Viviani Olivastro Bressani Investigação do efeito dos ácidos graxos ômega-3 e ômega-6 e seus derivados na inibição de proliferação de células tumorais de mama. SÃO PAULO 2015 Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Titulo de Doutora em Ciências da Saúde.
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Viviani Olivastro Bressani
Investigação do efeito dos ácidos graxos ômega-3 e
ômega-6 e seus derivados na inibição de proliferação
de células tumorais de mama.
SÃO PAULO
2015
Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Titulo de
Doutora em Ciências da Saúde.
Viviani Olivastro Bressani
Investigação do efeito dos ácidos graxos ômega-3 e
ômega-6 e seus derivados na inibição de proliferação
de células tumorais de mama.
SÃO PAULO
2015
Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Titulo de
Doutora em Ciências da Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Prof. Dr. Wagner Ricardo Montor
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Bressani, Viviani Olivastro Investigação do efeito dos ácidos graxos ômega-3 e ômega-6 e seus derivados na inibição de proliferação de células tumorais de mama./ Viviani Olivastro Bressani. São Paulo, 2015.
Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Wagner Ricardo Montor 1. Ácidos graxos 2. Câncer de mama 3. Morte celular 4. Espécies
reativas de oxigênio 5. Ácidos graxos insaturados BC-FCMSCSP/48-15
Oração a Bezerra de Menezes
Nós te rogamos, Pai de infinita bondade e justiça, as graças de
Jesus Cristo, através de BEZERRA DE MENEZES e suas legiões de
companheiros.
Que eles nos assistam, Senhor, consolando os aflitos, curando
aqueles que tiverem suas provas e expiações a passar, esclarecendo aos
que desejarem conhecer a verdade e assistindo a todos quantos apelarem
ao teu infinito amor.
Jesus, divino portador da graça e da verdade, estende tuas mãos
dadivosas em socorro daqueles que te reconhecem o despenseiro fiel e
prudente; faze-o, divino Mestre, através de tuas legiões consoladoras, de
teus santos espíritos, a fim de que a fé se eleve, a esperança aumente, a
bondade se expanda e o amor triunfe sobre todas as coisas.
BEZERRA DE MENEZES, apóstolo do bem e da paz, amigo dos
humildes e dos enfermos, movimenta as tuas falanges amigas em
benefício daqueles que sofrem, sejam dos males físicos ou espirituais.
Santos espíritos, dignos obreiros do Senhor, derramem as graças e as
curas sobre a humanidade sofredora, a fim de que as criaturas se
tornem amigas da paz e do conhecimento, da harmonia e do perdão,
semeando pelo mundo os divinos exemplos de JESUS CRISTO.
QUANDO A BOCA CALA...O CORPO GRITA!!!
A enfermidade é um conflito entre a personalidade e a alma.
O resfriado escorre quando o corpo não chora.
A dor de garganta entope quando não é possível comunicar as
aflições.
O estômago arde quando as raivas não conseguem sair.
O diabetes invade quando a solidão dói.
O corpo engorda quando a insatisfação aperta.
A dor de cabeça deprime quando as duvidas aumentam.
O coração desiste quando o sentido da vida parece terminar.
A alergia aparece quando o perfeccionismo fica intolerável.
As unhas quebram quando as defesas ficam ameaçadas.
O peito aperta quando o orgulho escraviza.
A pressão sobe quando o medo aprisiona.
As neuroses paralisam quando a “criança interna” tiraniza.
A febre esquenta quando as defesas detonam as fronteiras da
imunidade.
Os joelhos doem quando o orgulho não se dobra.
O câncer mata quando não se perdoa e/ou cansa de viver.
E as dores caladas? Como falam em nosso corpo?
A enfermidade não é má, ela avisa quando erramos a direção.
O caminho para a felicidade não é reto, existem curvas chamadas
Equívocos, existem semáforos chamados Amigos, luzes de
precaução chamadas Família, e ajudará muito ter no caminho
uma peça de reposição chamada Decisão, um potente motor
chamado Amor, um bom seguro chamado Fé, abundante
combustível chamado Paciência.
Mas principalmente um maravilhoso Condutor chamado Deus, ou
como O queiram chamar.
Preste atenção!!!!
O plantio é livre, a colheita, é obrigatória..... Preste atenção
no que você está plantando, pois será a mesma coisa que irá
colher!
Dedicatória
Dedico este trabalho a Deus, aos Anjos de Luz, aos meus pais, irmãos, tia
Célia e meu marido Amaury por me apoiarem e me estimularem com palavras e
exemplos de vida a cada etapa deste projeto. Sem vocês minha vida não vale nada.
Em especial a minha querida e amada avó Maria Antônia Braga dos Santos
(In Memoriam), pelo carinho, pelos exemplos de vida, por incentivos, pelas alegrias,
pelas palavras de sabedoria e amor que sempre nos presenteaste. Amo-te muito,
por toda a eternidade.
Agradecimentos
Primeiramente agradeço a Deus por estar presente e morar em meu coração,
em cada passo da minha, pela oportunidade em me presentear e poder realizar mais
um sonho de fazer o Doutorado e poder contribuir com a ciência com este trabalho
rico de amor e competência.
Agradeço a Deus, a Jesus e a Mestra Maria, por colocarem em minha
caminhada Anjos de Luz que me guiaram com palavras, exemplos de vida para que
eu nunca desistisse.
Ao Profº. Dr. Wagner Ricardo Montor por me orientar, confiar e esclarecer as
minhas dúvidas durante a realização do projeto. E principalmente por ter muita
paciência para mostrar o caminho durante toda a realização do projeto. Você me
permitiu realizar outro sonho, estudar e entender muitos mecanismos sobre essa
doença. Aprendi muito, obrigada por me ensinar a caminhar com minhas próprias
pernas.
A meus pais Paulo Gilberto Bressani e Maria Regina dos Santos Bressani,
pela educação que me deram, pelas orações, por acreditarem em mim e pelas
orientações maravilhosas de como saber lidar com a vida, sem esquecer Deus,
Jesus e Maria, aprendendo com humildade, simplicidade, equilíbrio, determinação,
respeito, fé e muito amor. Obrigada por tudo! Amo vocês!!!!
Aos meus irmãos Paulo Henrique Bressani, Paulo Vinícius Bressani e
Regiane Bressani por serem pessoas importantes em minha vida e que me
ajudaram com palavras de amor em todos os sentidos da minha vida. Amo mais que
tudo!
Aos meus sobrinhos Raphael Santos Bressani, Gabriella Braga Bressani e
Arthur de Oliveira Bressani por enriquecerem a minha vida de alegrias, aprendizados
e muito amor. Vocês são meus amores!!!!
À minha tia Célia Maria Braga dos Santos e as minhas cunhadas Andréa
Correia de Oliveira e Angela Panseri pelas orações, por acreditarem em mim, por
palavras de incentivo e por conselhos cheios de amor.
Ao meu marido Amaury César Derrè Sartorelli por fazer parte da mina vida,
por me trazer alegrias, por me orientar com palavras de sabedoria e amor, por me
ouvir nos meus momentos mais difíceis e saber lidar comigo nesses momentos
complicados da minha vida, pela cumplicidade, respeito e amor, e por ser um
homem de grandes qualidades. Amo-te muito!!!!
À Dalva Sartorelli e Wagner Sartorelli, por serem meus segundos pais, me
orientando e orando para a realização do meu doutorado. Muito obrigada!
Aos meus amigos Dr. Wanderley Granja Affonso e Elza Silva Affonso que me
estimularam a entrar na vida de pesquisa acadêmica e que não me deixaram
desistir. Obrigada por serem meus Anjos de Luz e por serem meus exemplos de
vida, principalmente ao Dr. Wanderley excelente médico que exerce sua função com
amor, humildade, simplicidade e fé. Obrigada por ser o meu exemplo!
Aos amigos: Ariadiny de Lima Caetano, Danielle Vieira Sobral, Karla Cristina
Monteiro da Silva, Nélia Araújo, Janaína Balthazar, Ana Flávia Laureano, Rafael
Sutti, Carla Sant’Anna Corrêa.
À minha grande amiga Bianca Gamberini, por ter sido a responsável por me
apresentar o Prof. Dr. Wagner Ricardo Montor, por me ouvir nos meus momentos
difíceis e por me encorajar, para que este sonho fosse realizado.
À Profª Dra. Mirian Galvona Jasiulionis, por permitir realizar uma parte dos
experimentos no Laboratório de Ontogenia e Epigenética da Universidade Federal
de São Paulo.
Ao Diego de Assis Gonçalves e a Jéssica Domingues Gonçalves, por me
auxiliarem nos experimentos finais.
A todos os integrantes e colegas do Departamento de Ciências Fisiológicas
pela força e orientação que cada um passou a mim.
Ao grupo de Bases Moleculares da Proliferação Celular, em especial a Profª.
Dra. Fabiana Henriques de Melo Machado, a Thiara Alves Matos, a Andréia Rangel
pela oportunidade de aprender profissionalmente e pessoalmente, e por me
ajudarem na realização do projeto.
Ao Fundo de Amparo à Pesquisa (FAP), a CAPES, a Irmandade da Santa
Casa de São Paulo e a Faculdade de Medicina da Santa Casa de São Paulo, por
permitirem a realização deste sonho.
Sumário
Lista de Abreviaturas
Lista de Símbolos
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
1. Introdução 22 1.1 Câncer de Mama 22 1.2 Subtipos de Câncer de mama 23 1.3 Quimioprevenção 26 1.4 Ácidos Graxos Ômega 3 e 6 27 1.5 Espécies Reativas de Oxigênio 32 1.6 Mitocôndria e Câncer 33 1.7 Morte Celular 34 1.8 Modelos Celulares e Estratégia de Estudo 36
3. Materiais e Métodos 39 3.1 Descrição da Linhagem Celular 39 3.2 Reagentes 41 3.3 Cultivo Celular 41 3.4 Congelamento Celular 42 3.5 Ensaio de Viabilidade Celular (ensaio MTT) 42 3.6 Avaliação das alterações fenotípicas induzidas pelo tratamento 43 3.7 Determinação das curvas de crescimento em substrato sólido 43 3.8 Crescimento em suspensão de agarose 44 3.9 Avaliação do Potencial de Migração pela técnica de “Scratch” 44 3.10 Imunocitoquímica para detecção de Superóxido Dismutase 2 (SOD2)
45
3.11 Análise das Lâminas após imunocitoquímica 47 3.12 Atividade de Superóxido Dismutase (OD) 47 3.13 Espécies Reativas de Oxigênio 48 3.14 Morte Celular por Apoptose 48 3.15 Análise Estatística dos Dados 49
4. Resultados 50 4.1 Preparação da solução de ácidos graxos 50 4.2 Padronização da Curva de Crescimento em Substrato Sólido 50 4.3 Efeito do tratamento com ácidos graxos sobre as curvas de crescimento em substrato sólido
54
4.4 Tabelas comparativas do efeito do tratamento com ácidos graxos sobre diferentes linhagens celulares
73
4.5 Viabilidade Celular 79 4.6 Experimento de “scratch” para análise do potencial de migração das células
81
4.7 Crescimento celular em suspensão de agarose 85
4.8 Análise da expressão de superóxido dismutase-2 (SOD2), por imunocitoquímica
89
4.9 Análise da atividade de superóxido dismutase 94 4.10 Produção de Espécies Reativas de Oxigênio (EROS) 96 4.11 Análise de Morte Celular 102 4.12 Análise do efeito dos ácidos graxos descritos sobre a curva de crescimento das linhagens Hs578t e MDA-MB-435
Figura 8: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com
aumento de 10X, da linhagem MCF-7 tratada com EPA/DHA na concentração de
200uM, nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de
5X103 na placa de 24 poços.......................................................................................60
Figura 9: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da linhagem SKBR-3 controle negativo (apenas meio de cultura), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24 poços......................................................................................................61
Figura 10: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com
aumento de 10X, da linhagem SKBR-3 controle negativo (meio de cultura e veículo
hexano na concentração de 200µM), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a
Figura 34: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem SKBR-3, tratada
com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico por 24 horas. Análise estatística feita por
ANOVA de uma via..................................................................................................100
Figura 35: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem SKBR-3, tratada com ácido linoleico por 24 horas. Análise estatística feita por Teste Mann Whitney U. ..................................................................................................................................100
Figura 36: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem SKBR-3, tratada
com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico por 2 horas. Análise estatística feita por
ANOVA de uma via..................................................................................................101
Figura 37: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem SKBR-3, tratada
com ácido linoleico por 2 horas. Análise estatística feita por Teste Mann Whitney U. ..................................................................................................................................101
Figura 38: Ensaio de morte celular da linhagem MDA-MB-231, tratada com os
ácidos graxos EPA/DHA, CLA e Ácido linolênico por 8 dias na concentração de
100µM. Análise estatística feita por ANOVA de duas
Para o ensaio foram destinados poços para reação livre, amostras e branco.
