VIT C.docx

JAN9

laporan praktikum HPLC

LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA INSTRUMENPenentuan Kadar Natrium Benzoat, Vitamin C, dan KafeinMenggunakan Instrumen HPLC

Tanggal Praktikum : 28 September 2012

DOSEN PEMBIMBING :Dra, SOJA SITI FATIMAH, Msi

DISUSUN OLEH :KELOMPOK 11HANIK MASFUFATUL 1001114NOVI NURLAELI 1004563VEGA ISMA ZAKIAH 1006336

JURUSAN PENDIDIKAN KIMIAFAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIABANDUNG2012

Tanggal Praktikum :28 September 2012

Judul Praktikum:Penentuan Kadar Natrium Benzoat, Vitamin C, dan KafeinMenggunakan Instrumen HPLC

Tujuan Praktikum:1.Memahami cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif.2.Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual pengoperasian HPLC.3.Dapat menentukan/menghitung kadar zat aditif dalam sampel minuman.

A.DASAR TEORI

Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam kromatografi, campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi. Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan atau gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa partikel-partikel yang diam (tidak bergerak, statisiones). Sehingga akibatnya masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang diam dan cairan atau gas yang membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak (bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential migration) dan dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-komponen yang ada. (Bahti, Husein H. 2011: 4).Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau didalam bahasa Indonesia disebut KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar. Oleh karena itu, dilakukan denganmenggunakan teknik kurva kalibrasi. (Wiji, dkk. 2010 : 17).HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari kebutuhan, keinginan manusia untuk meminimalis pekerjaan, kemampuan teknologi, dan teori untuk memandu pengembangan pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan yang modern bahwa LC (Liquid Chromatography) memiliki kekuatan pemisahan yang sangat ampuh, bahkan untuk komponen-komponen yang berhubungan sangat erat. LC harus ditingkatkan kecepatannya, diotomasasi, dan harus disesuaikan dengan sampel-sampel yang lebih kecil, waktu elusi yang beberapa jam (Underwood, Day. 2002 : 553).HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional dalam hal digunakan bahan pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil berukuran sampai 3-5 m (1m = 10-6m). Sehingga mengharuskan digunakannya tekanan tinggi sampai 20.000 Kpa (200 atmosfir) untuk mengalirkan fasa gerak melalui kolom tersebut.Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil ini bukan sajatelah memperbaiki kecepatan analisis, tapi (dari ini yang lebih penting) ialah telah menghasilkan suatu teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai kelemahan- kelemahan yang diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah, dan perlu pengalaman. Untuk beberapa jenis zat, metode ini kurang sensitif. Selain itu sampel disyaratkan harus stabil dalam larutan.Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu :a)Fase Normal HPLCHPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut nonpolar seperti heksan sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6 mm (dan kemungkinan kurang dari nilai ini) dengan panjang 120 nm-250 nm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Apabila pasangan fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya maka sistem ini disebut HPLC fase normal.b)Fase Balik HPLCPada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam kasus ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi tidak sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fasa diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar akan lebih cepat bergerak melalui kolom. Sedangkan molekul-molekul non polar akan bergerak lambat karena interaksi dengan gugus hidrokarbon.

Gambar fase normal dan fase balik

Terdapat beragai zat aditif yang digunakan oleh produsen makanan dan minuman diantaranya : natrium benzoat, vitamin c, dan kafein untuk masing-masing tujuan tertentu. Ketiga zat aditif tersebut merupakan senyawa yang memiliki sifat kepolaran yang berbeda, dan memiliki gugus kromofor yang menyebabkan senyawa tersebut dapat menyerap sinar UV. Berdasarkan karakteristik senyawa ini memungkinkan dilakukan analisis dengan teknik HPLC yang menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar.Vitamin C atau asam askorbatVitamin berupa kristal putih dengan rumus molekul C6H8O6, larut dalam air dan alkohol, dialam ditemukan dalam buah-buahan dan sayuran, dapat disintesis dari glukosa. Vitamin C merupakan komponen esensial makanan manusia untuk perawatan kulit. Kekurangan vitamin ini dapat menimbulkan sariawan, luka pada gusi, badan kurus, dan anemia. Setiap hari diperluka 70-100 mg.Vitamin C adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa geak polar seperti metanol atau air.

Natrium Benzoat atau natrium benzena karboksilatKristalin tanpa warna atau atau serbuk amorf putih, C6H6COONa. Larutan dalam iar dan sedikit larut dalam etanol. Senyawa ini dibuat melalui reaksi natrium hidroksida dengan asam benzoat dan digunakan dalam industri zat warnadan sebagai pengawet makanan. Zat ini dulu digunakan sebagai antiseptik.

KafeinSuatu alkohol dengan rumus molekul C5H10N4O2. Berupa padatan kristal berwarn aputih dan berasa pahit, ditemukan dalam daun dan biji dari pohin kopi, dalam daun teh, dalam biji kola.

