania całkowitego
potencjału antyoksydacyjnego (CPA) (i) wykorzystujące reakcję rodnika DPPH z antyoksydantami
i jego oznaczaniu za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) oraz (ii) pomiar powierzchni
pików zarejestrowanych za pomocą różnicowej woltametrii pulsowej (DPV).
W technice TLC zastosowano stabilny rodnik azowy DPPH• (1,1-difenylo-2-pikrylohydrazyl)
którego metanolowy roztwór ma barwę purpurową. W wyniku jego redukcji do DPPH-H, pod
wpływem antyoksydantów zawartych w badanej próbce, roztwór zmienia barwę na żółtą. Miarą
CPA było zmniejszenie się pola powierzchni plamki (piku) rodnika. Próbkę rozwijano na płytce
silikażelowej w układzie heksan:aceton;etanol o stosunku objętościowym 3:1,9:0,1 (v/v/v). Płytkę
skanowano i poddano obróbce przy użyciu programu komputerowego Scion Image. Poprawność tej
techniki sprawdzono przez porównanie wyników uzyskanymi klasyczną metodą fotometryczną z
DPPH (zmiana absorbancji roztworu przy długości fali λ = 517 nm).
Opracowane techniki zastosowano do wyznaczania CPA produktów pszczelarskich. Okazało
się, że TLC można zastosować do pomiarów wartości CPA miodów pitnych. Jest ona dokładniejsza
od fotometrycznej, gdyż pozwala na rozdzielanie ewentualnych barwników obecnych w próbce
mogących fałszować wyniki fotometryczne. Zaletą jej jest również badanie kilku próbek
jednocześnie. Metoda oparta na DPV dostarcza ogólnych informacji o właściwościach
antyoksydacyjnych badanych miodów.
53
ZASTOSOWANIE TECHNIK HPLC-UV I LC-MS DO IDENTYFIKACJI
PRODUKTÓW ELEKTROCHEMICZNEGO ROZKŁADU WYBRANYCH
CIECZY JONOWYCH
Aleksandra FABIAŃSKA*, Marek GOŁĘBIOWSKI, Jadwiga WIŚNIEWSKA,
Piotr STEPNOWSKI, Ewa Maria SIEDLECKA
Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii, Katedra Analizy Środowiska,
ul. Sobieskiego 18, 80-952 Gdańsk
*e-mail: [email protected]
Ciecze jonowe są obiecującą grupą związków, która znajduje zastosowanie jako alternatywne
nielotne rozpuszczalniki w syntezie organicznej, reakcjach katalitycznych i biokatalitycznych,
elektrochemii oraz w ostatnich latach jako lubrykanty. Ze względu na szeroki zakres możliwości
stosowania tych związków pewne jest iż w następstwie ich eksploatacji powstawać będą odpady
i ścieki zawierające zarówno związki macierzyste jak i produkty ich rozpadu. Jak donosi literatura
niektóre z cieczy jonowych wykazują toksyczność w stosunku do organizmów żywych oraz
znaczną trwałość w środowisku. Dlatego też niezmiernie ważne jest opracowanie odpowiednich
metod utylizacji cieczy jonowych oraz poznanie ich drogi rozpadu poprzez identyfikację produktów
degradacji. Jedną z dobrze zapowiadających się technik degradacji jest zastosowanie elektrod
o wysokim potencjale utleniania skutecznie usuwających trudno biodegradowalne związki
organiczne.
W niniejszej pracy przedstawiono opracowaną metodę analityczną opartą o zastosowanie
układu wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem UV oraz z techniki LC-MS
do oceny stopnia rozkładu oraz identyfikacji produktów degradacji wybranych cieczy jonowych
przy użyciu elektrody PbO2. Parametry analityczne dobrane zostały w sposób umożliwiający ocenę
ilościową badanych związków na bardzo niskich poziomach. Dzięki opracowanej metodzie
możliwe było określenie prawdopodobnej struktury produktów degradacji pięciu cieczy jonowych:
chlorku 1-butylo-3-metylo-imidazolowego (IM14Cl), chlorku 1-metylo-3-oktylo-imidazolowego
(IM18Cl), chlorku 1-(3-hydroksypropylo)-3-metylo-imidazoliowego (IM13OHCl), bromku 1-(2-
etoksyetylo)-3-metylo-imidazoliowego (IM12O2Br) oraz chlorku 1-benzylo-3-metylo-
imidazolowego (IM1-1PhCl). Ilość produktów rozkładu oraz droga rozkładu ściśle wiązała się ze
strukturą związku macierzystego.