Para a reação livre, foram adicionados 220µL de tampão fosfato 0,05M + 5µL de
NBT + 5µL de NADH + 10µL de PMS por poço. As amostras foram analisadas em
triplicata. Para estas foram adicionados 200µL de tampão fosfato + 20µL da amostra
+ 5µL de NBT + 5µL de NADH + 10µL de PMS por poço. Para o branco foi
adicionado a mesma quantidade que o da reação livre menos o PMS. Foi feito o
monitoramento da cinética em 560nm por 3 minutos.
3.13 – Espécies Reativas de Oxigênio
Para avaliar a quantidade de Espécie Reativa de Oxigênio produzida pelas
células, estas foram plaqueadas na densidade de 3x105 células/mL, e mantidas em
incubadora a 37ºC com 5% de CO2. As linhagens foram tratadas por 24 e 48 horas
com os ácidos graxos EPA/DHA, CLA, ácido linolênico e ácido linoleico com
albumina e seus respectivos veículos (hexano e albumina) na concentração de
100µM e 200µM.
Após o período de incubação, as células foram lavadas com PBS,
tripsinizadas e passadas para tubo eppendorf de 2mL, sendo centrifugados por
2000rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e lavado mais uma vez com
PBSA a 2000rpm por 5 minutos. Após as lavagens, o Dihidroetídeo (DHE) foi
adicionado e incubado por 45 minutos em estufa a 37ºC, protegido da luz. As células
foram lavadas com PBS e centrifugadas a 2000rpm por 5 minutos. Foram
adicionados 200µL de PBS e realizada a leitura no citômetro de fluxo, no filtro FITC
excitação de 488nm e emissão de 525nm.
3.14 Morte Celular por Apoptose
As células foram cultivadas em placas de 6 poços em densidade celular de
5x103/mL, e mantidas em incubadora a 37ºC com 5% de CO2. A linhagem celular
49
MDA-MB-231 foi tratada por 8 dias na concentração de 100µM e por 24 horas na
concentração de 200µM com os ácidos EPA/DHA, CLA, ácido linolênico e ácido
linoleico com albumina e seus respectivos veículos (hexano e albumina). A linhagem
SKBR-3 foi tratada por 8 dias nas concentrações de 100µM e 200µM para o CLA e
por 24 horas nas concentrações de 100µM e 200µM para os ácidos EPA/DHA e
ácido linolênico.
Após o período de incubação, as células foram lavadas com PBS,
tripsinizadas e passadas para tubo eppendorf de 2mL, sendo centrifugados por
2000rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet de células foi
lavado mais uma vez com PBSA gelado a 2000rpm por 5 minutos. Após as
lavagens, foram adicionadas anexina V e iodeto de propídeo (PI) na concentração
de 100µg/mL e incubadas por 15 minutos em temperatura ambiente, protegido da
luz. Após o período de incubação, foram adicionados 200µL por amostra do tampão
de ligação de anexina, estas foram homogeneizadas cuidadosamente e as amostras
foram colocadas no gelo, até a realização da leitura. As células foram analisadas em
citometria de fluxo, na fluorescência de 530nm, utilizando a excitação de 488nm.
3.15 Análise Estatística dos Dados
Os resultados foram expressos como média ± desvio-padrão das médias.
Quando o número de observações era suficiente, foi feita Anova de uma via e Anova
de duas vias com pós-teste de Bonferroni. Somente valores para p menor do que
0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
50
4. Resultados
4.1 Preparação da solução de ácidos graxos
Na literatura há referência de utilização de etanol e hexano como solvente
para diluição dos ácidos graxos. A estabilidade da solução preparada com estes dois
solventes foi testada, com base em separação de fase e miscibilidade no meio de
cultura. Embora etanol seja potencialmente menos tóxico do que hexano para as
células, ao diluir os ácidos graxos em etanol e deixar a solução em repouso por 1
hora, ocorreu separação de fase entre a fração oleosa e a fração aquosa,
comprometendo a reprodutibilidade dos experimentos. Nas soluções preparadas em
hexano, não ocorre separação ou formação de gotículas de óleo no meio de cultura,
portanto as soluções estoque foram preparadas nesse solvente, com exceção do
ácido linoleico, que foi adquirido em um tampão fosfato contendo albumina.
Para diminuir a interferência do solvente no sistema, foram preparados
estoques de solução, na concentração de 100mM, minimizando o volume de
estoque a ser utilizado nas soluções de trabalho 50µM, 100µM e 200µM. O maior
volume de hexano utilizado, para a concentração de 200µM, equivale a 0,2% (v/v)
em meio de cultura.
No caso de EPA/DHA, como foi utilizado óleo de peixe como fonte, a solução
estoque foi preparada com base na concentração de EPA, de modo a gerar
soluções de trabalho 50µM, 100µM e 200µM deste. A solução estoque apresenta
132mM de EPA e 46mM de DHA.
Como controle, foram utilizados os mesmos volumes de hexano ou solução
tampão contendo albumina, conforme o ácido graxo testado.
4.2 Padronização da Curva de Crescimento em Substrato Sólido
Para definir o número de células a serem plaqueadas no dia zero da curva de
crescimento, foi feito um teste com duas quantidades em dois tipos de placas
diferentes. Foram utilizadas placas de 24 poços e placas de 12 poços. Nestas duas
foram plaqueadas 5x103, 1x104 ou 2x104 células, no dia zero, e estas foram
acompanhadas por nove dias, para verificar se havia saturação da densidade celular
antes do período completo de avaliação. Há uma dificuldade técnica ao se analisar
51
proliferação em pontos tardios, acima de 7 dias, sem nenhuma influência de
saturação, pois para esta não ocorrer por volta do dia 9, é necessário partir de um
plaqueamento inicial pouco denso, que impediria a proliferação, dado que células
em muito baixa densidade não encontram estímulo parácrino para proliferar.
Avaliando as curvas de proliferação (Figura 1) e também a densidade celular
em cada dia, microscopicamente (Figura 2), observou-se que não há saturação nas
condições testadas, todas podendo ser utilizadas e optou-se pela concentração de
5x103 células por poço, na placa de 24 poços, por necessitar de menos células na
expansão e permitir análise em maior escala do que na placa de 12 poços.
A contagem de células foi feita em câmara de Neubauer, manualmente, e em
contador automático (Casy Cell Counter and Analyzer, da Roche). Uma comparação
dos resultados obtidos no contador automático e na câmara de Neubauer mostrou
que não há diferença em valores absolutos ou reprodutibilidade entre os dois
métodos e por conveniência, a contagem manual passou a ser utilizada
exclusivamente, já que o contador automático se encontra no laboratório de um
colaborador, na USP.
52
Figura 2: Análise gráfica da duplicata da curva de crescimento de MDA-MB-231 em diferentes placas (24 e 12 poços), partindo de diferentes inóculos (5X103, 1X104 e 2X104), para padronização das condições a serem utilizadas na curva de crescimento.
53
Figura 3: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X,
da linhagem MDA-MB-231 controle negativo (apenas meio de cultura), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9), plaqueada na densidade celular de 5x103 em placa de 24 poços
54
. 4.3. Efeito do tratamento com ácidos graxos sobre as curvas de
crescimento em substrato sólido das diferentes linhagens celulares
Para garantir a correta avaliação do efeito dos ácidos graxos sobre a
proliferação das células, inclusive o possível efeito de saturação no dia 9, em todos
os tratamentos, foram analisados em paralelo, dois controles, um deles consistindo
de células sem nenhum tratamento, recebendo apenas trocas regulares de meio de
cultura e o outro controle, sendo tratado com volumes equivalentes de veículo
diluído em meio.
Nas figuras de 2 a 10, pode-se observar como varia a densidade celular ao
longo dos dias de preparo da curva, para cada linhagem celular estudada, em três
condições diferentes, como exemplo (apenas meio de cultura, veículo e EPA/DHA
na concentração 200μM.
Observe nas figuras de 11 a 16, o comportamento das células nas três
condições padrão de manutenção: apenas meio de cultura, meio de cultura com
veículo e meio de cultura com diferentes ácidos graxos (ácido linoleico, ácido
linolênico, EPA/DHA e CLA) em diferentes concentrações (50µM, 100µM e 200µM).
Para os tratamentos com ácido linoleico conjugado, ácido linolênico e
EPA/DHA, o veículo utilizado foi o hexano. Para o tratamento com ácido linoleico, o
veículo utilizado foi uma solução tampão contendo albumina, pois o ácido linoleico
obtido já veio diluído previamente em um tampão contendo albumina.
Quando nas figuras se identifica a condição como hexano - 200μM -2μL, por
exemplo, não quer dizer que foi utilizado hexano em concentração 200μM, mas sim
que o volume utilizado de 2μL é o mesmo volume de hexano utilizado para preparar
o meio de cultura suplementado com ácido graxo na concentração final de 200μM. O
cuidado foi utilizar volumes equivalentes de veículo no controle e no tratado.
Nas imagens das figuras 2, 3 e 4, observa-se que para a linhagem celular
MDA-MB-231 representante de tumores triplo-negativos, a saturação da densidade
celular só ocorreu em torno do nono dia de cultivo, quando apenas meio de cultura
ou veículo foram utilizados e não houve influência do veículo hexano, nem na
densidade celular e nem na morfologia das células. No caso do tratamento com
EPA/DHA 200μM, apresentado na figura 4, pareceu haver menor densidade celular
já no quinto dia. No sétimo dia observou-se grande número de debris e células
soltas, indicativo de morte e no nono dia observamos que a densidade celular era
55
bem menor do que nos controles, porém havia células vivas, aderidas e não
brilhantes, em número semelhante ao do dia do plaqueamento, mostrando que
poderia haver células resistentes.
Nas imagens 5, 6 e 7, observa-se para a linhagem celular MCF-7,
representante de tumores positivos para o receptor de estrógeno, que não houve
saturação da densidade celular nem no dia 9 e que não houve influência do veículo
sobre a densidade ou morfologia. Estas células, naturalmente crescem em núcleos
que se expandem até haver confluência, mas a aparência da monocamada não é
regular, apresentando células polimórficas. Na figura 7 observa-se que o tratamento
em questão induziu morte celular já nos primeiros dias, chegando à totalidade no
nono dia, onde se observaram apenas debris celulares.
Nas figuras 8, 9 e 10, observa-se que a linhagem SKBR-3, representante de
tumores positivos para o receptor HER-2, que não houve saturação da densidade
celular nem no nono dia e que esta célula apresenta morfologia semelhante à MCF-
7. No entanto, aqui, notou-se alguma sensibilidade ao veículo, com a presença de
debris celulares e alteração do padrão de proliferação a partir do dia 5. Na
impossibilidade de utilizar outro veículo, dado que etanol não dissolveu bem os
ácidos graxos e as outras possibilidades de solventes orgânicos testados foram
igualmente tóxicos para estas células, optou-se por trabalhar nesta condição, mas
sempre fazendo todas as inferências com base no comportamento do veículo
utilizado no controle negativo. A influência citotóxica de EPA/DHA ficou evidente nas
imagens da Figura 10, quando se observou significativa abundância de debris a
partir de 24 horas de tratamento. A morte celular foi total bastante precocemente.
56
Figura 4: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da linhagem
MDA-MB-231 controle negativo (meio de cultura e veículo hexano na concentração de 200µL), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24 poços.
57
Figura 5: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da linhagem
MDA-MB-231 tratada com EPA/DHA na concentração de 200uM, nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24 poços.
58
Figura 6: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da linhagem MCF-
7 controle negativo (apenas meio de cultura), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular 5X103 na placa de 24 poços.
59
Figura 7: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da linhagem MCF-7
controle negativo (meio de cultura e veículo hexano na concentração de 200µM), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24 poços.
60
Figura 8: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da
linhagem MCF-7 tratada com EPA/DHA na concentração de 200uM, nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24 poços.
61
Figura 9: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da linhagem
SKBR-3 controle negativo (apenas meio de cultura), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24 poços.
62
Figura 10: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da linhagem SKBR-3 controle negativo (meio de cultura e veículo hexano na concentração de 200µM), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular 5X103 na placa de 24 poços.
63
Figura 11: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da linhagem
SKBR-3 tratada com EPA/DHA na concentração de 200uM, nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24 poços.
64
Embora tenham sempre sido utilizadas células que não receberam veículo,
como um dos controles, todas as comparações foram feitas com base na diferença
observada entre o tratamento com os ácidos graxos e o tratamento com o veículo.
Aqui temos uma análise descritiva, pois devido ao grande número de variáveis
testadas inicialmente e a impossibilidade de se fazer tal experimento em placa de 96
poços, este experimento foi feito apenas em triplicata, impedindo análise estatística
confiável.
