Visualización de la calidad de los datos de RNA-Seq relacionados con el sistema inmune y el cáncer visualizados mediante shiny. Adrián Ferrer Torres Máster en Bioinformática y Bioestadística Análisis de datos ómicos con shiny Nombre Consultor: Ricardo Gonzalo Sanz Nombre Profesores responsables de la asignatura: Carles Ventura Royo y Jose Antonio Morán Moreno 2 de Enero de 2018
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Visualización mediante shiny de la calidad de los datos …openaccess.uoc.edu/webapps/o2/bitstream/10609/74347/12/adrianferr... · 1.1.08Inmunosupresión dentro del microambiente
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Visualización de la calidad de los datos de
RNA-Seq relacionados con el sistema inmune y
el cáncer visualizados mediante shiny.
Adrián Ferrer Torres
Máster en Bioinformática y Bioestadística
Análisis de datos ómicos con shiny
Nombre Consultor: Ricardo Gonzalo Sanz
Nombre Profesores responsables de la asignatura: Carles Ventura Royo y
Titulación:: Máster en Bioinformática y Bioestadística
Área del Trabajo Final: Análisis de datos ómicos
Idioma del trabajo: castellano
Palabras clave Shiny, RNA-Seq, inmunogenómica,
expresión génica, control de calidad
Resumen del Trabajo (máximo 250 palabras): Con la finalidad, contexto de
aplicación, metodología, resultados i conclusiones del trabajo.
Debido al alza en la incidencia del cáncer en la población, ha llegado a ser la
segunda causa de muerte en el mundo. Por ello, el estudio del sistema inmune
relacionado con esta enfermedad es prioritario, investigar en qué falla y cómo
se modifica la expresión de las células linfocíticas. Así se ganaría información
acerca de la evasión inmune llegando a poder reconocer posibles checkpoints
o dianas farmacológicas en las que actuar con diferentes tipos de fármacos,
inmunoterapias u otras terapias personalizadas posibles.
Para poder analizar la expresión génica es preciso primero realizar un pre-
filtrado, control y normalización de los resultados obtenidos por las muestras de
un estudio RNA-seq. Esto es lo que se pretende en este estudio, mostrando
además las diferentes etapas de los resultados obtenidos con gráficos y tablas
en una aplicación hecha con el paquete shiny.
ii
Las muestras se obtuvieron de la página web de gene expression omnibus. Se
utilizó el paquete edgeR así como DT entre otros para la construcción de la
aplicación.
Además se incluye en la memoria: el informe del presupuesto para un pequeño
laboratorio y centro de investigación que secuencie el genoma de los clientes y
que realice también otros estudios derivados de las ciencias ómicas de otros
centros como hospitales, institutos y centros de investigación.
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Abstract (in English, 250 words or less):
Due to the increasing incidence of cancer in the population, it has become the
second cause of death worldwide. Due to this, the study of the relation of the
immune system with cancer disease is critical to research in what fails and how
the expression on lymphocytic cells is modified. Therefore information about
immune evasion would be reached leading to possible checkpoints or
pharmacological target in which we could treat with different types of drugs,
immunotherapy, or other therapies as personalized therapy.
In order to conduct a study of genetic expression it is a must to first pre-filter,
control and normalize the results obtained samples obtained from a RNA-Seq
experiment. This is what is intended in this study, showing also the different
stages of results obtained with graphics and tables in an application made with
the shiny package.
The samples were obtained from the gene expression omnibus webpage. The
edgeR and DT packages were used for the application construction.
It is as well included in the memory a report of the budget for a small lab and
research center that sequences the client’s genomes as well as other omic
studies from other centers as hospitals, institutes and research centers.