Badania finansowano z Grantu NN523 42 3737 i BW Nr 538820005091.
54
- i - CYKLODEKSTRYNY ROZPUSZCZONE W CIECZY JONOWEJ
JAKO FAZY STACJONARNE W CHROMATOGRAFII GAZOWEJ
Monika SOBÓTKA*, Monika ASZTEMBORSKA, Janusz LIPKOWSKI
Instytut Chemii Fizycznej PAN, ul. Kasprzaka 44/52, 01-224 Warszawa
*e-mail: [email protected]
Niskotemperaturowe ciecze jonowe są to stopione sole o temperaturze topnienia poniżej
temperatury pokojowej. Posiadają wiele unikalnych właściwości fizykochemicznym min.: bardzo
mała prężność par, niepalność, duża stabilność termiczna i elektrochemiczna, zdolność
rozpuszczania szerokiej gamy związków organicznych i nieorganicznych. W ostatnich latach
niskotemparturowe ciecze jonowe są bardzo często wykorzystywane w chemii analitycznej.
Ważnym zastosowaniem cieczy jonowych jest wykorzystywanie ich jako rozpuszczalników
cyklodekstryn (CD), do otrzymywania nowego rodzaju stabilnych termicznie, chiralnych faz
stacjonarnych w chromatografii gazowej [1, 2].
Cyklodekstryny, są to naturalne, chiralne oligosacharydy. Głównymi ich przedstawicielami
są α-, β-i γ-cyklodekstryny zbudowane odpowiednio z 6, 7 i 8 jednostek α-D-glukozy.
Cyklodekstryny są wykorzystywane w różnych technikach chromatograficznych do rozdzielania
enancjomerów. W literaturze opisano enancjoselektywne właściwości modyfikowanych
cyklodekstryn rozpuszczających się w różnych cieczach jonowych, stosowanych jako fazy
stacjonarne w kapilarnej chromatografii gazowej [1, 2]. Natomiast nigdzie nie zostało opisane
zastosowania w chromatografii gazowej naturalnych cyklodekstryn rozpuszczonych w cieczach
jonowych (α-, β- i γ-cyklodekstryna).
W prezentowanych badaniach, (przygotowano szklane kolumny pakowane) fazy stacjonarne
zawierające - i -cyklodekstrynę rozpuszczono w chlorku 1-decyl-3-metyloimidazoliowym.
Badanymi związkami były chiralne terpeny. Zbadano tworzenie się kompleksów
i enancjoselektywne właściwości - i -CD rozpuszczonych w cieczy jonowej.
Badania częściowo wspierane przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju
Regionalnego, dzięki dotacji Innowacyjna Gospodarka (POIG.01.01.02-14-102/09).
Literatura:
[1] Huang K.; Zhang X.; Armstrong D.W., J. Chromatogr. A, 1217 (2010) 5261.
[2] Berthod A.; He L.; Armstrong D.W., Chromatographia, 53 (2001) 63.
55
OZNACZANIE AKTYWNOŚCI PRZECIWUTLENIAJĄCEJ
OLEJÓW ROŚLINNYCH
Piotr KOŚCIESZA, Rafał JURCZAK, Paweł PISZCZ,
Paweł M. WANTUSIAK, Iwona KIERSZTYN, Bronisław K. GŁÓD
/wysokosprawna chromatografia cieczowa RP-HPLC/FLD/ED/
Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny, Wydział Nauk Ścisłych, Zakład Chemii Analitycznej,
ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce
URL: dach.ich.uph.edu.pl, e-mail: [email protected]
Antyoksydanty są to związki wyspecjalizowane w dezaktywowaniu i zapobieganiu zniszczeń
wolnorodnikowych, głównie procesowi utleniania. Pod pojęciem antyoksydanta rozumiemy każdą
substancję, która występuje w danym układzie/systemie (np. żywy organizm, produkt
żywnościowy) w dużo mniejszych stężeniach od stężeń substratu (substancji podlegającej
utlenianiu) wstrzymuje lub opóźnia proces utlenienia. Organizmy żywe same syntetyzują
antyoksydanty endogenne, stanowiące obronę przed wolnymi rodnikami.