No caso de MDA-MB-231, nas figuras 11 e 12, observa-se nos gráficos que
EPA/DHA já exerceu efeito inibitório de proliferação na menor concentração, porém
tardiamente. Quando a concentração passou de 50 para 100 e 200μM, o efeito foi
evidenciado mais precocemente. Até o quinto dia de tratamento, pareceu não haver
diferença entre controle e tratado. No caso do ácido linoleico conjugando, CLA, o
efeito foi observado apenas para as concentrações maiores e houve inibição de
proliferação para a concentração de 200μM, mas não morte total, pois permaneceu
o mesmo número de células que inicialmente plaqueado. O ácido linolênico exerceu
um efeito muito semelhante ao de CLA e o ácido linoleico também exerceu efeito
inibidor de proliferação.
65
Figura 12: Efeito do tratamento com EPA/DHA e CLA nas concentrações de 50µM, 100µM e 200µM, em placas de 24 poços, sobre a curva de crescimento da linhagem celular MDA-MB-231, nos 5 pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.
66
Figura 13: Efeito do tratamento com ácido linolênico e linoleico nas concentrações de 50µM, 100µM e
200µM, em placas de 24 poços, sobre a curva de crescimento da linhagem celular MDA-MB-231, nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.
67
No caso da linhagem MCF-7, nas figuras 13 e 14, observa-se inibição de
proliferação para EPA/DHA, que se tornou mais precoce com o aumento da
concentração, a concentração mais alta induzindo abundante morte celular e
inibição de proliferação para CLA apenas na maior concentração, o mesmo padrão
sendo observado quando ácido linolênico foi usado. O ácido linoleico não exerceu
efeito inibidor sobre MCF-7.
68
Figura 14: Efeito do tratamento com EPA/DHA e CLA nas concentrações de 50µM, 100µM e
200µM, em placa de 24 poços sobre a curva de crescimento da linhagem celular MCF-7, nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.
69
Figura 15: Efeito do tratamento com ácido linolênico e linoleico nas concentrações de 50µM, 100µM e 200µM, em placas de 24 poços, sobre a curva de crescimento da linhagem celular MCF-7 nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.
70
No caso da linhagem SKBR-3, nas figuras 15 e 16, observa-se efeito do
veículo inibindo proliferação, mas um efeito de EPA/DHA bastante superior ao do
veículo, provocando a morte de todas as células já nos primeiros dias e nas
menores concentrações. Esta célula se mostrou resistente ao efeito de CLA e
também de ácido linoleico, mas foi sensível ao ácido linolênico, porém não tanto
quanto para EPA/DHA.
71
Figura 16: Efeito do tratamento com EPA/DHA e CLA nas concentrações de 50µM, 100µM e
200µM, em placas de 24 poços, sobre a curva de crescimento da linhagem celular SKBR-3 nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.
72
Figura 17: Efeito do tratamento com ácido linolênico e linoleico nas concentrações de 50µM,
100µM e 200µM, em placas de 24 poços, sobre a curva de crescimento da linhagem celular SKBR-3 nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.
73
4.4 Tabelas comparativas do efeito do tratamento com ácidos graxos
sobre diferentes linhagens celulares.
Com o objetivo de facilitar a visualização dos resultados, foram construídas
tabelas (tabelas 1, 2, 3 e 4), que mostram o comportamento de cada linhagem
celular, em cada momento do tratamento, para um ácido graxo específico em uma
concentração específica. O símbolo (+) indica que não houve inibição de proliferação
e o símbolo (-) indica que houve inibição de proliferação, em relação ao controle
negativo (veículo).
Estes resultados refletem a análise descritiva da triplicata de experimentos
feita e a observação visual tanto dos gráficos, quanto das culturas, que foram
cuidadosamente feitas durante a coleta de pontos para a curva de crescimento.
Através destas tabelas, foi possível avaliar de forma comparativa o efeito de
cada ácido graxo, em cada concentração diferente, em cada uma das linhagens
celulares testadas.
Estas tabelas permitiram visualizar de modo comparativo que a linhagem
MDA-MB-231 sofreu inibição de proliferação por EPA/DHA apenas tardiamente (dias
7 e 9) e nas maiores concentrações (100 e 200μM), o mesmo acontecendo com CLA
e ácido linolênico. Apenas o ácido linoleico inibiu sua proliferação mais
precocemente (d5), para a concentração de 200μM.
A linhagem MCF-7 sofreu inibição de proliferação por EPA/DHA apenas
tardiamente (dias 7 e 9), mas já a partir da menor concentração (50μM) e foi
sensível a CLA e ácido linolênico apenas na concentração de 200μM. Na
concentração de 100μM, a inibição de proliferação foi bem pequena nos dias 7 e 9
para CLA e ácido linolênico, sendo resistente ao ácido linoleico em todas as
concentrações testadas.
A linhagem SKBR-3 foi extremamente sensível ao EPA/DHA, já a partir de
50μM, sensível ao ácido linolênico nos dias 7 e 9 para a menor concentração e já no
primeiro dia para as concentrações de 100 e 200μM, mas foi resistente ao efeito de
CLA e ácido linoleico nas três concentrações.
Por outro lado, fizemos a análise ao contrário e observa-se nas tabelas que
EPA/DHA inibiram as três linhagens celulares, o ácido linolênico também inibiu as
três linhagens, CLA inibiu MDA-MB-231 e MCF-7, mas não inibiu SKBR-3, e o ácido
74
linoleico inibiu apenas a linhagem MDA-MB-231, sendo que este último resultado, foi
observado novamente em uma quadruplicata independente, que pode ser vista na
figura 17.
Tabela 1: Compilação de dados dos gráficos acima e das imagens microscópicas
das culturas celulares durante a coleta dos pontos da curva de crescimento das linhagens especificadas em diferentes condições de tratamento com EPA/DHA. A classificação de proliferação normal (+) ou inibida (-) foi feita com base na comparação com o controle negativo (veículo).
EPA/DHA - 50µM (0,5µL)
1º Dia 3º Dia 5º Dia 7º Dia 9º Dia
MDA-MB-231 + + + + +
MCF-7 + + + + -
SKBR-3 - - - - -
EPA/DHA - 100µM (1µL)
1º Dia 3º Dia 5º Dia 7º Dia 9º Dia
MDA-MB-231 + + + + -
MCF-7 + + + - -
SKBR-3 - - - - -
EPA/DHA - 200µM (2µL)
1º Dia 3º Dia 5º Dia 7º Dia 9º Dia
MDA-MB-231 + + + - -
MCF-7 + + + - -
SKBR-3 - - - - -
75
Tabela 2: Compilação de dados dos gráficos acima e das imagens microscópicas
das culturas celulares durante a coleta dos pontos da curva de crescimento das linhagens especificadas em diferentes condições de tratamento com CLA. A classificação de proliferação normal (+) ou inibida (-) foi feita com base na comparação com o controle negativo (veículo). (+*) indica que foi testado novamente no experimento da figura 17 e se mostrou negativo.
CLA - 50µM (0,5µL)
1º Dia 3º Dia 5º Dia 7º Dia 9º Dia
MDA-MB-231 + + + + +
MCF-7 + + + + +
SKBR-3 + + + + +
CLA - 100µM (1µL)
1º Dia 3º Dia 5º Dia 7º Dia 9º Dia
MDA-MB-231 + + + - -
MCF-7 + + + - +*
SKBR-3 + + + + +
CLA - 200µM (2µL)
1º Dia 3º Dia 5º Dia 7º Dia 9º Dia
MDA-MB-231 + + + - -
MCF-7 + + + - -
SKBR-3 + + + + +
76
Tabela 3: Compilação de dados dos gráficos acima e das imagens microscópicas
das culturas celulares durante a coleta dos pontos da curva de crescimento das linhagens especificadas em diferentes condições de tratamento com ácido linolênico. A classificação de proliferação normal (+) ou inibida (-) foi feita com base na comparação com o controle negativo (veículo). (+*) indica que foi testado novamente no experimento da figura 17 e se mostrou negativo.
Ácido Linolênico - 50µM (0,5µL)
1º Dia 3º Dia 5º Dia 7º Dia 9º Dia
MDA-MB-231 + + + + +
MCF-7 + + + + +
SKBR-3 + + + - -
Ácido Linolênico - 100µM (1µL)
1º Dia 3º Dia 5º Dia 7º Dia 9º Dia
MDA-MB-231 + + + - -
MCF-7 + + + - +*
SKBR-3 - - - - -
Ácido Linolênico - 200µM (2µL)
1º Dia 3º Dia 5º Dia 7º Dia 9º Dia
MDA-MB-231 + + + - -
MCF-7 + + + - -
SKBR-3 - - - - -
77
Tabela 4: Compilação de dados dos gráficos acima e das imagens microscópicas
das culturas celulares durante a coleta dos pontos da curva de crescimento das linhagens especificadas em diferentes condições de tratamento com ácido linoleico. A classificação de proliferação normal (+) ou inibida (-) foi feita com base na comparação com o controle negativo (veículo).
Ácido Linoleico - 50µM (0,5µL)
1º Dia 3º Dia 5º Dia 7º Dia 9º Dia
MDA-MB-231 + + + + -
MCF-7 + + + + +
SKBR-3 + + + + +
Ácido Linoleico – 100µM (1µL)
1º Dia 3º Dia 5º Dia 7º Dia 9º Dia
MDA-MB-231 + + + + -
MCF-7 + + + + +
SKBR-3 + + + + +
Ácido Linoleico - 200µM (2µL)
1º Dia 3º Dia 5º Dia 7º Dia 9º Dia
MDA-MB-231 + + - - -
MCF-7 + + + + +
SKBR-3 + + + + +
Para confirmar alguns pontos que deixaram dúvida, pois houve inibição no dia
7 e não houve no dia 9, por exemplo, o que seria impossível, foi feita uma
quadruplicata específica destes e de seus controles, porém, como a diferença de
proliferação entre as condições não era muito grande numericamente, não foi
possível obter diferença estatisticamente significante para todas as condições
testadas, mas para algumas, embora os gráficos e a análise microscópica indiquem
a inibição de proliferação. Observe na figura 16, uma amostra deste experimento
feito em quadruplicata para alguns pontos de interesse.
78
Figura 18: Análise em quadruplicata de alguns pontos da curva de crescimento, para confirmar o efeito inibitório de ácidos
graxos específicos em tempos definidos de tratamento, para as linhagens celulares indicadas. Nas figuras “a” e “b”, observa-se diferença estatisticamente significante em relação ao efeito de ácido linolênico e CLA 100µM, no dia 9, para a linhagem MCF-7. Nas figuras c e d, embora se observe uma tendência de inibição exercida por ácido linolênico e linoleico 50µM no dia 9, para a linhagem MDA-MB-231, esta diferença não é estatisticamente significante.
79
4.5. Viabilidade Celular
Este ensaio foi realizado em triplicata. O ensaio foi feito em placa de 96
poços, em todas as condições apresentadas nos gráficos abaixo. A análise
estatística foi feita por ANOVA de duas vias, seguida por um pós-teste de
Bonferroni.
Foi feito o tratamento por 24 horas com os referidos ácidos graxos e
controles, após as células terem sido carenciadas, com 0,2% de soro bovino fetal
por 24 horas, para se observar o efeito agudo do tratamento com cada ácido. O
controle com o qual todos os tratamentos foram comparados para a análise
estatística foram as células mantidas pelo mesmo tempo em meio de cultura
contendo apenas veículo. Alterações da atividade metabólica das células foram
vistas precocemente, ao final de 24h de tratamento.
Na concentração de 50μM dos ácidos graxos notou-se uma tendência, que foi
exacerbada na concentração de 100μM. Em 24 horas, EPA/DHA aumentou a
viabilidade de MDA-MB-231 e MCF-7, enquanto diminui a de SKBR-3. CLA apenas
inibiu a viabilidade de SKBR-3, ácido linolênico aumentou a viabilidade de MCF-7 e
diminui de SKBR-3, enquanto ácido linoleico não exerceu nenhum efeito sobre
nenhuma das três linhagens.
80
Figura 19: Efeito dos ácidos graxos sobre a viabilidade celular das linhagens MDA-MB-231,
MCF-7, e SKBR-3 pelo ensaio de MTT. Análise estatistica feita por ANOVA de duas vias.
81
4.6 Experimento de “scratch” para análise do potencial de migração das
células
Este ensaio é bastante simples e permitiu inferir sobre a capacidade
migratória das células, através da observação da sua habilidade de repovoar uma
região que foi depletada de células fisicamente por raspagem da placa. No caso do
controle negativo, após 4 dias em cultura, sempre houve o desaparecimento da
região raspada, por confluência celular de 100%, ou até antes do quarto dia. Quando
as linhagens celulares foram tratadas com os ácidos graxos, existiu inibição deste
repovoamento, com exceção do ácido linoleico, como pode ser visto nas tabelas 5,
6, 7 e 8. A seguinte escala foi utilizada para indicar o comportamento observado, em
comparação com o controle negativo (veículo) e a Figura 19 mostra como o
repovoamento foi observado ao microscópio, para a linhagem MDA-MB-231. Este
experimento não foi realizado para a linhagem celular SKBR-3, por problemas
técnicos. Restringimos a análise para a linhagem representante dos tumores luminal
A e triplo-negativos.