Reservoir PelarutJumlah reservoir pelarut : (1) bisa salah satu atau lebih; berisi pelarut organik seperti heksana, atau air, atau campuran air dan pelarut organik seperti metanol,tergantung kepada apakah kita bekerja menggunakan fasa normal atau fasa terbalik atau metode kromatografilainnya.Bila sistem KCKT dilengkapi dengan alat pencampuran (2) (atau mempunyai lebih dari satu pompa) yang memungkinkan membuat campuran-campuran pelarut dengan komposisi yang diatur dengan bantuan suatu programener, maka diperlukan lebih dari satu reservoir, sistem ini diperlukan untuk melakukan elusi bergradien dimana komposisi pelarut diubah-ubah selama pengelusian.Pelarut fasa gerak dipompa dari reservoir oleh sistem pompa, demikian sehingga campuran pelarut dengan komposisi tertentu dapat mengalir tanpa denyutan (pulseless). Kecepatan aliran dapat diatur antara 0,1 10 mL/menit.Gas yang terlarut dalam pelarut fasa gerak yang digunakanharus dibuang terlebih dahulu (de-gassing), selain itu, pelarut harus di saring dahulu agar bebas dari partikel-partikel kecil yang tidak larut.Pada saluran-saluran pelarut biasanya dipasang saringan (berukuran 2-10 m)untuk mencegah partikel-partikel kecil yang tidak larut tadi, masuk kedalam kolom. Saringan ini harus diganti atau dibersihkan bila terjadi penyumbatan.Diantara jenis-jenis pompa yang paling umum digunakan untuk sistem HPLC adalah jenis pompa isap dan tekan (reciprocating).Pompa isap dan tekan yang sederhana mempunyai kecepatan isap yang tetap. Artinya, waktu yang diperlukan untuk langkah mengisis sama dengan waktu untuk langkah memompa. Pompa seperti ini memerlukan perendam denyutan yang baik. Oleh karena itu, pompa jenis ini umumnya menggunakan dua pengisap yang masing-masing bekerja kebalikan satu dari yang lainnya. Setiap pengisap memppunyai dua katup pengendali.Pelarut diisap ke dalam ruang pengisap melalui katup pemasukkan dan kemudian ditekan ke luar melalui katup pengeluaran. Untuk melakukan elusi bergradien diperlukan dua sistem pompa yang masing-masing mempunyai satu atau dua penghisap. Ada dua macam rancangan utama pompa gradien yaitu pecampuran tekana tinggi yang mempunyai hantaran dua pompa dan pencampuran tekana rendah dengan hantaran satu pompa.Rancangan pompa gradien yang pertama, yakni sistem pencampuran tekanan tinggi, mempunyai dua pompa dan satu pengendali, masing-masing pompa menghantarkan satu sistem pelarut. Fungsi pengendali adalah mengatur kecepatan aliran masing-masing pelarut sesuai dengan komposisi yang diinginkan dan juga berfungsi untuk menjamin terjadinya pengadukan yang baik oleh suatu pengaduk dinamik. Setiap pompa mempunyai dua penghisap dan setiap penghisap mempunyai dua katup. Jenis yang kedua, pompa pembagi bertekanan rendah hanya mempunyai satu penghisap. Untuk melakukan elusi gradien hanya diperlukan satu pompa. Pompa ini mempunyai katup pembagi, tidak mempunyai pengendali gradien.Dengan katup-katup pembagi dimungkinkan untuk membuat suatu campuran terner (tiga jenis pelarut) dengan perbandingan yang diinginkan. Jadi untuk melakukan gradien gradien tidak diperlukan lebih dari satu pompa. Katup-katup pembagi ini dikendalikan oleh suatu microprocessor dan terbuka selama langkah pemasukan pelarut. (Bahti, Husein. H . 2011 : 34-40)

Prinsip kerja instumentasi HPLCHPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada kemampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa organik tapi mampu menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang mempunyai molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik didih yang sangat tinggi seperti polimer.

Cara kerja instumentasi HPLCPrinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

Gambar skema instrumentasi HPLCKomponen-komponen instrumentasi HPLC1.Fasa Gerak

Fasa gerak dari HPLC merupakan zat cair yang disebut eluen atau pelarut. Dalam HPLC fasa gerak selain berfungsi untuk membawa komponen-komponen campuran menuju ke detektor, selain itu juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penetu keberhasilan proses pemisahan. Persyaratan zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak sebagai berikut:a)Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisisb)Zat cair harus murni, untuk menghindari masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogramc)Zat cair harus jernih, untuk meghindari penyumbatan pada kolomd)Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracune)Zat cair tidak kental dan harus sesuai dengan detektor

Fasa gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil. Selain itu adanya gas dalam fasa gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama do pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fasa gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien diguakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol atua campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fasa gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding fase terbalik.

2.KolomKolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tepat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponen. Bergantung keperluannya kolom utama dapat digunakan untuk analisis atau preparatif setiap komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector selain kolom utama dikenal pula kolom pengaman.Kolom utama berisi fasa dian dan jenisnya bervariasi bergantung pada keperluan, misalnya dikenal kolom C8, C-18, cyanopropyl, dan penukar ion. Kolom utama untuk HPLC biasanya berukuran panjang berkisar antara 5-30 cm dan diameter dalam berkisar 4,510 mm.Kolom pengaman (guard coloumn) disebut juga pra-kolom karena letaknya sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek 5 cm dengan diameter 4,6 mm biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran besar dari ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu: menyaring kotoran yang terbawa oleh fasa gerak dan untuk menjenuhkan fasa gerak dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut.Kolom merupakan jantung kromatograf, keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilhan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :a)Kolom analitikGaris tengah dalam 2-6 mm, panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm.

b)Kolom preparatifUmumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar, dan panjang 25-100 cm.

3.Pompa

Pada HPLC, pompa ini berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi dalam metode ini sebagai akibat penggunaan fasa gerak yang berupa zat cair yang akan sukar mengalir dalam kolom yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh karena itu, agar zat cair dapat melewati kolom secara tepat maka dibutuhkan bantuan pompa yang bertekana tinggi. Pompa yang digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan sebagai berikut :a)Menghasilkan tekanan sampai 5000 psib)Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menitc)Bahan tahan korosid)Keluaran bebas pulse

Dikenal 3 jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan yaitu :a)Pompa ReciprocatingPompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston maju mundur yang dijalankan oleh motor. Gerakan piston memberikan aliran eluen yang konstan, memiliki volume internal kecil (35-400 mL) menghasilkan tekanan tinggi (sampai 10.000 psi). Piston berupa batang gelas dan berkontak lengsung dengan pelarut.

b)Pompa DisplacementPompa ini menyerupai syringe (alat suntik) tersiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Menghasilkan aliran yang cenderung tidak tergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. Memiliki keterbatasan kapasitas pelarut (250 mL) dan tidak mudah untuk pergantian pelarut.

c)Pompa PneumaticDalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi.Pompa jenis ini murah, tetapi memiliki keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan ( 0,997 , maka boleh melanjutkan perhitungan kadar zat aditifdalam sampel. Dihitunglah kadarnya dalam satuan % w/w . Bila tidak diperoleh kurva yang linier, maka dilakukan diskusi untuk mencari penyebabnya.

D.HASIL DAN ANALISIS DATAAnalsis kuantitatif HPLC didasarkan pada pengukuran luas atau area puncak dalam kromatogram. Pada percobaan penentuan kadar vitamin c, kafein, dan natrium benzoat dalam sampel dengan menggunakan metode HPLC, digunakan satu deret standar yang konsentrasinya bervariasi, yaitu 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, dan 50 ppm. HPLC adalah suatu metode pemisahan dari analit berdasarkan perbedaan interaksi pada fasa diam dan fasa diamnya. Sehingga akan didapatkan waktu retensi yang berbeda-beda antara komponen yang satu dengan komponen yang lainnya.Metode yang digunakan pada pengujian ini adalah metode fasa terbalik dimana fasa gerak yang digunakan ini bersifat relatif lebih polar daripada fasa diamnya. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran kalium dihidrogen fosfat dan asetonitril dengan perbandingan 60 : 40. Sedangkan fasa diamnya berupa silika yang direaksikan dengan organoklorosilana.

