VIRUSOLOĢIJA (VĪRUSI UN ĀRPUSHROMOSOMU ĢENĒTISKIE ELEMENTI)

VIRUSOLOĢIJA(VĪRUSI UN ĀRPUSHROMOSOMU ĢENĒTISKIE ELEMENTI)

PĒTĪŠANAS METODES

Bioloģiskā bīstamība (Biohazard)

Drošības līmenis

1 2 3 4

Infekciju izraisītāju īpašības

Maz ticams, ka spēj izraisīt slimības veselā organismā

Spēj izraisīt slimības, bet to bīstamība nav liela

Izraisa nopietnas slimības, bet neizplatās netiešu kontaktu veidā

Izraisa smagas, bieži neārstējamas slimības, viegli izplatās

Individuālā riska līmenis

Nebūtisks Mērens Augsts Augsts

Sabiedriskā riska līmenis

Nebūtisks Mazs Vidējs Augsts

Ārstēšanas līdzekļu pieejamība

Nav nepieciešami

Viegli pieejami Pieejami Grūti pieejami

Infekciju izraisītāji

E.coli laboratorijas celmi, bakteriofāgi

E.coli dabas izolāti, gripas vīruss

B.anthracis, M.tuberculosis Hantavīrusi, HIV

Ebolas vīruss Mutes un nagu sērgas vīruss

Bioloģiskās drošības līmeņi

Bioloģiskās drošības līmeņi

Drošības līmenis

1 2 3 4

Telpas standarta laboratorijas telpas

Nodalītas laboratorijas, neuzsūcošas, viegli tīrāmas virsmas

Kontrolēta pieeja, dubultdurvis, duša, negatīvs spiediens, gaisa filtri, avārijas strāva

Specializētas, pilnīgi autonomi uzturamas un novērojamas telpas, slūžas

Drošības aprīkojums

Izlietne, laboratorijas halāts

Autoklāvs, laminārās plūsmas bokss (LPB, pirmā vai otrā klase) , cimdi, aizsargbrilles

Otrās klases LPB, riekšauti, galvas segas, īpaši apavi, sejas maskas

Trešās klases LPB, virsspiediena skafandri

Īpašas prasības

Standarta laboratorijas drošības tehnika

Prasības individuālajiem aizsardzības līdzekļiem, telpu dezinfekcija

Apmācīts personāls, atkritumu sterilizācija, darba drošības protokoli

Sertificēts personāls visu iekārtu un aprīkojuma sterilizācija

http://media.thestar.topscms.com/images/

I drošības klases bokss

II drošības klases

laminārās gaisa

plūsmas bokss

III drošības klases

laminārās gaisa

plūsmas bokss

HEPA filtrs high efficiency particulate air

HEPA filtrs high efficiency particulate airKritiskais daļiņu lielums -0,3 m

1,0-0,5 m

>1,0 m

< 0,2 m

Līdz 1950.- tajiem gadiem Pēc 1950. - tajiem gadiem

Vīrusi ir mazi Vīrusi nav šūnas

Vīrusi spēj vairoties Vīrusi nevairojas daloties

Vīrusi ir parazīti, izraisa infekcijas

Vīrusi var būt parazīti, komensāļi, simbionti utt.

Vīrusus audzē saimnieka vai aizstājēja organismā

Vīrusus audzē šūnu kultūrās

Vīrusi ir ģenētiski daudzveidīgāki nekā šūnas

VĪRUSU AUDZĒŠANA

Saimniekorganisms vai aizvietotājs

Dimitrijs Ivanovskis [Ивановский] (1864. - 1920.) Martins Beijerniks [Beijernick] (1851.-1931.)

Tabakas mozaīkas vīruss 1892. un 1898. gadā

VĪRUSU AUDZĒŠANA


Frīdrihs Leflers [Loeffler] (1852 -1915)

1898., lielopu mutes un nagu sērgas izraisītāju

neaiztur keramikas filtri

VĪRUSU AUDZĒŠANA


VĪRUSU AUDZĒŠANA


VĪRUSU AUDZĒŠANA


Felikss d’Errels [d’Herelle] (1873. - 1949.) Frederiks Tvorts [Twort] (1877.-1950.)

Bakteriofāgi, 1915. - 1917.g.

VĪRUSU AUDZĒŠANA


VĪRUSU AUDZĒŠANA


Makss Delbruks [Delbruck] (1906. - 1981.) Salvatore Luria [Luria] (1912.-1991.)

Vīrusu replikācijas mehānisms 1948./49. g.g., NP - 1969.g.