Os resultados mostraram que houve inibição de repovoamento da área
depletada nas duas linhagens testadas, quando os ácidos graxos EPA/DHA, CLA e
linolênico foram usados, mas não para o ácido linoleico, que gerou confluência de
100% para as duas linhagens testadas. O maior grau de inibição foi observado para
EPA/DHA na concentração de 200μM.
82
(-) Dia do corte, canais depletados de células, por raspagem; (+) Baixa densidade celular na área raspada, menos de 20% de confluência; (++) Média densidade celular na área raspada, em torno de 20 a 30% de confluência; (+++) Alta densidade celular na área raspada, em torno de 30 a 70% de confluência; (--) Morte celular generalizada induzida pelo tratamento;
Tabela 5: Efeito de EPA/DHA sobre a densidade celular da área submetida à
raspagem no dia zero
EPA/DHA - 50µM (0,5µL)
1º Dia 2º Dia 3º Dia 4º Dia
MCF-7 - + ++ ++
MDA-MB-231 - ++ ++ +++
EPA/DHA - 100µM (1µL)
1º Dia 2º Dia 3º Dia 4º Dia
MCF-7 - + ++ ++
MDA-MB-231 - + ++ +++
EPA/DHA - 200µM (2µL)
1º Dia 2º Dia 3º Dia 4º Dia
MCF-7 - + + ++
MDA-MB-231 - + + --
Tabela 6: Efeito de CLA sobre a densidade celular da área submetida à raspagem
no dia zero
CLA - 50µM (0,5µL)
1º Dia 2º Dia 3º Dia 4º Dia
MCF-7 - + ++ ++
MDA-MB-231 - ++ ++ +++
CLA - 100µM (1µL)
1º Dia 2º Dia 3º Dia 4º Dia
MCF-7 - + ++ ++
MDA-MB-231 - ++ ++ +++
CLA - 200µM (2µL)
1º Dia 2º Dia 3º Dia 4º Dia
MCF-7 - + ++ ++
MDA-MB-231 - ++ ++ ++
83
Tabela 7: Efeito de ácido linolênico sobre a densidade celular da área submetida à
raspagem no dia zero
Ácido Linolênico - 50µM (0,5µL)
1º Dia 2º Dia 3º Dia 4º Dia
MCF-7 - + ++ ++
MDA-MB-231 - ++ ++ +++
Ácido Linolênico - 100µM (1µL)
1º Dia 2º Dia 3º Dia 4º Dia
MCF-7 - + ++ ++
MDA-MB-231 - + ++ ++
Ácido Linolênico - 200µM (2µL)
1º Dia 2º Dia 3º Dia 4º Dia
MCF-7 - + + ++
MDA-MB-231 - ++ ++ ++
Tabela 8: Efeito de ácido linoleico sobre a densidade celular da área submetida à raspagem no dia zero
Ácido Linoleico - 50µM (0,5µL)
1º Dia 2º Dia
Tratamento 3º Dia
Tratamento 4º Dia
Tratamento
MCF-7 - ++ +++ +++
MDA-MB-231 - +++ +++ +++
Ácido Linoleico - 100µM (1µL)
1º Dia 2º Dia 3º Dia 4º Dia
MCF-7 - ++ +++ confluência
100%
MDA-MB-231 - ++ confluência
100% confluência
100%
Ácido Linoleico - 200µM (2µL)
1º Dia 2º Dia 3º Dia 4º Dia
MCF-7 - ++ +++ confluência
100%
MDA-MB-231 - ++ confluência
100% confluência
100%
84
Figura 20: Experimento de “scratch” mostrando potencial de migração celular da linhagem MDA-MB-231, crescendo
na presença de ácidos graxos específicos. Microscopia de luz; Aumento de 10X.
85
4.7 Crescimento celular em suspensão de agarose
Este experimento é o experimento in vitro mais próximo do ensaio de
tumorigênese em animal, pois avalia a capacidade de uma única célula formar
colônias, em suspensão.
Primeiramente foi feito um ensaio com as diferentes linhagens celulares para
avaliar sua capacidade de crescimento em suspensão de agarose, partindo-se de
inóculos contendo 103 células e 104 células, como pode ser visto na figura 20 e na
tabela 9.
A linhagem MCF-7 formou colônias em suspensão, as quais foram vistas
macroscopicamente, enquanto as linhagens MDA-MB-231 e SKBR-3 formaram
colônias diminutas, observáveis ao microscópio, mesmo após 4 semanas de cultivo.
86
Figura 21: Células sem nenhum tipo de tratamento ou veículo (hexano e albumina), crescendo em suspensão de agarose, ao longo de três semanas. Microscópio óptico invertido; Aumento 10X.
87
Em uma segunda etapa, os controles foram repetidos e as linhagens MCF-7,
MDA-MB-231 e SKBR-3 foram tratadas com os diferentes ácidos graxos, nas
concentrações de 50µM, 100µM e 200µM. Os resultados se encontram nas tabelas
9, 10, 11 e 12. Nestas tabelas, avaliamos se houve ou não formação de colônias na
presença dos referidos ácidos graxos.
Os descritores utilizados foram os seguintes: (-) morte celular, evidenciado
por grande quantidade de debris; (+) até 50 células = micro-colônias; (++) 50-200
Tabela 9: Efeito de EPA/DHA sobre o crescimento celular de MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7, em suspensão de agarose
EPA /DHA - 50µM (0,5µL)
DMEM/RPMI Veículo EPA/DHA
MDA-MB-231 ++ ++ ++
SKBR-3 + + +
MCF-7 ++++ +++ +++
EPA /DHA - 100µM (1,0µL)
DMEM/RPMI Veículo EPA/DHA
MDA-MB-231 ++ + +
SKBR-3 + + +
MCF-7 ++++ +++ ++
EPA /DHA - 200µM (2,0µL)
DMEM/RPMI Veículo EPA/DHA
MDA-MB-231 ++ ++ -
SKBR-3 + ++ -
MCF-7 ++++ ++ ++
88
Tabela 10: Efeito de CLA sobre o crescimento celular de MDA-MB-231, SKBR-3 e
MCF-7, em suspensão de agarose CLA - 50µM (0,5µL)
DMEM/RPMI Veículo CLA
MDA-MB-231 ++ ++ ++
SKBR-3 + + ++
MCF-7 ++++ +++ +++
CLA - 100µM (1,0µL)
DMEM/RPMI Veículo CLA
MDA-MB-231 ++ + ++
SKBR-3 + + +
MCF-7 ++++ +++ +++
CLA - 200µM (2,0µL)
DMEM/RPMI Veículo CLA
MDA-MB-231 ++ ++ +
SKBR-3 + ++ -
MCF-7 ++++ ++ ++
Tabela 11: Efeito de ácido linolênico sobre o crescimento celular de MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7, em suspensão de agarose
Ácido Linolênico - 50µM (0,5µL)
DMEM/RPMI Veículo Ácido Linolênico
MDA-MB-231 ++ ++ ++
SKBR-3 + + +
MCF-7 ++++ +++ +++
Ácido Linolênico - 100µM (1,0µL)
DMEM/RPMI Veículo Ácido Linolênico
MDA-MB-231 ++ + ++
SKBR-3 + + +
MCF-7 ++++ +++ ++
Ácido Linolênico - 200µM (2,0µL)
DMEM/RPMI Veículo Ácido Linolênico
MDA-MB-231 ++ ++ ++
SKBR-3 + ++ +
MCF-7 ++++ ++ +++
89
Tabela 12: Efeito de ácido linoleico sobre o crescimento celular de MDA-MB-231,
SKBR-3 e MCF-7, em suspensão de agarose Ácido Linoleico - 50µM (0,5µL)
DMEM/RPMI Veículo Albumina Ácido Linoleico
MDA-MB-231 ++ ++ ++
SKBR-3 + + +
MCF-7 ++++ ++++ +++
Ácido Linoleico - 100µM (1,0µL)
DMEM/RPMI Veículo Albumina Ácido Linoleico
MDA-MB-231 ++ + ++
SKBR-3 + + +
MCF-7 ++++ ++++ +++
Ácido Linoleico - 200µM (2,0µL)
DMEM/RPMI Veículo Albumina Ácido Linoleico
MDA-MB-231 ++ ++ ++
SKBR-3 + ++ -
MCF-7 ++++ +++ +++
EPA/DHA inibiu a formação de colônias de MDA-MB-231 e SKBR-3 na
concentração de 200μM, mas não inibiu MCF-7. CLA inibiu apenas a formação de
colônias de SKBR-3, também na concentração de 200μM, ácido linolênico não
exerceu efeito inibitório sobre nenhuma linhagem e ácido linoleico inibiu SKBR-3 na
concentração de 200μM.
Apenas a concentração mais alta dos ácidos graxos inibiu formação de
colônias e nenhuma condição inibiu a formação de colônias de MCF-7.
4.8 Análise da expressão de superóxido dismutase-2 (SOD2), por
imunocitoquímica
Este experimento foi feito para avaliar o nível de expressão de SOD2 nas
linhagens celulares tratadas com os ácidos graxos na concentração de 100μM por
24 horas e seus controles. Esta análise foi feita em duplicata e foram quantificados
quatro campos de cada uma das duplicatas para análise comparativa com o veículo.
A significância estatística foi analisada através de ANOVA de uma via, seguido por
um pós-teste de Bonferroni. Por limitações técnicas, não foi possível fazer a mesma
análise para a linhagem SKBR-3, o que está em andamento.
90
Figura 22: Análise da expressão de SOD2 nas células tumorais MDA-MB-231 e MCF-7, tratadas com os referidos ácidos graxos na concentração de 100µM por 24 horas. Análise estatística foi feita por ANOVA de uma via. A quantificação de 4 campos diferentes foi feita utilizando o sistema MCID de análise de imagens (Interfocus Europe, UK).
91
O ácido linolênico diminuiu a expressão de SOD2 para MCF-7, enquanto
praticamente dobrou a expressão da enzima para MDA-MB-231. CLA exerceu o
mesmo efeito sobre MDA-MB-231, mas não atuou sobre a expressão de SOD2 em
MCF-7. O ácido linoleico diminuiu a expressão de SOD2 para MCF-7. De um modo
geral, todos os tratamentos aumentaram a expressão de SOD2 em MDA-MB-231 e
os ácidos linolênico e linoleico diminuíram a expressão de SOD2 em MCF-7, mas
apenas as alterações acima foram estatisticamente significantes.
Nas figuras 22 e 23 estão imagens que foram utilizadas para a
quantificação e geração dos gráficos acima.
92
Figura 23: Imunocitoquímica evidenciando a expressão de SOD2 nos diferentes tratamentos, para a linhagem MDA-MB-231. Todos os ácidos foram utilizados na concentração de 100μM, por 24 horas. Painel ilustrativo da quantificação mostrada anteriormente. Imagens obtidas através do software MCID. Aumento 40X.
93
Figura 24: Imunocitoquímica evidenciando a expressão de SOD2 nos diferentes tratamentos, para a linhagem MCF-7. Todos os ácidos foram utilizados na concentração de 100μM, por 24 horas. Painel ilustrativo da quantificação mostrada anteriormente. Imagens obtidas através do software MCID. Aumento 40X.
94
4.9 Análise da atividade de superóxido dismutase
O método de quantificação da atividade de SOD não diferencia o tipo de
superóxido dismutase, logo os resultados foram globais para a atividade geral
de SOD nas células. Para padronização do método de análise de atividade de
SOD, foi feita a quantificação relativa desta atividade, em diferentes linhagens,
incluindo as três de nosso interesse, sem serem submetidas a nenhum
tratamento, o que pode ser visto na Figura 24.
Houve grande diferença na atividade de SOD entre as linhagens
testadas. A que mais se destacou foi a linhagem MDA-MB-435, correspondente
a um melanoma humano, metastático em mama.
Atividade de SOD
Bra
nco
Con
trol
MD
A-M
B-2
31
MD
A-M
B-4
35
MC
F-7
Hs-5
78t
SK
BR
-3
-50
0
50
100
150*
* p < 0.05
Po
rcen
tag
em
(%
)
Figura 25: Padronização da atividade de SOD nas linhagens celulares MDA-MB-231, MDA-MB-435, MCF-7, Hs-578t e SKBR-3. Análise estatística feita por ANOVA de uma via.
Após padronização, as linhagens celulares MDA-MB-231, MCF-7 e
SKBR-3 foram então tratadas com os ácidos graxos EPA/DHA, CLA, linolênico
e linoleico e seus respectivos controles (hexano ou albumina) na concentração
de 100µM, por 24 horas, e os resultados podem ser vistos nas figuras 25 e 26.
A quantificação foi realizada em triplicata para análise comparativa com o
95
veículo. A significância estatística foi analisada através de ANOVA de uma via,
seguida por um pós-teste de Bonferroni.
Na linhagem MDA-MB-231 apenas ocorreu alteração da atividade de
SOD quando CLA ou ácido linoleico foram utilizados, promovendo aumento
significante desta atividade. Na linhagem MCF-7, ao contrário, ocorreu
diminuição da atividade de SOD, mas quando ácido linolênico foi utilizado.