Struktur Fasa diam

Berdasarka urutan kepolaran antara vitamin c, kafein, dan natrium benzoat. Bahwa vitamin c lebih besar dari kafein lebih besar dari natrium benzoat. Maka waktu retensi vitamin c lebih kecil dari kafein lebih kecil dari natrium benzoat. Sehingga larutan standar yang digunakan mempunyai harga regresi lebih mendekati satu.Dalam preparasi larutan standar dan sampel digunakan membran PTFE (Poly Tetra Fluoro Ethylene) untuk proses pemurnian larutan standar maupun sampel yang dipisahkan dari pengotornya.Sebelum pengujian sampel, terlebih dahulu dibuat kurva kalibrasi dari deret larutan standar dengan konsentrasi yang telah ditentukan. Kurva diplotkan antara konsentrasi setiap larutan standar terhadap luas area peak yang diperkirakan sebagai peak dari vitamin C, pada masing-masing kromatogramnya.Penentuan peak vitamin C pada kromatogram larutan standar ini dilakukan dengan mengamati peak yang waktu retensinya relatif tetap atau sama pada setiap konsentrasi larutan standar, serta memerhatikan luas area peaknya. Karenlarutan standar adalah larutan vitamin C maka kadar vitamin C di dalamnya adalah yang terbesar dibanding komponen lain sebagai hasil penguraian vitamin C atau senyawa lainnya (pengotor). Adanya penguraian ini ditunjukkan salah satunya dari adanya lebih dari satu peak pada kromatogram.Dari data kromatogram deret larutan standar, diperoleh waktu retensi untuk vitamin c 1.98; waktu retensi kafein 2.54; dan waktu retensi natrium benzoat 4.38.Waktu retensi pada larutan standar menjadi acuan dalam menentukan komponen-komponen yang terdapat dalam sampel. Pada kromatogram sampel terdapat empat puncak, yaitu :Komponen kesatu dengan waktu retensi sebesar 1.79; dan luas area sebesar 220807Komponen kedua dengan waktu retensi sebesar 1.99; dan luas area sebesar 1779127Komponen ketiga dengan waktu retensi sebesar 4.40; dan luas area sebesar 15581524Komponen keempat dengan waktu retensi sebesar 4.81; dan luas area sebesar 478118

Komponen kesatu dalam sampel diduga bukan vitamin c, karena waktu retensi untuk vitamin c dimulai dari 1.98, sebagaimana hasil dari kromatogram yang tertera. Sedangkan pada komponen kedua, diidentifikasikan sebagai komponen vitamin c, karena waktu retensinya mendekati waktu retensi vitamin c. Dan pada komponen ketiga waktu retensinya mendekati waktu retensi natrium benzoat yang dimulai dari 4.38. sehingga diidentifikasikan bahwa komponen ketiga sebagai komponen natrium benzoat. Komponen keempat pada sampel diduga bukan natrium benzoat, karena selisih waktu retensinya sangat jauh dengan waktu retensi natrium benzoat.Berdasarkan hasil pengolahan data, kadar natrium benzoat dalam sampel adalah 115,757 mg, sedangkan kadar vitamin c adalah 3,53664 mg.

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil praktikum kali ini dilakukan penentuan kadar zat aditif dalam sampel dengan menggunakan HPLC, pada larutan sampel yang digunakan yaitu Mizone terdapat dua kadar zat aditif, yaitu kadar komponen vitamin c dan kadar komponen natrium benzoat.Kadar vitamin c yang terkandung dalam sampel yaitu sebesar 3,53664 mg dan kadar natrium benzoat yang terkandung dalam sampel sebesar 115,757 mg.

DAFTAR PUSTAKA

Day, R.A., A.L. Underwood. 2002.Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta: Erlangga.Hendayana, Sumar. (2006) .KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi dan Elektroforensis Modern.Bandung : PT. Remaja Rosdakarya.Tim Kimia Analitik Instrumen. (2009).Penuntun Praktikum Kimia Analitik Instrumen (KI 512).Bandung : Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI.

Dalam percobaan ini dilakukan kadar zat aditif (vitamin C, kafein, dan natrium benzoat) dalam sampel hemaviton energi dengan menggunakan instrumen HPLC. Prinsip dasar dari HPLC adalah perbedaan distribusi komponen pada sampel diantara fasa gerak cair dan fasa diam cair. Dalam percobaan ini, fasa gerak yang digunakan adalah campuran antara metnol dan aquadbidest dengan perbandingan 60 : 40. Namun, dalam preparasi sampel, fasa gerak yang dibuat adalah campuran antara metanol dan aquabidest dengan perbandingan 70 : 30. Hal ini dilakukan karena berharap pemisahan yang dihasilkan optimal (dapat terpisah ketiga komponennya). Sedangkan, fasa diam yang digunakan adalah C18 yang bersifat nonpolar, sehingga pada percobaan ini digunakan metode HPLC fasa terbalik, yaitu fasa geraknya polar dan fasa diamnya nonpolar dengan sistem isokratik yaitu hanya menggunakan satu kondisi perbandingan fasa gerak 60:40 (dibuat tetap), dan laju alirnya 0,75 mL/menit.Dalam preparasi sampel, sampel yang digunakan adalah hemaviton energi sebanyak 2 Ml yang kemudian di encerkan dengan fasa gerak sampai volumenya 10 ml yang kemudian disaring dulu menggunakan membran PTFE supaya pengotor tidak ikut terukur dan kemudian di degassing dengan menggunakan ultrasonic vibrator supaya campuran menjadi homogen sebelum dilakukan pengukuran dengan instrumen HPLC.Analisis yang dilakukan dalam percobaan ini adalah analisis kualitatif dan analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi sampel dengan waktu retensi standar. Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan sampel untuk keluar kolom, dimana dari kromatogram deret standar, dapat dianalisis puncak yang pertama keluar (waktu retensi kecil) adalah diduga vitamin C, puncak kedua diduga kafein, dan puncak ke tiga diduga natrium benzoat. Hal ini didasarkan karena tingkat kepolaran dari ketiga senyawa tersebut, dimana tingkat kepolarannya adalah vitamin C > kafein > natrium benzoat. Karena fasa diamnya yang bersifat nonpolar, sehingga yang memiliki kepolaran rendah akan lebih lama berada di dalam kolom, sedangkan yang memiliki kepolaran tinggi akan cepat keluar dari kolom (waktu retensi kecil). Namun, pada saat pengukuran deret standar untuk konsentrasi rendah, masih belum terpisah antara puncak satu dengan puncak dua. Hal ini menunjukkan bahwa pemisahan yang dilakukan masih kurang optimal, sehingga dari waktu retensi standar, dapat diketahui kandungan vitamin C, kafein,dan natrium benzoat sampel dilihat dari kedekatan waktu retensi standarnya.Sedangkan, analisis kuantitatif dilakukan dengan menghitung konsentrasi sampel berdasarkan luas area puncak kromatogram dengan menggunakan metode kurva kalibrasi dari larutan deret standar. Larutan deret standar dibuat dan diukur sebanyak dua kali, yaitu deret yang pertama dibuat dengan menggunakan pipet seukuran untuk mengambil larutan induknya, sedangkan deret kedua menggunakan pipet ukur untuk mengambil larutan induknya. Hal ini dilakukan karena ada sedikit kesalahan dari praktikan.Dari pembuatan deret standar sebanyak dua kali, dapat dibandingkan konsentrasi dan kadar dari komponen pada sampel. Untuk luas area komponen pada sampel yang berasa pada rentang luas area deret standar, dilakukan perhitungan konsentrasi dengan menggunakan persamaan garis y = mx + b, sedangkan jika tidak berada pada rentang luas area deret standar, dilakukan perhitungan konsentrasi dengan menggunakan perbandingan konsentrasi dan luas area sampel dan standar.