Fāga titrēšana, negatīvo koloniju tipi


Vistas embrija sistēma

Permisīvi un nepermisīvi organismi/audi/šūnas

Vīrusu inokulācija vistas embrija sistēmā

Baku vakcīnas un baku vīrusu veidotie mezgli uz vistas

embrija horioalantoja membrānas

Šūnu kultūra

Šūnu kultūra

L-aminoskābes ~0,1 – 0,2 mM

Vitamīni ~ 1 M

Sāļi Citi savienojumi Proteīni

Arginīns Cisteīns Fenilalnīns Glutamīns Histidīns Izoleicīns Leicīns Lizīns Metionīns Tiptofāns Tirozīns Treonīns Valīns

Biotīns Folskābe Holīns Nikotīn-skābes amīds Pantotēn-skābe Pirdoksāls Riboflavīns Tiamīns

NaCl KCl NaH2PO4

NaHCO3 CaCl2 MgCl2

Glikoze Penicilîns Streptomicîns Fenilsarkanais

Serums – FCS vai NCS Specifiski augšanas faktori Sterilizē filtrējot, pH ~ 7,4

Barotnes sastāvs

Harijs Īgls (Eagle)

Šūnu kultūra

Kultivēšanas telpas, invertētais mikroskops

Šūnu kultūraKultūru tipi

Džons Enders [Enders] (1897. - 1985.) Tomass Vellers [Weller] (1915. – 2008.) Frederiks

Robins [Robbins] (1916. – 2003.)Poliomielīta vīrusa audzēšana šūnu kultūrā

1949./50. g.g., NP - 1954.g.

Šūnu kultūra

Šūnu kultūra

Monoslāņi un daudziedobju plates

Šūnu kultūra

Laminārās plūsmas boksi

Šūnu kultūra

Pipetēšanas sistēmas

Šūnu kultūras inficēšana ar vīrusa NS (transfekcija)

Īslaicīga transfekcijaStabila transfekcija (ar integrāciju genomā)

Transfekcija ar ķīmiskām metodēm

Transfekcija ar fizikālām metodēm

http://cdn2.bigcommerce.com/

elektroporācija;optoporācija;transfekcija ar magnētiskām daļiņām;balistiskā transfekcija

Šūnu kultūra

CPE veidi

Renato Dalbeko [Dulbecco] (1914.-2012.) Vīrusu citopātisko un onkogēno īpašību pētījumi šūnu

kultūrās; NP - 1975

VĪRUSU IZMĒRI

Mimiviruss

Parvoviruss

VĪRUSU IZMĒRI

1 mikrometrs

VĪRUSU (PLAZMĪDU) IZDALĪŠANA

Šūnu dezintegrēšana

Šūnu ekstraktu frakcionēšana un koncentrēšana

Vīrusa (plazmīdas) attīrīšana

Šūnu dezintegrēšanaMehāniskās metodes - saberzšana, samalšana, saspiešana, ultraskaņa, hidrodinamiskā berze.

Kavitācijas pūslītis

French press

Šūnu dezintegrēšanaMehāniskās metodes - saberzšana, samalšana, saspiešana, ultraskaņa, hidrodinamiskā berze.

Šūnu dezintegrēšanaĶīmiskās metodes - lizēšana ar denaturējošu vielu palîdzību (sārmi, virsmas aktīvās vielas)

Fermentatīvās metodes - hidrolītisko fermentu izmantošana - lizocīms, proteāzes, celulāzes


Filtrēšana (filtrējošies vīrusi)

VĪRUSU IEGŪŠANA un ATTĪRĪŠANA

Šamberlēna pudele – keramikas filtrs


Filtrēšana



Filtrēšana



Filtrēšana - membrānu filtri 0,45/0,22 m



Filtrēšana: Amicon ultrafiltri molekulu sadalīšanai pēc masas


Precipitācija

Daļiņu hidratācijas apvalka noārdīšana, NaCl, CH3CHO2Na, LiCl. (NH4)2SO4

Centrifugēšana

Relatīvaiscentrifugēšanas spēks:

1000 g, 10 min 20 000 g, 20 min 80 000 g, 1 h 150 000 g, 3 h šūnas, kodoli, citoskeleta daïas

mitohindriji, lizosomas

mikrosomas ribosomas, vīrusi



Centrifugēšana

Sedimentācijas koeficients

Sedimentācijas koeficientu (s) mēra svedbergos (S)

1S = 10-13 sMolekula ar sedimentācijas koeficientu 10 S (10×10−13 s) pārvietosies 1 m/s (1x10-6 m) pie 100 K g (~106 m/s2), sedimentācijai 5 cm būs nepieciešamas ~ 14 stundas.