Atividade SOD
MDA-M
B-2
31
MCF-7
SKBR-3
0.00
0.05
0.10
0.15Branco
Controle
Hexano - 100M (1L)
EPA/DHA - 100M (1L)
CLA - 100M (1L)
Ácido Linolênico - 100M
(1L)
*
* p < 0,05*** p < 0,001
***
*
Ab
so
rbân
cia
(%
)
Figura 26: Quantificação da atividade de SOD, sob efeito do tratamento com
ácidos graxos EPA/DHA, CLA e linolênico na concentração de 100µM por 24 horas. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.
96
Atividade SOD
MDA-M
B-2
31
MCF-7
SKBR-3
0.00
0.05
0.10
0.15Branco
Controle
Albumina - 100M (1uL)***
Ácido Linoleico - 100M
(1L)
*** p < 0.001
Ab
so
rbân
cia
(%
)
Figura 27: Quantificação da atividade de SOD, sob efeito do tratamento com
ácido linoleico na concentração de 100µM, por 24 horas. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.
4.10 – Produção de Espécies Reativas de Oxigênio (EROS)
Para o ensaio foi feita a quantificação de formação de EROS nas
linhagens MDA-MB-231, MCF-7 e SKBR-3 tratadas com os ácidos graxos
EPA/DHA, CLA, linolênico e linoleico na concentração de 100µM e 200µM nos
períodos de tempos especificados nos gráficos de 27 a 36.
Na linhagem MDA-MB-231 ocorreu a diminuição significativa dos níveis
de formação de EROS, quando tratada com os ácidos EPA/DHA, CLA e ácido
linoleico, na concentração de 100µM no período de 24 horas (figuras 27 e 28) e
na concentração de 200µM, no período de 2 horas para o ácido linoleico (figura
30).
97
EROS - MDA-MB-231 - 100M - 24 e 48 horas
24 H
oras
48 H
oras
0
50
100
150Veículo Hexano - 100M (1L)
EPA/DHA - 100M (1L)
CLA - 100M (1L)
Ácido Linolênico - 100M (1L)
*
* p < 0.05
*
DH
E-c
élu
las p
osit
ivas (
%)
Figura 28: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem MDA-MB-
231 tratada com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico no período de 24 e 48 horas. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.
MDA-MB-231 - Ácido Linoleico - 100uM 24 e 48 horas
DH
E -
24 h
ora
s
DH
E -
48 h
ora
s
0
20
40
60
80
100
Veículo Albumina - 100uM
Ácido Linoleico - 100uM
**
** p < 0.01
DH
E-c
élu
las
po
sit
iva
s (
%)
Figura 29: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem MDA-MB-
231 tratada com ácido linoleico no período de 24 e 48 horas. Análise estatística
feita por ANOVA de duas vias.
98
MDA-MB-231 - 200M - 2 horas
2 hora
s
0
50
100
150Veículo Hexano - 200M (2L)
EPA/DHA - 200M (2L)
CLA - 200M (2L)
Ácido Linolênico - 200M (2L)
p > 0.05
DH
E-c
élu
las p
osit
ivas (
%)
Figura 30: Ensaio de quantificação relativa de EROS nas linhagens MDA-MB-
231, tratada com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico no período de 2 horas.
Análise estatística feita por ANOVA de uma via.
EROS - MDA-MB-231 - 200M - 2 horas
2 hora
s
0
50
100
150Veículo Albumina - 200M (2L)
Ácido Linoleico - 200M (2L)
* p < 0.05
*
DH
E-c
élu
las
po
sit
iva
s (
%)
Figura 31: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem MDA-MB-
231, tratada com ácido linoleico por 2 horas. Análise estatística feita por Teste Mann Whitney U.
99
EROS - MCF-7 - 100M - 24 horas
24 h
oras
0
50
100
150
Veículo Hexano - 100M (1L)
EPA/DHA - 100M (1L)
CLA - 100M (1L)
Ácido Linolênico - 100M (1L)
p > 0.05
DH
E-c
élu
las p
os
itiv
as (
%)
Figura 32: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem MCF-7, tratada com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico por 24 horas. Análise estatística feita por ANOVA de uma via.
EROS - MCF-7 - 100M - 24 horas
24 h
oras
0
50
100
150
Veículo Albumina - 100M (1L)
Ácido Linoleico 100M (1L)
p > 0.05
DH
E-c
élu
las p
osit
ivas (
%)
Figura 33: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem MCF-7, tratada com ácido linoleico por 24 horas. Análise estatística feita por Teste Mann Whitney U.
100
EROS - SKBR-3 - 100M - 24 horas
24 h
oras
0
50
100
150
Veículo Hexano - 100M (1L)
EPA/DHA - 100M (1L)
CLA - 100M (1L)
Ácido Linolênico - 100M (1L)
p > 0.05
DH
E-c
élu
las p
osit
ivas (
%)
Figura 34: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem SKBR-3, tratada com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico por 24 horas. Análise estatística feita por ANOVA de uma via.
EROS - SKBR-3 - 100M - 24 horas
24 h
oras
0
50
100
150Veículo Albumina 100M (1L)
Ácido Linoleico 100M (1L)
p > 0.05
DH
E-c
élu
las p
osit
ivas (
%)
Figura 35: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem SKBR-3,
tratada com ácido linoleico por 24 horas. Análise estatística feita por Teste Mann Whitney U.
101
EROS - SKBR-3 - 200M - 2 horas
2 hora
s
0
50
100
150Veículo Hexano - 200M (2L)
EPA/DHA - 200M (2L)
CLA - 200M (2L)
Ácido Linolênico - 200M (2L)
p > 0.05
DH
E-c
élu
las
po
sit
iva
s (
%)
Figura 36: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem SKBR-3,
tratada com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico por 2 horas. Análise estatística feita por ANOVA de uma via.
EROS - SKBR-3 - 200M - 2 horas
2 hora
s
0
50
100
150Veículo Albumina - 200M (2L)
Ácido Linoleico - 200M (2L)
p > 0.05
DH
E-c
élu
las
po
sit
iva
s (
%)
Figura 37: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem SKBR-3, tratada com ácido linoleico por 2 horas. Análise estatística feita por Teste Mann Whitney U.
102
4.11 Análise de Morte Celular
O ensaio de apoptose foi feito com as linhagens MDA-MB-231 e SKBR-
3. O experimento com a linhagem MCF-7 e também em outras condições está
em andamento. A linhagem MDA-MB-231 foi tratada com os quatro ácidos
graxos, na concentração de 100μM, por oito dias e 200μM por 24 horas, que
avaliou o efeito tardio e agudo. O mesmo foi feito com as células SKBR-3. Ao
final do tratamento, as células foram marcadas com Anexina V e Iodeto de
Propídeo (IP) na concentração de 100µg/mL e procedeu-se à leitura em
citometro de fluxo (colaboração UNIFESP).
Os dados foram apresentados como % de apoptose e % de necrose
secundária, que na verdade é a fase final da apoptose e embora se apresente
como necrose, é um indicador da taxa de apoptose, pois foi iniciada por esta.
No caso de MD-MBA-231, podemos ver que a taxa de necrose
secundária foi alta, para o tratamento com EPA/DHA e CLA. Ácido linoleico não
induziu apoptose nestas células e nem o ácido linoleico.
A análise da resposta aguda de MDA-MB-231 aos ácidos graxos, isto é,
o efeito do tratamento com 200μM destes ácidos por 24 horas, mostrou que só
houve indução de apoptose para o tratamento com CLA.
No caso das células SKBR-3, não houve aumento de apoptose em
nenhuma das condições testadas.
103
Morte Celular - MDA-MB-231 - 100M - 8 dias
Apopto
se
Nec
rose
Sec
undária
0
20
40
60
80
Veículo Hexano - 100M (1L)
EPA/DHA - 100M (1L)
CLA - 100M (1L)
Ácido Linolênico - 100M (1L)
**
* p < 0.05** p < 0.01
*** p < 0.001
**
****
Po
rce
nta
ge
m (
%)
Figura 38: Ensaio de morte celular da linhagem MDA-MB-231, tratada com os ácidos graxos EPA/DHA, CLA e Ácido linolênico por 8 dias na concentração de 100µM. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.
Morte Celular - MDA-MB-231 - 100uM - 8 dias
Apopto
se
Nec
rose
Sec
undária
0
20
40
60
80
Veículo Albumina - 100M (1L)
Ácido Linoléico - 100M (1L)
p > 0.05
Po
rcen
tag
em
(%
)
Figura 39: Ensaio de morte celular da linhagem MDA-MB-231, tratada com o
ácido graxo linoleico com albumina por 8 dias na concentração de 100µM. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.
104
Morte Celular - MDA-MB-231 - 200M - 24 horas
Apopto
se
Nec
rose
Sec
undária
0
20
40
60
80
Veículo Hexano - 200M (2L)
EPA/DHA - 200uM (2L)
CLA - 200uM (2L)
Ácido Linolênico - 200M (2L)
**
** p < 0.01
Po
rcen
tag
em
(%
)
Figura 40: Ensaio de morte celular da linhagem MDA-MB-231, tratada com os ácidos graxos EPA/DHA, CLA e linolênico por 24 horas na concentração de 200µM. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.
Morte Celular - MDA-MB-231 - 200M - 24 horas
Apopto
se
Nec
rose
Sec
undária
0
20
40
60
80
Veículo Albumina - 200M (2L)
Ácido Linoléico - 200M (2L)
p > 0.05
Po
rcen
tag
em
(%
)
Figura 41: Ensaio de morte celular da linhagem MDA-MB-231, tratada com o ácido linoleico por 24 horas na concentração de 200µM. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.
105
Apoptose - SKBR-3 - 8 dias
Apopto
se
Nec
rose
Sec
undária
0
20
40
60
80
Veículo Hexano - 100M (1L)
Veículo Hexano - 200M (2L)
CLA - 100M (1L)
CLA - 200M (2L)
**
** p < 0.001
Po
rce
nta
ge
m (
%)
Figura 42: Ensaio de morte celular da linhagem SKBR-3, tratada com o ácido graxo CLA por 8 dias nas concentrações de 100µM e 200µM. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.
Apoptose - SKBR-3 - 24 horas
Apopto
se
Nec
rose
Sec
undária
0
20
40
60
80
Veículo Hexano - 100M (1L)
Veículo Hexano - 200M (2L)
EPA/DHA - 100M (1L)
Ácido Linolênico - 100M (1L)
EPA/DHA - 200M (2L)
Ácido Linolênico - 200M (2L)
p > 0.05
Po
rce
nta
ge
m (
%)
Figura 43: Ensaio de morte celular da linhagem SKBR-3, tratada com os
ácidos graxos EPA/DHA e linolênico por 24 horas nas concentrações de 100µM
e 200µM. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.
106
Tabela 13: Análise global dos efeitos dos quatro ácidos graxos testados, sobre
a expressão de SOD2, atividade de SOD, formação de EROS e crescimento celular das três principais linhagens celulares testadas.
4.12 Análise do efeito dos ácidos graxos descritos sobre a curva de
crescimento das linhagens Hs578t e MDA-MB-435
Estas linhagens celulares foram obtidas e estabelecidas em cultura a
partir de tumores na mama, porém não correspondem a carcinomas clássicos
encontrados na clínica, como os descritos inicialmente. A linhagem Hs578t
corresponde a um sarcoma da mama e a MDA-MB-435 a um melanoma
metastático em mama. As duas são comercializadas através da ATCC
(American Type Culture Collection)
A linhagem Hs578t é derivada de carcinoma de glândula mamária
humana de uma mulher caucasiana de 74 anos. Trata-se de uma hipotriploidia
com um número modal de 59. Não expressa os receptores de estrógeno,
progesterona e fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER-2). Tipo
celular fibroblastóide. Morfologia celular epitelial. Cresce em monocamada e
em suspensão, em meio semissólido, mas não é tumorigênica em
camundongos nude [86]. Cultivado em DMEM suplementado cm 10% de soro
bovino fetal.
107
A linhagem MDA-MB-435 foi primeiramente classificada como derivada
de uma efusão pleural de adenocarcinoma de humano, mas foi recentemente
reclassificada como melanócito/melanoma, obtido de uma mulher caucasiana
de 31 anos de idade, após estudos de expressão por microarray. Apresenta
aneuploidia número modal de cromossomos = 56, variação = 55 a 62).
Expressa o gene da tubulina e actina e negativo para o receptor de estrógeno e
progesterona e HER-2. Essa linhagem celular não é tumorigênica em animais,
mas cresce em suspensão em meio semissólido. Tipo celular melanócito,
melanoma, com morfologia celular fusiforme. Cultivada em RPMI suplementado
com 10% d soro bovino fetal [87; 88].
Nas figuras abaixo, observa-se o efeito dos diferentes ácidos graxos em
diferentes concentrações, na curva de crescimento em substrato sólido para
estas duas linhagens.