Dari hasil peritungan, dapat diperoleh hasil sebagai berikut :Diduga zat yang terkandungKonsentrasi (ppm)Kadar (mg)

Deret 1Deret 2Deret 1Deret 2

Vitamin C58.262473.385343.696855.0389

Kafein41.396637.725231.047528.2939

Natrium benzoat220.8138228.0471220.8138171.0353

H. KesimpulanBerdasarkan hasil pengukuran dengan instrumen HPLC untuk sampel minuman hemaviton energi diperoleh kadar vitamin C, Kafein, dan natrium benzoat dengan menggunakan deret standar pertama secara berturut-turut adalah 43.6968 mg ; 31.0475 mg ; dan 220.8138 mg dalam 150 mL sampel. Sedangkan kadar vitamin C, kafein, dan natrium benzoat dengan menggunakan deret standar kedua secara berturut-turut adalah 55.0389 mg ; 28.2939 mg ; dan 171.0353 mg dalam 150 mL sampel.

DAFTAR PUSTAKAHendayana, S, (1994).Kimia Analitik Instrumen. Semarang : IKIP Semarang Press.Hendayana, S, (2006).KimiaPemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern.Bandung : PT Remaja Rosdakarya.Skoog, Douglas. A. (2004).Fundamentals of Analytical Chemistry Eighth Edition.Brooks/Cole : CanadaTim Kimia Analitik Instrumen. (2011).Penuntun Praktikum Kimia Ananlitik Instrumen (KI 431). Bandung : Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI.

G.PembahasanHigh Performance Liquid Chromatography(HPLC)secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, teknik ini didukung oleh tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Hal ini membuat kerja HPLC lebih cepat sehingga penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.Prinsip kerja HPLC adalah dengan bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena terdapat perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam.Gambar 4. Alat HPLCGambar 5. Skema Kerja HPLCPenggunaan HPLC dalam analisis kandungan berberapa senyawa (asam askorbat, kafein, dan natrium benzoat) dalam minuman berenergi dilakukan dengan alasan teknik ini dapat menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi, tidak terbatas pada senyawa organik, mempunyai berat molekul tinggi atau titik didihnya sangat tinggi. Selain itu, kelebihan lain yang dimiliki HPLC adalah: Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran Mudah melaksanakannya Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis Resolusi yang baik Dapat digunakan bermacam-macam detektor Kolom dapat digunakan kembali Mudah melakukan sample recovery (Putra, E., 2004)Dalam praktikum ini, digunakan kromatografi fasa terbalikyaitu ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sementara itu, pelarut polar yang digunakan berupa campuran air dan metanol.Fasa gerak dalam HPLC berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detektor dan berinteraksi dengan solut. Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut:a. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisisb. Zat cair harus murni untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogramc. Zat cair harus jernih untuk menghindarkan penyumbatan dalam kolomd. Zat cair harus mudah diperoleh, murah dan tidak mudah terbakar dan tiak beracune. Zat cair tidak kentalf. Zat cair harus sesuai dengan detektor. Untuk detektor UV, pelarut tidak boleh menyerap cahaya pada panjang gelombang yang dipakai (Hendayana, S., 2006)Biasanya beberapa pelarut atau kombinasi pelarut dapat ditemukan untuk memberikan faktor kapasitas yang cocok. Oleh karena itu, pada praktikum ini digunakan fasa gerakberupa campuran KH2PO4(pH = 2,65) dan acetonitril dengan perbandingan 60 : 40.Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet sehingga pada praktikum ini dipilih detektor UV. Selain itu, banyak senyawa-senyawa organik yang menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Sinar UV secara langsung akan mengenai larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan sehingga akan didapatkan pembacaan langsung berupa besar sinar yang diserap. Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari spektrum UV, misalnya, metanol menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm sehingga ketika digunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, panjang gelombang yang digunakan harus lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut. Oleh karena itu, pada praktikum ini digunakan panjang gelombang sebesar 254 nm.Kromatogram merupakan hasil rekaman yang menggambarkan urutan keluarnya komponen campuran dari kolom. Jumlah peak yang muncul menyatakan jumlah komponen yang terdapat di dalam campuran. Sedangkan kuantitas tiap komponen dapat dihitung melalui luas peak. Semakin besar luas peak semakin besar pula kuantitas komponen tersebut. Ada beberapa metode analisis yang dapat digunakan untuk HPLC, yaitu metode standar eksternal, metode standar internal, dan metode standar adisi. Pada praktikum ini, kromatogram diperoleh melalui teknik standar eksternal yaitu injeksi larutan standar dan sampel dipisahkan sehingga diperoleh kromatogram yang berbeda untuk larutan standar dan sampel.Pada kromatogram, diperoleh data waktu retensi dan luas area. Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan oleh suatu komponen campuran untuk keluar dari kolom. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Dalam melakukan analisis senyawa, terlebih dahulu dicari data mengenai waktu retensi masing-masing senyawa sehingga dapat diprediksi senyawa-senyawa yang muncul pada peak kromatogram berdasarkan waktu retensinya. Senyawa asam askorbat dan natrium benzoat mempunyai waktu retensi berturut-turut adalah 1,41 menit dan 2,94 menit, kemudian ketika dilakukan injeksi larutan standar untuk tiga senyawa (asam askorbat, kafein, dan natrium benzoat) diperoleh tiga buah peak dengan waktu retensi 1,4 menit; 1,8 menit; 2,7 menit. Dengan menggunakan pendekatan waktu retensi dari dua senyawa yang telah diketahui sebelumnya, yaitu asam askorbat dan natrium benzoat, maka waktu retensi untuk kafein dapat diketahui sehingga dapat dipastikan senyawa yang pertama kali muncul adalah asam askorbat, kemudian kafein dan yang terakhir adalah natrium benzoat. Perbedaan waktu retensi ini muncul akibat dari sifat masing-masing senyawa tersebut. Dalam hal ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi tidak akan sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang menempel pada silika (fasa diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk interaksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hidrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom yaitu asam askorbat kemudian kafein dan terakhir natrium benzoat. Selain itu, untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada: tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom (Clark, J., 2007)Ada beberapa indikator yang menentukan pemisahan telah dilakukan dengan baik ataupun tidak. Hal tersebut adalah:1.Faktor kapasitasmerupakan suatu ukuran kekuatan interaksi suatu komponen dengan fasa diam. Senyawa-senyawa yang mempunyai harga faktor kapasitas tinggi menunjukkan komponen tersebut berinteraksi dengan fasa diam secara kuat. Faktor kapasitas dapat ditentukan dengan rumus:2.Tingkat efisiensipemisahan dengan kromatografi tercermin pada peak-peak kromatogram yang dihasilkannya. Semakin lebar suatu peak kromatogram maka dapat dikatakan pemisahan kurang efisien. Secara kuantitatif, efisiensi dapat dijelaskan dengan teori plat (N).3.Derajat pemisahandua komponen campuran dalam proses kromatografi dinyatakan dalam istilah resolusi (Rs). Pemisahan dua peak terlihat sempurna pada harga Rs= 1,5. Derajat pemisahan tidak hanya bergantung pada jenis solut, tetapi juga pada sifat fisik dan kimia fasa diam.ada peak-peak yang muncul pada kromatogram dilakukan interpretasi data konsentrasi senyawa pada campuran berdasarkan data waktu retensi dan luas area. Korelasi linear antara luas area dengan konsentrasi dapat dirumuskan dengan persamaan linear y = ax + b, dengan y adalah luas area dan x adalah konsentrasi sehingga diperoleh data sebagai berikut:Tabel 2. Kadar Beberapa Senyawa Hasil PengukuranSenyawaKadar Hasil PengukuranKadar pada Label