Zaproponowany przez nas pomiar aktywności przeciwutleniającej (CPAED) polegał na
wyznaczeniu całkowitego pola powierzchni wszystkich pików chromatograficznych
zarejestrowanych za pomocą detektora amperometrycznego przy różnych potencjałach elektrody
pracującej (węgiel szklisty vs Ag/AgCl) w zakresie utleniania. Wyniki zostały skorelowane z
analogicznymi zmierzonymi w odniesieniu do rodnika DPPH, uzyskanymi za pomocą różnicowej
woltametrii pulsowej (DPV), a także z całkowitą zawartością polifenoli i tokoferoli.
Do pomiaru stężenia tokoferoli zastosowano wysokosprawną chromatografię cieczową w
układzie faz odwróconych (RP) z detekcją fluorescencyjną (FLD) lub elektrochemiczną (ED). Na
kolumnę chromatograficzną COSMOSIL 5C18-MS-II Waters (4,6 x 250 mm, 5 μm) nastrzykiwano
próbki olejów roślinnych po zmydlaniu lub jako ekstrakty metanolowe. Jako fazę ruchomą
zastosowano 0,1 M NaClO4 w MeOH.
Okazało się, że RP-HPLC zarówno z detekcją fluorescencyjną jak i elektrochemiczną
pozwalają na oznaczenie stężenia tokoferoli w olejach jadalnych. Detekcja elektrochemiczna
umożliwia dodatkowo określenie udziału poszczególnych tokoferoli w całkowitym ich stężeniu
i/lub CPAED.
56
WPŁYW CIECZY JONOWYCH JAKO DODATKÓW
DO CYKLODEKSTRYNOWEJ FAZY RUCHOMEJ NA CHIRALNE
ROZDZIELENIE W WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII
CIECZOWEJ
Agata PAPIERZ*, Monika ASZTEMBORSKA
/wysokosprawna chromatografia cieczowa/
Instytut Chemii Fizycznej PAN, ul. Kasprzaka 44/52, 01-224 Warszawa
*e-mail: [email protected]
Cyklodekstryny (CD) są naturalnie chiralnymi substancjami, o 100% czystości
enancjomerycznej i jako takie są doskonałym molekularnym sorbentem o wysokiej
enancjoselektywności. Jednym z ograniczeń ich zastosowania jest nierozpuszczalność
w niewodnych środowiskach a także, w sposób ograniczony, w roztworach wodnych. Ciecze
jonowe są specjalnym rodzajem rozpuszczalników, które wykazują obiecujące zdolności do
rozpuszczania cyklodekstryn.
Obecnie ciecze jonowe (IL) cieszą się ogromnym zainteresowaniem nie tylko wśród technik
rozdzielczych ale także w całej chemii analitycznej. W literaturze można spotkać się
z doniesieniami na temat zastosowania cieczy jonowych do faz ruchomych w wysokosprawnej
chromatografii cieczowej [1]. Zostało udowodnione, że ich obecność w eluencie poprawia jakość
rozdzielenia, prowadząc do zmian w czasach retencji i kształcie pików [2]. Można też znaleźć
doniesienia dotyczące wykorzystania chiralnych i niechiralnych cieczy jonowych jako dodatków do
cyklodekstryn w celu separacji enancjomerów w elektroforezie kapilarnej [3,4], jednakże, nie
spotkano się z takim zastosowaniem cieczy jonowych w wysokosprawnej chromatografii
cieczowej.