EPA/DHA exerceram efeito inibitório de proliferação sobre Hs578-t a
partir do sétimo e nono dia de tratamento, em concentrações de 100 e 200μM.
O mesmo padrão foi apresentado por CLA. O ácido linolênico apenas inibiu
proliferação destas células na maior concentração, o mesmo acontecendo com
ácido linoleico.
Para a linhagem MDA-MB-435 o padrão de resposta a EPA/DHA e CLA
foi o mesmo, porém CLA inibiu proliferação a partir da menor concentração. O
ácido linolênico inibiu sua proliferação tardiamente para as três concentrações
testadas e o ácido linoleico inibiu proliferação nos dias 7 e 9 nas concentrações
de 100 e 200μM.
108
Figura 44: Efeito do tratamento com ácidos graxos EPA/DHA e CLA em diferentes concentrações (50µM, 100µM e 200µM), sobre a curva de crescimento da linhagem Hs578-t, em placa de 24 poços nos 5 pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.
109
Figura 45: Efeito dos ácidos linolênico e linoleico em diferentes concentrações (50µM, 100µM e 200µM), sobre a curva de crescimento da linhagem Hs578-t em placa de 24 poços nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.
110
Figura 46: Efeito do tratamento com ácidos EPA/DHA e CLA em diferentes concentrações (50µM, 100µM e 200µM), sobre a curva de crescimento da linhagem MDA-MB-435 em placa de 24 poços nos pontos de coletas 1, 3, 5, 7 e 9 dias.
111
Figura 47: Efeito do tratamento com ácidos linolênico e linoleico em diferentes concentrações (50µM, 100µM e 200µM), sobre a curva de crescimento da linhagem MDA-MB-435 em placa de 24 poços nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.
112
5. Discussão
O objetivo fundamental deste trabalho foi avaliar comparativamente a
ação de ácidos graxos da família ômega-3 e 6, tanto precursores quanto
derivados, sobre a proliferação de células tumorais de mama, estabelecidas
como linhagem. Há na literatura uma grande quantidade de dados acerca dos
efeitos de alguns ácidos graxos sobre algumas linhagens celulares, no entanto
faltam trabalhos que comparem diferentes linhagens e diferentes ácidos graxos
em diferentes concentrações e que permitam análise comparativa e conclusões
mais globais sobre quais ácidos exercem inibição de proliferação e quais
células são suscetíveis a estas e quais não.
Desta maneira, os ácidos graxos escolhidos foram o ácido linolênico,
representando o precursor dietético dos ácidos graxos da família ômega-3, o
ácido linoleico, representando o precursor dietético dos ácidos graxos da
família ômega-6 e dois derivados destes, que são produzidos em animais, após
metabolização dos primeiros, que são o CLA, um derivado da família ômega-6,
encontrado em laticínios e carnes de animais ruminantes, e uma mistura de
EPA e DHA, que são encontrados nos óleos de peixes, sendo derivados do
ácido linolênico, da família ômega-3.
Utilizando estes quatro conjuntos de moléculas, podemos verificar se os
efeitos de inibição de proliferação estão restritos a uma família ômega
exclusivamente, se os precursores destas famílias já exercem tal efeito e se as
moléculas metabolizadas em animais apresentam mais ou menos efeito do que
os precursores. Embora os ácidos linoleico e linolênico sejam preparações
puras, quando se fala em CLA, a forma conjugada do ácido linoleico, temos
uma mistura de isômeros, majoritariamente composta pelos t10c12 e c9t11.
A opção por utilizar uma mistura de EPA/DHA, e não testar cada um
destes separadamente, foi baseada no objetivo de verificar o efeito da
composição que está presente na dieta ou suplementação. Estes são os dois
principais ácidos graxos presentes no óleo de peixe, encontrado
comercialmente em cápsulas como suplemento alimentar. As preparações de
óleo de peixe contem EPA/DHA na proporção de 46mM de DHA para cada
100mM de EPA, logo quando nos referimos a EPA/DHA sendo testado nas
113
concentrações de 50µM, 100µM e 200µM, esta concentração se refere a EPA e
o DHA está presente na proporção acima referida sendo utilizado em conjunto.
A escolha da faixa de concentração utilizada foi feita com base no
descrito na literatura e em testes prévios realizados por nós. Procuramos
utilizar um intervalo de concentração que incluísse uma concentração mais
baixa, que geralmente não provoca efeito (50µM), uma concentração
intermediária, em que o efeito varia de acordo com a linhagem e o tempo de
tratamento (100µM) e uma concentração mais alta em que os efeitos são
observados de maneira mais aguda (200µM).
O veículo foi escolhido empiricamente, com base no seu potencial de
solubilização dos ácidos graxos, entre opções já descritas na literatura como
tendo sido usadas em ensaios celulares. Testamos o etanol e o hexano.
Etanol, embora menos tóxico, teve que ser descartado, pois havia formação de
micelas de ácidos graxos (gotículas de óleo, visíveis a olho nu), após o tubo ser
deixado em repouso. Procurou-se preparar estoques em hexano em
concentração tal, que o volume adicionado às culturas fosse baixo, para evitar
ação tóxica do solvente. Em todos os experimentos, o veículo puro, em mesmo
volume que o usado na preparação dos ácidos, foi utilizado como controle
negativo e todas as comparações foram sempre feitas em relação a esta
condição, embora sempre tivéssemos mantido também células sem nenhum
tratamento como um segundo controle.
A escolha das linhagens celulares foi feita com base na necessidade de
avaliar o efeito dos ácidos graxos sobre células tumorais molecularmente e
comportamentalmente distintas, mas de relevância clínica. Deste modo, foram
escolhidas três linhagens de carcinoma mamário, especificamente as linhagens
MCF-7, representante dos tumores luminais A, os menos agressivos
encontrados clinicamente e que por serem positivos para o receptor de
estrógeno, podem ser tratados por hormonioterapia; a linhagem SKBR-3,
representante dos tumores positivos para o receptor HER-2, que apresentam
como recurso terapêutico o uso do trastuzumab; e a linhagem MDA-MB-231,
representando os tumores triplo-negativos, por não expressarem nenhum dos
receptores comumente testados (Her-2, estrógeno e progesterona),
representando os tumores mais difíceis do ponto de vista de tratamento.
114
Como o volume de análise foi muito grande, dado que foram testadas
muitas condições e os experimentos de Biologia Celular são sempre muito
lentos, devido à necessidade de expansão das células, nos concentramos em
comparar os efeitos dos ácidos graxos nas linhagens MCF-7 e MDA-MB-231,
que representam os dois opostos neste espectro de tumores encontrados na
clínica. Quando possível e de interesse, avaliamos também os efeitos sobre
SKBR-3.
Uma das opções feitas precocemente no desenho detes projeto foi a de
não inclusão de uma linhagem representando células mamárias normais, como
é o caso da linhagem MCF-10A, por três motivos principais: se é uma linhagem
estabelecida e que se mantem em cultura, assumimos que não é um bom
representante de célula normal; existe uma série de trabalhos publicados
mostrando que os ácidos graxos tanto das famílias ômega-3 quanto ômega-6,
não exercem efeito nenhum sobre a taxa de proliferação de células normais,
mas apenas das tumorais e; as necessidades de suplementação do meio de
cultura para as células MCF-10A, como a presença de estrógeno e EGF, além
de outros fatores de crescimento, tornaria a análise comparativa mais difícil de
ser feita, pois partiríamos de condições diferentes. Como o objetivo deste
trabalho foi verificar se os diferentes ácidos graxos atuam de forma diferente
sobre diferentes linhagens celulares provenientes de tumores, não julgamos
ser necessário comparar os efeitos com os evidenciados em uma linhagem
“normal” e pudemos utilizar as próprias linhagens diferentes como controle
umas das outras.
Dado que a MCF-7, expressa receptor de estrógeno e progesterona,
mas não Her-2; a MDA-MB-231 é negativa para os três receptores clássicos e
a SKBR-3 é negativa para os receptores de estrógeno e progesterona, mas é
positiva para o receptor Her-2 temos um painel variado que permite saber se o
espectro de ação dos ácidos graxos é célula-específico ou não, permitindo
talvez até fazer-se alguma inferência sobre o suposto mecanismo de ação
destes.
Em paralelo, foi feita uma análise do efeito dos ácidos graxos sobre o
padrão de proliferação de duas linhagens celulares derivadas de tumores
encontrados na mama, mas que não são os carcinomas clássicos. Uma delas,
a MDA-MB-435, corresponde a um melanoma mestastático e a outra, Hs578t,
115
corresponde a um sarcoma de mama. O objetivo foi apenas observar se em
células não-carcinoma, o padrão de inibição de proliferação é diferente.
O interesse inicial era verificar se estas preparações de ácidos graxos
influenciariam a curva de crescimento das linhagens celulares testadas. Para
padronizar o ensaio, foi feita uma curva de crescimento com cada uma das
linhagens, sem nenhum tratamento, em duas concentrações celulares distintas
e em duas placas distintas. Esta padronização deve ser feita, para evitar que
antes do termino do experimento, haja morte das células por terem atingido a
densidade de saturação. Definidos estes parâmetros, de modo a ter uma
cultura crescendo exponencialmente até o nono dia de tratamento.
Embora seja um experimento trivial, não foi simples testar tantas
condições. Ensaios que fizemos inicialmente para acompanhar o
comportamento das células na presença dos ácidos graxos até o quinto dia de
tratamento, durante a padronização, não resultaram em efeitos observáveis, o
que nos fez estender o ensaio até o nono dia.
A dificuldade de se testar tantas condições ao mesmo tempo (4 ácidos
graxos, 3 concentrações, 3 linhagens) é o que faz com que geralmente estes
ensaios de proliferação sejam feitos em placas de 96 poços, pelo método de
redução de MTT. No entanto, aqui optamos por fazer curvas de crescimento,
pois o ensaio de MTT tão comumente encontrado, não reflete necessariamente
proliferação, uma vez que ele mede atividade metabólica e esta pode variar
nas células, especialmente quando tratadas com ácidos graxos.
O ensaio de MTT mede diretamente a viabilidade celular, através da
redução do MTT, um sal de coloração amarelada e solúvel em água, a
formazan, um sal de coloração arroxeada e insolúvel, o que é mediado por
enzimas celulares, provavelmente mitocondriais. A atividade metabólica da
célula pode variar ao longo do ensaio e gerar um viés de interpretação. Se o
tratamento aumenta a atividade metabólica das células, tem-se a falsa
impressão de que houve proliferação e se o tratamento diminui a atividade
celular, mas deixa as células quiescentes, observa-se o resultado falso-positivo
para morte celular. Tal viés pode ser visto nos nossos resultados, quando
alguns ácidos graxos aumentam a redução de MTT nas primeiras horas de
tratamento, o que não é um reflexo real da taxa de proliferação.
116
Neste trabalho pudemos observar que embora encontrássemos os
mesmos resultados descritos na literatura no ensaio de MTT, inclusive com
significância estatística, quando assume-se inibição de proliferação, esta
inibição ainda não havia acontecido, quando as células foram contadas,
mostrando que uma série de informações e conclusões já obtidas nesta área,
estão equivocadas.
A vantagem do ensaio de MTT, que justifica sua preferência, é ser
realizado em placas de 96 poços, facilmente permitindo que triplicatas ou mais,
sejam feitas em todos os ensaios. No ensaio de construção das curvas de
crescimento, dado o volume de variáveis e a necessidade de se fazer
minimamente em placas de 24 poços, foi possível fazer apenas triplicatas, o
que permitiu apresentar os dados como média e desvio padrão, mas sem
análise estatística, uma vez que é um pressuposto teórico que ANOVA só pode
ser feita quando há no mínimo seis observações distintas de um mesmo
fenômeno. Dado que nossa intenção era apenas uma análise descritiva e não
uma confirmação matemática, para este tipo de resultado, consideramos que
esta análise foi suficiente.
Todos os pontos de interesse, onde houve dúvida na análise inicial,
foram repetidos em quadruplicata, para confirmação. Este foi um trabalho
inicial, de verificação do perfil de ação dos ácidos graxos. A partir destes dados
iniciais, novos projetos estão sendo executados, para exploração e
aprofundamento de informações obtidas neste.
O volume de contagem de células na realização destes experimentos foi
bastante grande e em nosso laboratório dispunhamos apenas de câmara de
Neubauer para a contagem manual. Para tanto, as contagens foram todas
feitas desta maneira, logo após a tripsinização, e as suspensões celulares
foram fixadas em formalina, para uma eventual recontagem confirmatória, caso
necessário. Como controle, algumas das suspensões foram levadas até o
NUCEL (Núcleo de Terapia Celular e Molecular), da USP (Universidade de São
Paulo), para confirmação da contagem em método automatizado, utilizando um
citômetro. Dado que os resultados obtidos nesta comparação foram bastante
reprodutíveis, optamos por proceder a contagem de maneira manual em nosso
laboratório.