Asam askorbat11,551 mgTidak dicantumkan

Kafein38,045 mg50 mg

Natrium benzoat27,419 mgTidak dicantumkan

Berdasarkan hasil yang diperoleh dari perhitungan, kadar asam askorbat dalam setiap kemasan minuman berenergi merk K adalah 11,551 mg. Kadar ini cukup untuk memenuhi kebutuhan vitamin C untuk orang dewasa karena asupan vitamin C dapat diperoleh juga dari asupan makanan lain seperti buah dan sayur. Asam askorbat atau lebih dikenal dengan nama vitamin C adalah vitamin untuk jenis primat tetapi tidak merupakan vitamin bagi hewan-hewan lain. Asam askorbat adalah suatu reduktor kuat (Winarno, 1997). Bentuk teroksidasinya, asam dehidroaskorbat, mudah direduksi lagi dengan berbagai reduktor seperti glutation dipastikan karena asam ini tidak dapat berikatan dengan protein yang manapun. Sifat fisik dan kimiawi asam askorbat adalah merupakan derivat monosakarida yang mempunyai gugus enediol dan mempunyai 2 rumus bangun yang erat, yaitu sebagai asam askorbat dan dehidro asam askorbat. Dehidro asam askorbat terjadi karena oksidasi spontan dari udara. Keduanya merupakan bentuk aktif yang terdapat dalam cairan tubuh. Senyawa ini merupakan kristal putih tidak berbau yang larut dalam air (tetapi kurang stabil), tidak larut dalam lemak. Stabil dalam larutan dan penyimpanan dingin, peka terhadap pemanasan dan oksidasi (terutama bila ada Cu, maka vitamin C adalah pereduksi yang kuat). Kebutuhan vitamin C dewasa 45 mg/hari, anak-anak 35 mg/hari, bumil & buteki : 60 mg/hari (Hawab, 2005).Kadar kafein yang diperoleh dari hasil perhitungan adalah 38,045 mg. Hasil ini berbeda dengan yang tertera pada label, yaitu sebesar 50 mg. Hal ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya adalah kemungkinan adanya pelebaran peak. Faktor yang dapat menyebabkan pelebaran peak adalah karakteristik fasa gerak dan fasa diam dalam perjalanan solut melewati kolom. Ukuran dari partikel pengisi kolom yang tidak merata mengakibatkan panjang jalan yang harus dilalui oleh molekul-molekul solut menjadi bervariasi. Perbedaan waktu tempuh molekul-molekul solut menyebabkan adanya pelebaran peak. Mekanisme ini dinamakandifusi Eddy.Gambar 6. Difusi EddySelain itu, molekul-molekul solut berkecenderungan untuk berdifusi ke segala arah. Semakin lama solut berada dalam kolom maka semakin besar pula kecenderungan berdifusi dan hal ini menyebabkan melebarnya peak kromatogram. Mekanisme ini dinamakandifusi longitudinal. Sebagian molekul solut berada dalam fasa gerak dan sebagian lagi berada dalam fasa diam. Bila fasa gerak mengalir secara cepat sementara sebagian molekul-molekul solut tidak dapat keluar dari fasa diam secara cepat maka sebagian solut terlambat meninggalkan kolom. Hal ini mengakibatkan melebarnya peak kromatogram sekaligus membuat pemisahan tidak efisien. Mekanisme ini dinamakantransfer massa. Oleh karena itu, kecepatan optimum harus dicari dengan memvariasikan kecepatan fasa gerak sebelum pengukuran kromatografi dilakukan atau disebut juga dengan metode gradien.Dosis 100-150 mg kafein merupakan batas amam konsumsi manusia, dan efek yang diberikan pada takaran ini adalah dapat meningkatkan aktivitas mental yang membuat orang selalu terjaga, sehingga dosis anjuran konsumsi dari produsen minuman berenergi adalah 2-3 kali atau setara dengan 100-150 mg kafein seharinya. Hal ini sebenarnya beresiko terutama bila konsumsi dari minuman berenergi masih disertai dengan minum kopi (Hermanto, 2007).Sementara itu, kadar natrium benzoat yang diperoleh adalah 27,419 mg. Konsentrasi sebagai pengawet adalah dibatasi oleh FDA di AS sebanyak 0,1% berat. Berarti dalam 150 mL takaran per botol, kandungan natrium benzoat yang diperbolehkan adalah 0,15 gram atau 150 mg. Program Internasional tentangChemical Safetytidak menemukan efek samping pada manusia pada dosis 647-825 mg/kg berat badan per hari. Sekitar 75-80% dikeluarkan dalam jangka waktu 6 jam dan seluruh dosis akan dikeluarkan dari dalam tubuh dalam jangka waktu sekitar 10 jam. Batasan yang ditentukan untuk natrium benzoat dalam makanan bukan karena sifat racunnya, melainkan karena jika jumlahnya melebihi 0,1%, bahan ini dapat meninggalkan rasa tertentu di mulut. Mekanisme ini dimulai dengan penyerapan asam benzoat ke dalam sel. Jika perubahan pH intraselular 5 atau lebih rendah, fermentasi anaerobik glukosa melalui fosfofruktokinase ini mengalami penurunan sebesar 95%. Dalam kombinasi dengan asam askorbat (vitamin C, E300), natrium benzoat dan kalium benzoat tidak benzena bentuk, karsinogen diketahui, namun tingkat di bawah mereka yang dianggap berbahaya untuk konsumsi (Faisal, 2010).H.KesimpulanBerdasarkan data hasil percobaan dan perhitungan dapat diperoleh kesimpulan sebagai berikut:1. Terdapat tiga buah kurva kalibrasi yang diperoleh dari data hasil percobaan pengukuran konsentrasi terhadap luas area vitamin C (asam askorbat), kafein, dan natrium benzoat dengan regresi masing-masing 0,999; 0,995; dan 0,9992. Konsentrasi vitamin C (asam askorbat), kafein, dan natrium benzoat dalam sampel minuman berenergi merk K adalah 11,551 mg; 38,045 mg; 27,419 mgDAFTAR PUSTAKA_____ . ( ).Sekilas tentang Minuman Berenergi. [Online]. Tersedia:http://www.apoteker.info. [22 November 2011]Anna, L. K. (2011).Bahaya Minuman Berenergi. [Online]. Tersedia:http://health.kompas.com. [22 November 2011]Clark, J. (2007).High Performance Liquid Chromatography. [Online]. Tersedia:http://www.chem-is-try.org. [14 November 2011]Dalimartha, S. (2002).Atlas Tumbuhan Obat Indonesia. Jilid I. Jakarta: Trubus AgriwijayaFaisal. (2010).Sodium Benzoat. [Online]. Tersedia:http://industri10yusup.blog.mercubuana.ac.id. [29 November 2011] Fulder, S. (2004).Khasiat Teh Hijau. Jakarta: PT. Prestasi PustakaryaHawab, HM. (2005).Pengantar Biokimia Edisi Revisi. Medan: BayumediaHendayana, S. (2006).Kimia Pemisahan. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya OffsetHermanto, S. (2007).Kafein, Senyawa Bermanfaat atau Beracunkah?. [Online]. Tersedia:http://www.chem-is-try.org. [22 November 2011]Margono, T., dkk. (2000).Pengawetan dan Bahan Kimia. Jakarta: Menegristek Bidang Pendayagunaan dan Pemasyarakatan Ilmu Pengetahuan dan TeknologiPutra, E. (2004).High Performance Liquid Chromatography. [Online]. Tersedia:http://www.artikelkimia.info. [14 November 2011]Sudarmi. (1997).Kafeindalam Pandangan Farmasi. Medan : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Sumatera Utara (USU)Wahyu. (2011).Laporan Praktikum Biokimia Vitamin C. [Online]. Tersedia:http://wahyoe-analisiskimia.blogspot.com. [22 November 2011]Wilson, and Gisvold. (1982.)Textbook of Organic Medical and Pharmaceutical Chemistry. Philadelphia: JB Lippincolt CompanyWinarno, F.G. (1997).Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama

BAB IPENDAHULUAN1.1. Latar BelakangKimia analitik adalah cabang ilmu kimia yang berfokus pada analisis material untuk mengetahui komposisi, struktur, dan fungsi kimiawinya. Secara tradisional, kimia analitik dibagi menjadi dua jenis, kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui keberadaan suatu unsur atau senyawa kimia, baik organik maupun anorganik, sedangkan analisis kuantitatif bertujuan untuk mengetahui jumlah suatu unsur atau senyawa dalam suatu cuplikan.Kimia analitik modern dikategorisasikan melalui dua pendekatan, target dan metode. Berdasarkan targetnya, kimia analitik dapat dibagi menjadi kimia bioanalitik, analisis material, analisis kimia, analisis lingkungan, dan forensik. Berdasarkan metodenya, kimia analitik dapat dibagi menjadi spektroskopi, spektrometri massa, kromatografi dan elektroforesis, kristalografi, mikroskopi, dan elektrokimia.Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (Hight Performance Liquid Chromatograhy )dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini KCKT merupakan tekhnik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam sebidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan KCKT terbaru antra lain : miniaturisasi`sistem KCKT, penggunaan KCKT untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat dan analisisi senyawa-senyawa kiral.Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) merupakan suatu tekhnis analisis obat yang paling cepat berkembang. Cara ini ideal untuk analisis beragam obat dalam sediaan dan cairan biologi, karena sederhana dan kepekaannya tinggi. KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintetis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal dari lingkungan ; memurnikan senyawa-senyawa dalam suatu campuran ; memisahkan polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran; kontrol kualitas dan mengikuti jalannya reaksi sintetis.

Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa- fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa stasioner/diam dapat berupa zat padat atau suatu cairan, dan fasa gerak dapat berbentuk cairan ataupun gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat,gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Day dan Underwood, 2002). Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam memisahkan suatu campuran senyawa.Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom ) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relative singkat. HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan.

1.2 TujuanTujuan dari pembuatan makalah ini adalah :1. Untuk mengetahui komponen utama dari HPLC.2. Untuk mengetahui prinsip kerja dan penerapan dari HPLC.3. Untuk mengetahui kelebihan dan kekurangan metode analisis dengan HPLC.4. Untuk mengetahui penerapan HPLC dalam analisis senyawa (obat) dalam campuran