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Índice
1. Introducción .................................................................................................. 1 1.1 Contexto y justificación del Trabajo ......................................................... 1
1.1.01 El Cáncer ........................................................................................ 1 1.1.02 Tratamientos contra el cáncer ......................................................... 1 1.1.03 El sistema inmunitario ..................................................................... 3 1.1.04 El término inmunovigilancia ............................................................. 4 1.1.05 Células T CD8+ cito tóxicas y su función efectora en tumores: ...... 4 1.1.06 Immunoedición del cáncer .............................................................. 5 1.1.07Pérdida de función en Linfocitos T infiltrados en el tumor................. 6 1.1.08Inmunosupresión dentro del microambiente tumoral, un ejemplo de
expresión ................................................................................................ 6 1.1.09 Tregs y adenosina: un ejemplo de epigenética en el microambiente
tumoral ................................................................................................... 7 1.1.10 Receptores de Adenosina A2A y A2B ............................................. 9 1.1.11 Rol de los receptores A2A y A2B en células T: posibles dianas para
ensayos clínicos ................................................................................... 10 1.1.12a Microarrays ................................................................................. 11 1.1.12b Microarrays vs RNA-Seq ............................................................. 11 1.1.13 NGS Next Generation Sequencing, RNA-Seq, datos ómicos ........ 12 1.1.14 Illumina.......................................................................................... 13 1.1.15 Preparación de las muestras para RNA-seq ................................. 13 1.1.16 R ................................................................................................... 14 1.1.17 Shiny ............................................................................................. 14 1.1.18 UI Interfaz de Usuario ................................................................... 15 1.1.19 Server ........................................................................................... 15 1.1.20 MDS Plot ....................................................................................... 16 1.1.21 Importancia del control de calidad de las muestras para el
consecutivo análisis.............................................................................. 16 1.1.23 Firma de la expresión genética o signature genes ........................ 16 1.1.24 Immunogenómica .......................................................................... 17
1.2 Objetivos del Trabajo ............................................................................. 17 1.3 Enfoque y método seguido .................................................................... 18 1.4 Planificación del Trabajo ........................................................................ 19 1.5 Breve sumario de productos obtenidos .................................................. 21 1.6 Breve descripción de los otros capítulos de la memoria ........................ 21
2. Resto de capítulos ...................................................................................... 22 2.1 Resultados ............................................................................................ 22
2.1.1 UI User Interface ............................................................................. 22 2.1.2 Server ............................................................................................. 24 2.1.3 Beneficios económicos de un posible proyecto ............................... 40
2.2 Discusión ............................................................................................... 43 2.2.1 Acerca de este experimento ............................................................ 43 2.2.2 Aspectos a investigar ...................................................................... 44
Con este trabajo se ha aprendidoa usar shiny para la creación de una
aplicación en la que se visualizasen resultados de datos ómicos, se aprendió
acerca del control de calidad para este tipo de datos transcriptómicos de RNA-
seq. Se logró estudiar la gestión del proyecto y el tiempo.
Reflexión crítica:
En un principio se quería realizar todo el protocolo de análisis de expresión
diferencial en un ejemplo de análisis de transcriptómica con microarrays y otro
con RNA-seq en dos especies distintas.
Entonces se supuso que era preferible realizar la comparación de los
resultados entre dos ejemplos de la misma especie. Además se recomendó
utilizar una única y misma tecnología para el análisis transcriptómico: Affymetrix
o Illumina, para poder realizar las comparaciones pertinentes de los resultados
obtenidos en la misma unidad o ratio. Ya que se tenía pensado desde un
principio comparar resultados de ambas tecnologías. Tras algún intento de
escoger datasets adecuados encontramos uno pero por la falta de tiempo para
la entrega del desarrollo del trabajo se realizó un trabajo menos extenso que el
que inicialmente se había planteado. En vez de todo el análisis de expresión
diferencial se propone realizar una aplicación para visualizar el control de
calidad de los datos.
Análisis crítico:
Se organizó la planificación metodológica y escrupulosamente. Sin embargo
aunque en un principio se pudo seguir, la planificación fue retrasándose para la
creación de la aplicación en sí. Aunque se empezó a escribir la memoria a
tiempo y antes de lo planeado, el hecho de no tener encarrilada la aplicación
desde el principio hizo que se retrasasen otras partes. En parte se siguió más
de la cuenta realizando aplicaciones de prueba en shiny en vez de centrarse en
la aplicación del trabajo en sí.
Quizás se podría haber seguido otra metodología ya que se ha tenido que
rehacer partes del trabajo o volver a empezar debido a que se empezó a
realizar parte del trabajo cuando aún no se había confirmado con el tutor si se
iba por el buen camino en cuanto a la selección de muestras por ejemplo. Se
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pretendía escoger un código para el análisis de RNA seq y conseguir adaptarlo
a una aplicación shiny. Viendo que esto no era posible se tuvieron que escoger
otras muestras para poder analizar. Debido a estos últimos ajustes del trabajo
se tuvo que acortar el objetivo en cuanto a cantidad de código para poder llegar
a la fecha clave con un script funcional. Por ello se realizó un control de calidad
de los datos (counts) y no se realizó ningún análisis de expresión diferencial.