117
As curvas de crescimento obtidas a partir de ensaio feito em placas de
24 poços, conforme padronização apresentada nas figuras 1 e 2, e os
resultados do tratamento, foram representados em gráficos de linha (número
de células x dias de tratamento), nas figuras de 11 a 16, mas para facilitar a
comparação do efeito dos diferentes ácidos graxos, nas diferentes
concentrações, sobre as diferentes linhagens, foram elaboradas as tabelas, de
1 a 4, evidenciando os efeitos apresentados nos gráficos e também
confirmados pela visualização da densidade celular na microscopia.
Com base nestas tabelas, pudemos verificar que o efeito dos ácidos
graxos é ácido-dependente, linhagem-depedente, concentração-dependente e
tempo-dependente. Deste modo, é praticamente impossível propor um
mecanismo único para justificar a inibição de proliferação induzida por estes
ácidos graxos.
Quando pensamos em linhagem, observamos que MDA-MB-231 é
inibida tardiamente pelas maiores concentrações de EPA/DHA, CLA e ácido
linolênico, mas já é inibida precocemente pela maior concentração de ácido
linoleico.
A linhagem MCF-7 é resistente ao ácido linoleico, mais sensível do que
MDA-MB-231 ao EPA/DHA, já que sofre inibição mesmo na menor
concentração e só responde a CLA e ácido linolênico na maior concentração.
A linhagem SKBR-3 é resistente a CLA e ácido linoleico, mas ultra-
sensível a EPA/DHA e responsiva a ácido linolênico.
Este padrão de resposta é muito interessante, pois classicamente o
ácido linoleico é usado nos trabalhos como controle, pois este não altera o
resultado de MTT, conforme observamos aqui também. No entanto, embora
não tenha ocorrido alteração do resultado de MTT quando este ácido foi usado
em MDA-MB-231, ele exerceu importante efeito inibitório sobre esta linhagem,
que representa o tumor mais agressivo entre os três testados e para a qual não
há recursos terapêuticos específicos.
Diversos trabalhos, assumindo o potencial inibitório de ácidos graxos,
com base no resultado de MTT, utilizam CLA como inibidor e ácido linoleico
como controle, para caracterizar o mecanismo de inibição, ou simplesmente
não estudam o efeito de ácido linoleico, já assumido como não tendo efeito [24,
43, 55].
118
Embora a célula SKBR-3 tenha aparentemente sofrido efeito do hexano,
usado como veículo dos ácidos graxos, não houve alteranativa, além de
minimizar o efeito, usando o menor volume possível deste veículo. As
comparações foram todas feitas com este controle e de maneira muito
interessante, embora estas células sejam sensíveis ao veículo e tão sensíveis
a EPA/DHA, são resistentes a CLA, um clássico inibidor de proliferação e que
também foi dissolvido no mesmo veículo. Trabalhos já publicados, como o de
Flowers et al 89, mostram o efeito de CLA inibindo expressão de HER-2 na
superfície de SKBR-3, mas se baseiam na inibição de proliferação observada
por MTT.
Observamos então que a linhagem MDA-MB-231 é sensível tanto a
ômega-3 quanto ômega-6, assim como a MCF-7, mas a linhagem SKBR-3 é
sensível a ômega-3 e resistente a ômega-6.
Esta afirmação, no entanto, é complexa de ser feita, pois quimicamente
CLA pertence à família ômega-6, mas fisiologicamente pode ser classificado
como um não-6, o que faz com que se comporte como se fosse ômega-3. Isto
se dá porque estruturalmente ele é um membro da família ômega-6, mas ele
não gera seus clássicos derivados, como o ácido araquidônico. Logo, ao se
inserir na membrana das células, na posição C-2 dos triglicerídeos, ele não
fornece substrato para a formação das prostaglandinas clássicas. Da mesma
maneira se comportam os membros da família ômega-3. Deste modo,
podemos dizer que a linhagem SKBR-3 é resistente a um ácido graxo que é
estruturalmente ômega-6, mas funcionalmente ômega-3, e inferir que o
mecanismo de competição com ácido araquidônico na membrana, não é o
mecanismo que justifica sua inibição de proliferação. Logo, sua proliferação
não deve ser dependente de prostaglandinas, mecanismo clássico e esperado,
que foi descrito na introdução [58,59,60].
Quando fazemos a análise a partir dos ácidos graxos, observamos que
EPA/DHA inibe as três linhagens celulares; CLA apenas não inibe SKBR-3 e o
ácido linoleico inibe apenas a linhagem MDA-MB-231. Embora esta ação de
ácido linoleico sobre MDA-MB-231 seja inesperada, o mesmo padrão inibitório
foi observado na quadruplicata que fizemos dos pontos de interesse. Todos os
pontos que geraram dúvidas foram repetidos em quadruplicata e estes que
estão aqui descritos nas tabelas são os já retestados. Dependendo do grau de
119
inibição, a quadruplicata foi suficiente para obter resultados estatisticamente
significantes, mas em alguns casos, mesmo em quadruplicata, observa-se a
tendência, porém sem significância estatística.
Com o objetivo de observar o efeito destes ácidos graxos sobre
parâmetros celulares que vão além de proliferação, foi realizado o experimento
de scratch e o experimento de crescimento em suspensão de agarose. O
experimento de scratch consiste em remover uma área de células da placa,
após confluência de 70% e tratar as células por quatro dias para observar a
capacidade destas células de se redistribuirem pela área que foi raspada.
Neste ensaio foram utilizadas apenas as linhagens MCF-7 e MDA-MB-231 e
observou-se que ácido linolênico, CLA e EPA/DHA, inibem o deslocamento das
células, podendo chegar a 100% no caso de EPA/DHA, porém ácido linoleico,
em quatro dias de tratamento, não inibiu esta redistribuição, permitindo que
100% de confluência fosse atingido na área raspada.
Na curva de crescimento observamos efeitos inibitórios de ácido linoleico
sobre MDA-MB-231 apenas a partir do quinto dia e neste experimento de
scratch, não foi possível ver nenhum efeito, pois ele se estende até o quarto dia
apenas. No entanto, é possível concluir que inicialmente, nos três primeiros
dias, este efeito inibitório não está presente.
Uma das hipóteses é que os ácidos graxos, independente de tipo, são
mais susceptíveis a lipoperoxidação, podendo iniciar o processo de lesão da
membrana e inibição de proliferação quando o fenômeno ocorre. Este
fenômeno pode iniciar tardiamente, quando as células são mantidas por mais
tempo e é muito difícil de ser evitado nas condições de cultivo celular.
O ensaio de crescimento em suspensão de agarose é utilizado para
mimetizar a capacidade de colonização de uma área a partir de uma única
célula, sem necessidade de ancoragem, já que essa está impedida, devido à
camada de agarose que separa as células do fundo da placa e representa, in
vitro, o experimento mais próximo possível do ensaio de tumorigênese em
animal utilizando camundongos nude. Células normais necessitam de
ancoragem a uma matriz sólida para se manterem vivas e proliferarem. As
células normais, mantidas em suspensão, sem esta possibilidade de
ancoragem, porque existe uma matriz semi-sólida que impede sua adesão a
uma superfície, sofrem um processo especial de morte, chamado de anoikia.
120
As células tumorais, especialmente as mais invasivas, não sofrem anoikia e
formam colônias em suspensão, derivadas das diversas mitoses da célula
inicial.
Nas condições que testamos, as células MCF-7 formam colônias
macroscópicas, e as MDA-MB-231 e SKBR-3 formam microcolônias
microscópicas, mas que ficam viáveis por quatro semanas ou mais, permitindo
análise.
Pudemos observar que EPA/DHA inibiu a formação de colônias para
MDA-MB-231 e SKBR-3, mas não inibiu MCF-7. CLA inibiu a formação de
colônias de SKBR-3, assim como ácido linoleico, e ácido linolênico não exerceu
efeito inibitório.
Foi interessante observar que as inibições ocorreram apenas para a
maior concentração (200μM) dos ácidos graxos, o que nos faz pensar que
como se trata de uma cultura tridimensional, o volume e concentração de ácido
graxo testado deveria ser maior, para refletir o que é visto em monocamada,
onde a célula fica em contato com muito mais ácido graxo, por ser
bidimensional. Acreditamos que o efeito de CLA sobre SKBR-3, observado na
maior concentração e tardiamente, se dá porque as células ficam em
experimentação por 4 semanas, logo trata-se de um efeito tardio. De qualquer
maneira, estes experimentos, que foram realizados em duplicata, estão sendo
repetidos, para confirmação.
Um dos mecanismos propostos para a ação dos ácidos graxos testados
inibirem a proliferação celular, é através da indução da formação de espécies
reativas de oxigênio, por mecanismo pouco compreendido. É sabido que
quando as células são tratadas com estes tipos de ácidos graxos livres, esses
passam a ser incorporados nas suas membranas, cuja composição é então,
alterada, alterando a fisiologia celular. A maneira como a alteração desta
composição induz a formação de radicais livres e consequentemente a morte
celular por apoptose, ainda não foi detalhado, embora estes sejam geralmente
os mecanismos de inibição de proliferação propostos.
Com o objetivo de avaliar se o tratamento com os ácidos graxos altera o
equilíbrio redox das diferentes linhagens celulares, três experimentos foram
propostos. Um deles, é a avaliação da expressão de superóxido dismutase 2
(SOD-2), e foi feito por imunocitoquímica. Outro ensaio proposto é o da
121
quantificação da atividade de SOD e o outro, de quantificação de EROS. Um
compilado destes resultados se encontra na tabela 13.
No ensaio de expressão de SOD-2, há uma grande dificuldade que é o
fato de qualquer manipulação já alterar a expressão da enzima, como pode ser
visto nos próprios controles. É inevitável isso acontecer, mas comparando os
tratamentos com os controles, observamos que houve diminuição da expressão
em MCF-7 tratada com ácido linolênico e linoleico e aumento da expressão da
mesma em MDA-MB-231 quando tratada com EPA/DHA, CLA e ácido
linolênico, mas não linoleico. Esta resposta de expressão de superóxido
dismutase pode estar diretamente relacionada com a resposta de inibição de
proliferação das células frente ao tratamento com os ácidos. A capacidade de
aumentar expressão e atividade de SOD e portanto, não produzir EROS/ENOS
ou eliminar rapidamente o produzido, pode ser a chave que garante resposta
diferencial das células e na literatura é abordado como o possível motivo pelo
qual células normais não sofrem efeito inibitório com os ácidos graxos, mas
células tumorais sim[90]. Não podemos deixar de citar que o efeito é
quantitativo, já que uma pequena quantidade de EROS funciona como estímulo
para proliferação celular e o excesso tem o efeito oposto, gerando morte
celular. No entanto, é difícil fazer esta análise de maneira simplificada, uma vez
que existem outras enzimas com papel semelhante a SOD que participam do
equilíbrio redox.
Seria de se esperar que as células que sofrem inibição de proliferação
pelo tratamento com os ácidos graxos, tivessem diminuição da expressão de
SOD, mas não foi isso que foi visto em todos os casos. Funcionou para MCF-7
com ácido linolênico, mas não para os outros. Se o mecanismo de morte é
induzido por EROS, então uma diminuição de expressão de SOD deixaria as
células mais susceptíveis.
Para verificar se além da expressão de SOD2, havia alguma alteração
na atividade de SOD presente, foi feito o ensaio de atividade enzimática e de
maneira interessante, encontramos que em MCF-7, além da expressão estar
diminuida, a atividade global de SOD está diminuida. Os dados se confirmam
um ao outro, mostrando que realmente estas células, ao serem tratadas com
ácido linolênico têm menor potencial de detoxificação via superóxido dismutase
e sofrem inibição de proliferação. O mesmo acontece para estas células
122
quando tratadas com EPA/DHA, no entanto a linhagem MDA-MB-231
apresenta aumento de atividade de SOD quando tratada com CLA e com ácido
linoleico. Ambos ácidos inibem proliferação e provavelmente geram mais
EROS nas células, tendo aumento de atividade de SOD como resposta.
Aparentemente, se o mecanismo de morte é por formação de EROS, o
aumento observado de atividade de SOD não é suficiente para debelar os
EROS formados.
Avaliando a formação de EROS, que esperava-se estar aumentada em
diversas situações, observamos que ao contrário, ela está diminuida nestas e
ai fica a dúvida do que é causa e do que é consequência. Por exemplo, houve
aumento da atividade de SOD quando MDA-MB-231 foi tratada com CLA e
ácido linoleico e esperáva-se que este aumento de SOD fosse devido a um
aumento de EROS, mas ao contrário, encontramos menor quantidade de
EROS nestas. Nossa hipótese é que em um momento muito inicial, EROS se
eleva, estimula a produção de SOD, que então elimina estes EROS. Tudo é
uma questão de cinética e nossa observação foi tardia, pós atividade de SOD.