W tej pracy zbadano wpływ dwóch cieczy jonowych: chlorku 1-butylo-3-
metyloimidazoliowego oraz 1-heksylo-3-metyloimidazoliowego na chiralne rozdzielenie
(+-)-efedryny, (+-)-skopolaminy, (+-)-atropiny i (+-)-homoatropiny. Obie ciecze zostały dodane
w ilości równomolowej wraz z β- i γ- cyklodekstrynami do fazy ruchomej w wysokosprawnej
chromatografii cieczowej. Rozdzieleń dokonano na kolumnie z wypełnieniem C18. Uzyskane
wyniki wskazują na możliwość tworzenia się potrójnych kompleksów IL/CD/analit ze względu
na zmiany w czasach retencji. Nie zaobserwowano jednak pozytywnego wpływu cieczy jonowych
na enancjoseparację badanych związków, a w jednym przypadku zauważono wręcz pogorszenie
rozdzielenia.
Literatura:
[1] Tang F., Tao L., Luo X.B., Ding L., Guo M.L., Nie L.H., Yao S.Z, J. Chromatogr. A, 1125 (2006) 182-
188. [2] Hu X., Peng J., Huang Y., Yin D., Liu. J., J. Sep. Sci., 32 (2009) 4126-4132.
[3] François Y., Varenne A., Juillerat E., Villemin D., Gareil P., J. Chromatogr. A, 1155 (2007) 134-141.
[4] Rousseau A., Florence X., Pirotte B., Varenne A., Gareil P., Villemin D., Chiap P., Crommen J.,
Fillet M., Servais A.C., J. Chromatogr. A, 1217 (2010) 7949-7955.
Badania częściowo wspierane przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju
Regionalnego, dzięki dotacji Innowacyjna Gospodarka (POIG.01.01.02-14-102/09).
57
PRO- I ANTYOKSYDANTY W PROCESIE FERMENTACJI MIODÓW
Adrian SZABRAŃSKI, Paweł M. WANTUSIAK,
Paweł PISZCZ, Bronisław K. GŁÓD
/wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC/DAD/ED/
Uniwersytet Przyrodniczo-Humanistyczny, Wydział Nauk Ścisłych, Zakład Chemii Analitycznej,
ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce
URL: dach.ich.uph.edu.pl, e-mail: [email protected]
W pracy zmierzono, różnymi technikami, całkowity potencjał antyoksydacyjny (CPA)
miodów na różnych etapach fermentacji oraz pod wpływem dodatków ziołowych i owocowych. Do
pierwszej grupy zaliczamy metody wykorzystujące konkurencyjną reakcję wygenerowanego (OH)
lub trwałego (DPPH) rodnika z badaną próbką i sensorem. Produkt reakcji oznaczany był
chromatograficznie (OH) lub fotometrycznie (DPPH
). Inną metodą było oznaczanie całkowitej
powierzchni wszystkich pików na chromatogramie otrzymanymi z zastosowaniem detektora
amperometrycznego. Pierwsza z technik polegała na wygenerowaniu rodnika hydroksylowego, w
reakcji analogicznej do reakcji Fentona, i jego reakcji zarówno z próbką jak i sensorem (kwasem p–
hydroksybenzoesowym, pHBA) służącym jako pułapka spinowa. Generowane rodniki zmiatane są
konkurencyjnie przez pHBA oraz badaną substancję. Produkt reakcji oznaczano za pomocą RP-
HPLC z detekcją UV.
Otrzymane wyniki skorelowane zostały z całkowitym stężeniem polifenoli i antocyjanów.
Ponadto zbadano udział w zmianach CPA cukrów, etanolu i nadtlenku wodoru. Zbadano również
reakcje uboczne rodników hydroksylowych z glukozą, etanolem i kwercetyną tłumaczące brak
addytywności poszczególnych składników na CPA.
Okazało się, że wartości CPA miodów zmieniają się podczas fermentacji. Dużo większe
zmiany obserwowane są w stosunku do DPPH niż rodnika hydroksylowego, gdyż ten ostatni jako
najsilniejszy rodnik reaguje nie tylko z silnymi antyoksydantami ale również z cukrami i
alkoholem, których stężenia we wszystkich miodach są porównywalne. Duży udział w zmianach
CPA miały również wtórne reakcje rodnika hydroksylowego z glukozą (wytwarzające dodatkowe
rodniki), etanolem czy kwercetyną, a także obecność wody utlenionej w niektórych miodach.
58
Komitet Organizacyjny
III Podlaskiego Spotkania Chromatograficznego
składa serdeczne podziękowania SPONSOROM