Porque además al mismo tiempo se debía de ir redactando la memoria, por ello
se decidió acortar el estudio ya que si no, no hubiese habido tiempo de escribir
un informe tan largo en tan poco tiempo. A pesar de ello se pudo desarrollar
una aplicación shiny funcional.
Hubiese sido interesante poder utilizar Linux para el procesado de los datos y
la ejecución completa del análisis de expresión diferencial ya que su potencia
como sistema operativo agiliza el trato de datos en gran cantidad. Debido a la
falta de otro ordenador con el sistema operativo Linux y dada la insuficiente
capacidad del disco duro, en éste, para que una máquina virtual funcionase
realizando una partición en el mismo, se decidió utilizar Windows y R (sistema
operativo ya instalado).
Líneas de trabajo:
En este trabajo se tienen en cuenta unos datos de expresión génica
provenientes del nódulo linfático. Se podría estudiar el transcriptoma del
microambiente tumoral también.
Sería interesante investigar la relación del cáncer u otros tipos de cáncer con
otras enfermedades proinflamatorias y alergias y comparar la expresión génica
para buscar coincidencias de grupos. Durante este trabajo sólo se hizo el
control de calidad que es el primero de los pasos para poder realizar
seguidamente un análisis de expresión diferencial. Y en las muestras no hay un
caso control por lo que para realizar un análisis de expresión diferencial se
necesitarían de 4 muestras de nódulos linfáticos en personas sanas para poder
compararlas a las 4 muestras de los pacientes con melanoma.
Sería interesante poder secuenciar el genoma de los pacientes (cada paciente)
para poder inferir qué genes son los que están más o menos regulados en el
conjunto de pacientes para poder determinar qué vías y qué dianas
farmacológicas se podrían intervenir con nuevos fármacos. O si fuese posible
con inmunoterapia.
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4. Glosario
Definición de los términos y acrónimos más relevantes utilizados dentro de la
Memoria.
AMP Adenosina monofosfato
ATP Adenosina trifosfato
APC Células Presentadoras de Antígeno
STA Specific Tumour Antigen
IL-10 Interleucina inmunosupresiva
TGF-β Factor Transformante Beta
VEGF Factor de crecimiento vascular
endotelial
iMCs Células mieloides inmaduras
sPS Fosfatidilserina soluble
MHC Complejo Mayor de
Histocompatibilidad
RAG Gen de Activación de
Recombinación
IFN-γ, Interferón Gamma
RencaHA Cepa de células tumorales
NKT Células T Asesinas naturales
NK Natural Killer
TCR Complejo Receptor T
Bcl-xl y Bcl-2[ Factores antiapoptóticos
PGE2 Prostaglandina E2
HLA Antígenos Leucocitarios Humanos
Treg Linfocito T regulador
Tconv Linfocito T convenvional
Tr1 Linfocito T reguladora de tipo 1
NTPDasa Nucleosido trifosfato
difosfohydrolasa
AMPc Adenosina monofosfato cíclico
PKA Proteína Kinasa A
lipid rafts
Localización de membrana con alto
contenido en colesterol y
esfingolípidos (ácidos grasos
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saturados)
Lck Tirosina quinasa no específica
Csk Tirosina quinasa
Fyn Proto-oncogen proteína tirosin
quinasa
NF-AT Factor Nuclear de transcripción de
linfocitos T activados
CREB Elemento de Respuesta y unión al
AMPc (factor de transcripción)
UI Interfaz de Usuario
SNPs Polimorfismo de de nucleótido
único
FPKM Fragmentos por Kilobase por Millón
RPKM Lecturas por Kilobase por Millón
TPM Tránscritos por Kilobase por Millón
SNP Polimorfismo de nucleótido simple
GWAS Genome-Wide Assoaciation Study
IDE Entorno de Desarrollo Integrado
GB Gigabyte ( 109 bytes)
TB Terabyte (1012 bytes)
CPM Counts per million
MDS Multi Dimensional Scaling
FACS Fluorescence-Activated Cell
Sorting
TCGA The Cancer Genome Atlas
html HiperText Markup Language
php HypertextPreprocessor
mysql Sistema de gestión de bases de
datos relacional
RBP RNA Bead Plate
RFP RNA Fragmentation Plate
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