1.3 Rumusan Masalah1. Bagaimana penerapan HPLC dalam analisis senyawa (obat) dalam campuran?

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Perkembangan KromatografiKromatografi pada hakekatnya merupakan metode pemisahan dimana komponen yang akan dipisahkan terdistribusi diantara dua fase yang saling tidak bercampur yaitu fasa diam dan fasa gerak. Kromatografi juga didefinisikan sebagai proses pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diffferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan tekanan uapnya (Bahti, 1998).Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi. Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC).Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih (Sudjadi, 1986).Kromatografi cair kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dimana fase cair yang mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat gaya gravitasi dan terjadi proses pemisahan di kolom tersebut. Metode itu dicirikan dengan efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cair kembali dilirik dengan dikembangkannya sistem kolom bertekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang mampu bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2(3000p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 nm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cair yang biasa (Bassett et. all., 1994).Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed= Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yangsudah matang dan dengan cepat HPLC mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas (Putra, 2004).Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukupmenghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).HPLC telah digunakan di Indonesia sejak tahun 1997 oleh Wiadnyana dalam penelitiannya yang bertema menguji dan menentukan kadar toksisitas berbagai macam fitoplankton di perairan laut. Selain digunakan untuk uji toksisitas, dalam bidang Biokimia HPLC kerap digunakan untuk menghitung kadar vitamin dan protein dari suatu makanan atau sampel. Singkatnya, HPLC merupakan sebuah metode analisa modern yang multifungsi dan sudah ada di Negara kita Indonesia. Oleh karena itu ijinkan penulis untuk bercerita sedikit tentang High Perfomance Liquid Chromatography.2.2 Teknik Pemisahan dengan HPLCTehnik pemisahan dalam kromatografi melibatkan dua fasa, yakni fasa diam yaitu padat atau cairan yang terikat pada padatan pendukung, dan fasa gerak yang berupa gas dan cair. Proses pemisahan dalam kromatografi di dasarkan pada perbedaan laju migrasi masing- masing komponen dalam sistem kromatografi. Perbedaan laju migrasi dari masing-masing komponen merupakan akibat dari perbedaan keseimbangan distribusi masing-masing komponen diantara fasa gerak dan fasa diam. Metode kromatografi dibedakan dalam beberapa macam, berdasar pada fasa gerak, fasa diam, mekanisme, dan tehnik yang digunakan dan salah satu diantaranya adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC).Dalam kromatografi cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan, sedangkan fasa diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom tertutup (melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Maksud dan tujuan analisis dengan kromatografi yaitu didapatnya pemisahan yang baik demikian halnya dalam HPLC diharapkan pemisahannya baik dan dalam waktu proses yang relative singkat. Untuk mencapai Tujuan analisis ini, maka dipilih pelarut pengembang yang sesuai dengan komponen yang dipisahkan, kolom yang digunakan juga harus diperhatikan, dan detector yang memadai.Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada lima factor, yaitu waktu retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, resolusi, dan factor ikutan.a.Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat konsentrasi maksimum.b.Faktor kapasitas (k) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika nilai k kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k yang lebih besar, maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan puncaknya melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k optimum, yaitu antara 1 sampai 10. Kolom dinyatakan baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai selektivitas () harus lebih besar daripada 1., dimana semakin besar nilai maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak (misal: memperbesar polaritas); mengubah fasa diam; mengubah temperature, karena pada umumnya kenaikan temperature akan memperkecil waktu retensi; dan mengubah bentuk komponen.c.Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat.d.Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi R (ukuran besar kecilnya pemisahan). Jika nilai R 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik.e.Sedangkan factor terikutan (Tf) merupakan ukuran kesimetrisan suatu puncak. Dengan catatan nilai Tf < 2,0.Perkembangan HPLC berkembang dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke arah yang lebih luas, yaitu proses pemisahan yang berasaskan afinitas. Filtrasi gel dan ion yang berpasangan., akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan di dalam kolom disertai pemakaian pelarut pengembangdengan tekanan tinggi (Ahmad dan Suherman, 1995).Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry.

2.3Prinsip Kerja Dari KCKTAdapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam.2.4Kegunaan KCKTKegunaan umum KCKT adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa-senyawa tidak menguap (non-volatil) ; penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupunzwitter ion ;isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit(trace element), dalam jumlah banyak dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode yang tidak dekstruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.2.5Mekanisme Kerja KCKTPenggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepataan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel.Instrumen KCKT pada dasarnya tersiri atas delapaan komponen pokok yaitu :1. Wadah fase gerak2. Sistem penghantaran fase gerak3. Alat untuk memasukkan sampel4. Kolom5. Detektor6. Wadah penampung buangan fase gerak7. Tabung penghubung8. Suatu komputer atau integrator atau perekam

Gambar Rangkaian Instrumen HPLC

1. Wadah fase gerak pada KCKTWadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Sebelum menggunakan fase gerak harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut pada fase gerak maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, bufer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi xdan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT berderajat KCKT (HPLC grade).2. Fase GerakFase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi, yang ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.Deret eluotrofik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan hal penting dalam pemilihan fase gerak.Adapun ciri-ciri yang harus dimiliki oleh fase gerak pada KCKT, yaitu :1)Kemurnian tinggi (high purity), yaitu cairan eluen yang tidak terkontaminasi.2)Kestabilan tinggi, yaitu eluen yang tidak bereaksi dengan sampel atau zat yang berfungsi sebagai fase diam.3)Kekentalan rendah, yaitu kerapatan eluen sekecil mungkin.4)Dapat melarutkan sampel, tidak mengubah kolom dan sifat kolom serta cocok dengan detektor.

Beberapa deret eluotropik KCKT :PelarutParameter kekuatan pelarut (adsorbsi)Parameter kekuatan pelarut (partisi)UV cut off (nm)

n-heksana0,010,1195

Sikloheksana0,04-0,2200

Tetraklorometan0,181,6265

Nilai pemenggalan UV merpakan panjang gelombang yang mana pada kuvet 1 cm, pelarut akan memberi absorbasi lebih dari 1,0 satuan absorbansi. Sangat dianjurkan untuk menggunakan panjang gelombang deteksi yang tidak bertepatan atau di sekitar panjang gelombang pemenggalan UV pelarut yang digunakan sebagai fase gerak.Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut jenos alkohol.3. PompaAda dua tipe pompa yang digunakan, yaitu pompa kinerja konstan (constant pressure) dan pompa pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.Tujuannya adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat.Ada 2 jenis pompa KCKT yaitu : pompa dengan tekanan konstan dan pompa aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tekanan konstan.Syarat syarat pompa yang ideal:a.Mampu membangkitkan tekanan tinggib. Pulse free out putc. Control laju alir yang akuratd. Tahan korosie. Terbuat dari bahan yang tahan terhadap fasa gerakf. Bebas pulsag. Perlude gasserh. Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebari. Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradienj. Bekerja pada tekanan sampai 6000 psi (400 atm)Tiga jenis pompa yang sering digunakan dalam sistem KCKT yaitu :1)Pompa Bolak-balik (reciprocating pump)Jenis pompa yang paling banyak digunakan. Kelebihan pompa jenis ini adalah volume internalnya kecil sekitar 35 400l, tekanan hingga 10.000 psi, kemampuan untuk adaptasi menggunakan elusi gradien, aliran yang konstan sehingga terbebas dari tekanan balik kolom dan akibat dari kekentalan solven.2)Pompa Sistem Penggantian (displacement pump)Sistem penggantian menggunakan sebuah wadah besar sepertisyringedengan sebuah penekan yang digerakan oleh motor. Menghasilkan aliran yang bebas tekanan balik, tidak dipengaruhi kekentalan dan bebas denyut. Kekurangan pompa jenis ini adalah kapasitas pompa terbatas hanya 250 ml dan cukup sulit saat solven harus mengalami penggantian.3)Pompa Tekanan Udara(pneumatic pump)Bentuk paling sederhana sebuah pompa pneumatik merupakan wadah yang ditekan oleh gas bertekanan tinggi. Harga relatif murah dan bebas denyut merupakan kelebihan jenis pompa ini. Kekurangannya terletak pada kapasitas terbatas, tekanan keluaran terbatas hanya sekitar 2000 psi, dipengaruhi oleh tekanan balik dan kekentalan solven dan tidak dapat digunakan untuk sistem elusi gradien.