Esta hipótese se confirma quando no gráfico da figura 29, observamos
nível normal de EROS para estas células, quando tratadas com EPA/DHA por
2 horas. CLA mostra diminuição nesta fase aguda, mas provavelmente porque
seu efeito é mais agudo ainda. Neste período de 2 horas, ainda não foi possível
a SOD atuar para eliminar todos os EROS formados pelo tratamento com ácido
linoleico (figura 30), o que ocorre quando o tratamento persiste por 24 horas
(figura 28).
O ácido linolênico diminui a atividade de SOD em MCF-7, mas não se
observa alteração do conteúdos de EROS nestas células, pelo menos em 24
horas.
Não observamos diferenças estatisticamente significantes na produção
de EROS ou atividade de SOD quando a linhagem SKBR-3 foi analisada,
embora pareça haver uma tendência de aumento de formação de EROS
quando EPA/DHA são usados, justamente quando morte acontece
intensamente para estas células.
Aparentemente, para compreender melhor o papel da formação de
EROS e ativação de enzimas como SOD nestas células e seu envolvimento
com proliferação celular, teremos que fazer um estudo mais detalhado,
123
incluindo uma cinética, com múltiplas medições, pois as alterações são muito
rápidas e fica difícil avaliar se as alterações de expressão e atividade de SOD,
bem como de formação de EROS são causa ou consequência umas das outras
e de que forma influenciam o processo de morte celular.
É descrito na literatura que embora se associe da formação de espécies
reativas de oxigênio com a morte celular induzida pelos ácidos graxos, em
algumas linhagens, como MCF-7 e MDA-MB-231, o uso de antioxidantes, como
vitamina E e C, não reverteu o processo de morte celular induzido por
EPA/DHA, evidenciando que o mecanismo é mais complexo ou novamente,
que tudo é uma questão de cinética [55, 66].
Para completar esta série de dados foi realizado também um ensaio de
apoptose, pelo método da detecção de anexina V e iodeto de propídeo. O
iodeto de propídeo mostra se houve morte celular e a anexina V mostra se esta
morte foi por apoptose ou necrose, uma vez que durante o processo de
apoptose, alterações específicas da membrana celular fazem esta se ligar à
anexina V marcada com fluorescência, o que pode ser facimente observado em
um microscópio de fluorescência ou citômetro de fluxo.
No resultado de morte celular, pudemos observar que na linhagem MDA-
MB-231 ocorre morte por apoptose quando tratada com EPA/DHA na
concentração de 100µM e também CLA quando tratada por 8 dias, ou mesmo
24 horas na concentração de 200μM.
Para a linhagem SKBR-3, houve um problema, pois como esta é
bastante sensível, ao avaliar se havia apoptose ou não nas condições
descritas, a grande maioria das células já estava morta, na forma de debris e
não foi contada. As células restantes eram na sua maioria resistentes a
apoptose. Este ajuste cinético terá que ser levado em consideração para refinar
este experimento.
De qualquer modo, observamos que em todas as situações em que
ocorreu morte, esta se deu por apoptose ou necrose secundária à apoptose,
mas não necrose primária. Portanto, este experimento contribuiu para ilustrar
que o mecanismo de morte celular impresso pelos ácidos graxos é realmente a
apoptose.
Seria intuitivo observar apoptose no tratamento de MDA-MB-231 com
ácido linoleico, mas ao mesmo tempo, se observarmos a curva de crescimento
124
destas células para a concentração de 200μM, notamos que nunca chega a
haver proliferação celular. Ao longo dos 9 dias de tratamento a concentração
de células é a mesma, mostrando um potencial efeito citostático e não
citotóxico. Pensando desta maneira, é aceitável pensar que o mecanismo de
parada de crescimento não se dá por morte celular, mas por inibição de
proliferação e quiescência, o que só pode ser afirmado se experimentos mais
detalhados forem feitos, o que é de grande interesse, já que esta linhagem
representa um tumor órfão de tratamento específico na clínica e que
apresentou esta resposta a ácido linoleico que nenhuma outra linhagem
apresenta.
De maneira interesante, as linhagens de melanoma (MDA-MB-435) e
sarcoma (Hs578t), também embora não fossem carcinoma, também
apresentaram um padrão de inibição de proliferação muito semelhante ao dos
carcinomas testados, inclusive sofrendo inibição de proliferação quando ácido
linoleico foi utilizado. É surpreendente que justamente os tumores mais
agressivos apresentem resposta ao ácido linoleico que geralmente é usado
como controle. Uma possibilidade é que sendo precursor de ácido
araquidônico, este disponibilize mais substrato para ciclooxigenase (COX) e
lipoxigenase (LOX), gerando um ambiente abundante em prostaglandinas,
leucotrienos e tromboxanas, que podem exercer diversos efeitos sobre as
células, inclusive parada de crescimento. É nítido nas curvas de proliferação
celular, que enquanto EPA/DHA induzem morte celular e chega-se ao final com
menos células do que foi plaqueado, o ácido linoleico apenas inibe proliferação,
a população celular flutuando em número ao redor do que foi plaqueado.
O mecanismo mais lógico para explicar a alteração da fisiologia celular
frente ao tratamento com ácidos graxos é a modificação da composição
lipídica, disponibilizando diferentes ácidos graxos no citoplasma durante
processos em que há ativação de fosfolipase A2 (PLA2), por exemplo, como os
processos inflamatórios. Comumente, a ação de PLA2 libera intracelularmente
o ácido araquidônico, da família ômega-6 e que serve de substrato
principalmente para as enzimas COXe LOX, produzindo uma série de
prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanas, com importante papel fisiológico.
Na medida em que temos ácido linolênico, CLA, linoleico, ou EPA e DHA
substituindo o carbono 2 dos triglicerídeos de membrana, a ação da PLA2 não
125
disponibiliza o substrato clássico das enzimas COX e LOX e altera-se a
resposta celular frente a estimulos inflamatórios ou mesmo proliferativos. Há
trabalhos citados aqui na introdução sobre as resolvinas, mostrando que as
células tratadas com ácidos graxos específicos ficam resistentes a agentes pró-
inflamatórios, não produzindo prostaglandinas específicas.
Entre os estudos disponibilizados na literatura, em que se estuda um
ácido graxo ou outro, em uma linhagem ou outra, encontramos estudos que
testaram EPA e DHA isoladamente sobre MDA-MB-231 e observaram inibição
de proliferação da ordem de 30-40%, com diminuição de fosforilação de Akt e
indução de atividade de caspase[55]. Bocca et al.,[42] mostrou que CLA inibe
proliferação de MCF-7 e MDA-MB-231, também diminuindo a atividade da via
de MAPK e induzindo apoptose.
Amarù et al., [44] testou isômeros isolados de CLA (t10c12 e c9t11) e
observou que ambos têm efeito inibitório de proliferação sobre MCF-7, mas que
t10c12 inibe mais fortemente. Huot et al.,[91] tratou MCF-7 com CLA e observou
diminuição da expressão de caveolina-1, tentando correlacionar a inibição de
proliferação com alteração na disponibilização de receptores na membrana.
Há poucos trabalhos abrangentes sobre o efeito global destes ácidos
graxos sobre linhagens celulares tumorais ou não. Em 2011, Magdolon et al.,
[92] fez o proteoma de células normais NIH-3T3 tratadas e não tratadas com
alguns destes, mas não obteve resultados conclusivos. Dos poucos resultados,
nenhum foi confirmado por Western Blot. Este trabalho, relativamente recente,
mostra que o mecanismo ainda está sendo explorado em diversos trabalhos.
Os trabalhos mais convincentes de que o efeito anti-proliferativo é
dependente de formação de EROS/ENOS são aqueles em que a inibição
exercida pelos ácidos graxos é bloqueada ao se tratar as células
concomitantemente com antioxidantes, como vitamina C e E [92].
Um trabalho muito interessante de 2004, de Ding et al.,[93] , mostra que
a resposta a DHA de várias linhagens tumorais diferentes é diversa, algumas
apresentando IC50 de 5,2µM e outras IC50 de 300µM. Nestas mais sensíveis
houve grande aumento de EROS e diminuição da expressão de SOD, não
acontecendo o mesmo nas mais resistentes. Ao manipular geneticamente a
expressão de SOD nas células, foi possível inverter estes comportamentos.
126
Estudos em animais, contribuem para este cenário fragmentado,
elucidando alguns pontos interessantes. Por exemplo, Hardman em 1997 [94]
demonstrou que ao injetar MDA-MB-231 em camundongos, induzir
lipoperoxidação com ferro e tratar os animais com óleo de peixe, rico em
EPA/DHA, há diminuição significativa do tumor, por ação dos ácidos graxos,
mesmo in vivo, mas nenhum outro tecido é afetado, mostrando a especificidade
da inibição dos ácidos graxos sobre células tumorais, poupando as células
normais.
Este trabalho é apenas o primeiro de muitos que precisam ser realizados
para elucidar o papel dos ácidos graxos como inibidores de proliferação. Sem
estes dados iniciais fica difícil lançar projetos dirigidos por hipóteses, mas
acreditamos que com o término deste, diversas hipóteses a serem exploradas
poderão ser desenhadas.
Os interesses iniciais são aprofundar os estudos da linhagem MDA-MB-
231 que representa um tumor para o qual não há terapia específica. O fato de
estas células terem sido inibidas por todos os ácidos graxos testados, não só
abre possibilidades de exploração terapêutica, como permite inferir que o
mecanismo de ação não é dependente de uma família específica de ácidos
graxos.
Há grande interesse também em profundar os estudos sobre o
mecanismo de ação através do qual os ácidos graxos exercem inibição de
proliferação. No caso da linhagem MDA-MB-231, houve diminuição de
formação de EROS em todos os tratamentos, indicando possível ativação de
enzimas antioxidantes pelos ácidos graxos. No entanto, apenas em algumas
condições a superóxido dismutase foi ativada, indicando que deve haver outras
enzimas ativadas por estas moléculas, como glutationa peroxidase e outras;
A diminuição de EROS provavelmente é um efeito secundário.
Imaginamos que de início, há aumento de formação de EROS, que ativam as
enzimas antioxidantes, gerando o efeito observado. Uma cinética mais
detalhada será realizada para verificar o ponto em que há diminuição da
formação de EROS e quais as enzimas antioxidantes envolvidas no processo.
Por não haver especificidade de família de ácido graxo atuando como
inibidor de proliferação, é possível que o haja vários mecanismos diferentes
envolvidos, inclusive com a possibilidade de que o efeito seja provocado por
127
alterações físico-químicas da membrana celular, por substituição dos ácidos
graxos originais pelos ácidos graxos utilizados no tratamento.
128
6. Conclusões
As curvas de crescimento, tanto em substrato sólido quando em
suspensão de agarose, foram uma maneira eficiente de demonstrar o efeito
dos ácidos graxos sobre o padrão de proliferação de diferentes linhagens
celulares.
A resposta destas células é heterogênea e depende da concentração do
ácido graxo e do tempo de tratamento. Ao contrário do que diz a literatura,
tanto ácidos graxos da família ômega-3 quanto ômega-6 são capazes de inibir
a proliferação celular e tanto os precursores dietéticos quanto os metabolizados
em animal exercem este tipo de efeito.
Observamos também que células com perfis diferentes de expressão de
receptores de superfície respondem de maneira diferente a um mesmo ácido
graxo e que a maior parte das respostas é obtida em tratamentos mais tardios
e nas maiores concentrações de ácidos graxos, embora tenha havido
sensibilidades especificas em que uma determinada linhagem apresentou
efeitos precocemente e em resposta a baixas concentrações dos ácidos
graxos.
Observamos que há alteração do equilíbrio redox, no que diz respeito a
expressão e atividade de SOD e formação de EROS, no entanto, estas
respostas são muito imediatas e para melhor caracterizar o papel deste
mecanismo de controle, outras enzimas, como catalase e glutationa peroxidase
precisam ser analisadas e também em outros tempos de tratamento, para
definir o que é causa e o que é efeito. Algumas condições que induziram
inibição de proliferação não tiveram o reflexo de maior formação de EROS ou
diminuição de expressão e atividade de superóxido dismutase, como seria
esperado.
Observou-se que nos casos em que há morte celular, esta se dá por
apoptose, gerando necrose secundária, mas não necrose diretamente. Em
algumas situações em que houve inibição de proliferação, não foi detectada
apoptose, provavelmente porque as células nunca proliferaram para morrer e
permaneceram em estado de quiescência desde o início do tratamento.
129
Este trabalho foi a base para o desenvolvimento de diversos outros que
se seguirão, agora com melhor direcionamento, para resolver os pontos de
interesse.
Um dos principais interesses advindos desta tese é o aprofundamento
do efeito de ácido linoleico sobre a linhagem MDA-MB-231, como mencionado,
representante de um tumor órfão de tratamento específico, podendo resultar
grande benefício clínico do aprofundamento dos estudos sobre esta linhagem
específica.
Não foi possível desvendar o mecanismo de ação dos ácidos graxos e
nem era o proposto inicialmente, mas foi possível concluir que provavelmente
há múltiplos mecanismos envolvidos, pois nenhum dos possíveis explicaria o
comportamento observado em todas as condições, de maneira global.
130
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