4. Injektor (penyuntikan sampel)Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan meuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).Pada saat pengisian, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikkan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1 %. Penyuntikkan ini mudah digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT.Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagaiwaktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada: tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom 1. Elusi Gradien Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung.Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar- dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder. Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :a.Total waktu analisis dapat direduksib. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambahc. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak5.KolomAda 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :ParameterKolom konvensionalKolom mikrobor

Tabung kolomStainless steelPanjang 3,10,15,20 dan 25 cmDiameter luar 0,25 inciDiameter dalam 4,6 cmStainless steelPanjang 25 dan 50 cmDiameter luar 0,25 inciDiameter dalam 1 atau 2 mm

Fase diamPorous, silika ukuran kecil, silika yang dimodofikasi secara kimiawi (bonded phase), atau polimer-polimer stiren/divinil benzen.Rata-rata diameter partikel 3,5 atau 10m dengan kisaran sempit.Porous, silika ukuran kecil, silika yang dimodofikasi secara kimiawi (bonded phase), atau polimer-polimer stiren/divinil benzen.Rata-rata diameter partikel 3,5 atau 10m dengan kisaran sempit.

Tekanan operasional500-3000 psi(35-215 bar1000-5000 psi(70-350 bar)

Fase gerakHidrokarbon+pelarut terklorinasi atau alkohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik (reversed phase) digunakan metanol atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir : 1-3 ml/menitHidrokarbon+pelarut terklorinasi atau alkohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik (reversed phase) digunakan metanol atau asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir 10-100 l/menit.Modifikasi instrumenSistem penghantaran pelarut yang mampu memberikan kontrol aliran di bawah 10l/menit.Katup injeksi sampekl bervolume kecil;sel detektor bervolume kecil.

KinerjaEfisiensi meningkat dengan bekurannya ukuran partikel fase diam, akan tetapi umur kolom dengan ukuran partikel 3 m lebih pendek.Sangat efisiensi dan sensitif, akan tetapi lambat,konsumsi fase gerak hanya dari kolom konvensional.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibandingkan dengan kolom konvensional, yakni :1. Konsumsi fase gerak mikrobor hanya 80% atau lebhi kecil dibandingkan dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100 l/menit)2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.Kolom KCKT secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel, walaupun untuk tekanan di bawah 600 psi kolom kaca dapat digunakan. Kolom untuk analisis KCKT memiliki ukuran panjang kolom berkisar dari 10 30 cm berbentuk lurus dan jika diperlukan dapat disambung dengan kolom yang lain. Diameter dalam kolom 4 10 mm dengan ukuran partikel 5 10 m. Kolom dari jenis ini mempunyai 40.000 hingga 60.000 lempeng/meternya.Saat ini, pabrik pembuat kolom telah merancang dan memproduksi kolom dengan kecepatan dan kinerja tinggi.Beberapa kolom hanya memiliki panjang 1 hingga 4,6 cm dengan ukuran partikel 3 5m. Beberapa jenis kolom memiliki jumlah lempeng hingga 100.000 hanya dengan panjang 3 sampai 7,5 cm dengan kelebihan pada kecepatan dan sedikitnya solven yang diperlukan dalam pemisahan. Jumlah solven minimum menjadi pertimbangan penting karena mahalnya solven dengan tingkatan kromatografi (chromatography grade).Dua jenis kolom digunakan dalam kromatografi cair yaitu jenispelliculardan partikel berpori (porous particle). Jenispellicularterdiri dari partikel dengan bentuk bola, tidak berpori berbahan dasar gelas atau polimer dengan diameter 30 hingga 40m. Lapisan tipis berpori silika, alumina, divinil benzen sintetis polystirena atau resin penukar ion dilapiskan pada permukaannya.Jenis kolom dengan partikel berpori berisi partikel berpori dengan diameter partikel 3 10m terbuat dari silika, alumina, resin sintetis divinil benzen polystirena atau resin penukar kation yang kemudian dilapisi lapisan tipis film berbahan organik sehingga berikatan secara kimia atau fisika terhadap permukaannya.(Skoog et al., 1998)

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable). Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan. Kolom diisi dengan partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu cairan yang berfungsi sebagai fasa diam. Komponen-komponen sample dibawa oleh cairan fasa gerak yang dialirkan dengan bantuan tekanan tinggi melewati kolom fasa diam.Komponen- komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara fasa diam dan fasa gerak yang satu sama lain tidak bercampur. Efisiensi kolom salah satunya sangat tegantung dari besarnya partikel fase stasioner. Oleh karena itu bila ukuran fase stasioner lebih kecil, maka tinggi plat teoritik akan berkurang, sehingga jumlah plat teoritik akan bertambah, yang meningkatkan efisiensi kolom. Dengan kolom yang pendek dan efisiensi, pemisahan akan berjalan dengan cepat.Terdapat banyak analisis yang dikerjakan pada suhu kamar, suhu kolom sering dapat diatur dengan konstan dengan memakai cara pemanasan. Sering dibutuhkan suhu kolom yang lebih tinggi dari suhu kamar untuk mengatasi masalah daya larut solute yang dianalisis dan viskositas fase gerak yang agak tinggi.6.Fase diamKebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).

Silika yang dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen yang akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang dimodifikasi ini mempu karekateristik kromatografi dan selektifitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi.

Oktadesil silika(ODS atau C18)merupakan fase diam paling sering digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa denngan kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi.Solut-solut yang polar, terutama yang bersofat basa akan mengekor (tailing peak) pada penggunaan fase diam silika fase terikat. Hal ini disebabkan oleh adanya interaksi adsorbsi antara solut-solut ini dengan residu silanol dan pengotor logam pada silika.Masalah ini dapat diatasi denganend-chappingyakni proses menutupi residu silanol ini dengan gugus-gugus trimetilsilil dan menggunakan silika dengan menggunakan silika dengan kemurnian yang tinggi (kandungan logam