Teodors Svedbergs (1884.-1971.)

Ultracentrifūga, NP -1926.

Vīrusu (plazmīdu) attīrīšana

Centrifugēšana gradientā

Ultracentrifūgas

Beckman Optima 1000100 K rpm, 800 K g

Beckman Spinco L5-6565 K rpm, 400 K g



Ultracentrifūgas


Centrifugēšana



Rotoru tipi

Piekaru rotorsSW 55 Ti 55; K rpm; 368 K x g

Vertikālais rotorsVTi-50; 50 K rpm; 242 K x g


Centrifugēšana gradientāGradienta veidi

Kāpņveida gradienta iegūšana



Nepārtrauktā gradienta iegūšanaGradienta veidi



Centrifugēšanas paņēmieni

Izopikniskā (peldošā blīvuma)

centrifugēšana

Zonāla centrifugēšanaAdenovīrusa daļiņu

sadalījums izopikniskā gradientā

Plazmīdas DNS CCC un OC formas CsCl gradientā


HromatogrāfijaHromatogrāfijas veidi

Afīnā hromatogrāfijaGēla filtrēšana (molekulārais siets)

Jonu apmaiņas homatogrāfija


Hromatogrāfija

Plazmīdu un vīrusu DNS attīrīšana ar iepriekšsagatavotu anjonu apmaiņas kolonnu palīdzību (Qiagen; Gibco-BRL, u.c.)

Vīrusu attīrīšana ar afinitātes hromatogrāfijas palīdzību

Vīrusu (plazmīdu) raksturošana

Proteīnu un NS bioķīmijas metodes

Molekulārā klonēšana / gēnu

inženierija

Nukleīnskābju un proteīnu

hibridizācija

Sekvenēšana

PĶR analīze

VĪRUSU VIZUALIZĒŠANA

Gaismas mikroskopija

Tumšā lauka, fluoriscences un epifluoriscences, invertētā mikroskopija

Izšķirtspēja (d0): minimālais attālums, kurā var atšķirt divus punktus

0,61 – gaismas refrakcijas konstante – gaismas avota izstarotā gaismas viļņa garums – refrakcijas indekss (gaismas ātrums vakumā/gaismas ātrums vidē starp objektu un objektīva lēcu) – puse no lenķa, ko veido gaismas konuss pret objektīva atveri (apertūru)

http://www.mpibpc.mpg.de/groups/hell/PRESS_Detail_PRL_10.pdf

Mikroskopa izšķirtspēju ietekmējošie lielumi

Viļņa garums (nm) Redzamā gaisma 550

Ultravioletā gaisma <400 Elektronu starojums < 0,005

Refrakcijas koeficients

Gaiss 1,00 Ūdens 1,33

Imersijas eļļa 1,50

Maksimālā cilvēka acs izšķirtspēja (d0) – ~150 mMaksimālā izšķirtspēja (d0) gaismas mikroskopijā – ~170 nmMaksimālā izšķirtspēja (d0) elektronu mikroskopijā – ~0,2 nm

Tumšā lauka mikroskopija

Objektīvā nokļūst no parauga daļiņām atstarotā gaisma

http://www.lymediagnostic.com/wp-content/uploads/2012/07/Foto-4.gifhttp://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/dfield.gif

Gaismas mikroskopija

Fluorescence un epifluorescences mikroskopija

Gaisma ar īsāku viļņa garumu un lielāku enerģiju iedarbojas uz īpašiem savienojumiem, krāsvielām – fluorohromiem un ierosina tos izstarot lielāka viļņa garuma starojumu ar zemāku enerģiju. Zila gaisma ierosina zaļu fluorescenci, zaļa gaisma – sarkanu fluorescenci.

Baktērijas un vīrusveida daļiņas ūdenī, fluorescīns

Virulentas Mycobacterium tuberculosis, krāsots ar rodamīnuwww.mskcc.org/mskcc/html/10992.cfm

Lāzera skenējošā konfokālā fluorescences mikroskopija

Izgudrots 1961 g. MITMarvin Minsky (dz. 1927.)

Izšķiršanas spējas salīdzinājums fluorescences un lāzera skenējošā konfokālā fluorescences

mikroskopijā

Elektronu mikroskopija

Ernests Ruska

(1906 - 1988, NP - 1986.g.)

Pirmais elektronu mikroskops - 1933. g.

Pirmais pārdotais elektronu mikroskops (Siemens) - 1939. g.


Mikroskopijas veidu salīdzinājums. Gaismas, caurstarojošā un skenējošā elektronu mikroskopija

Nozīmīgāka par palielinājumu ir izšķirtspēja.

Šūnas kodola rajons pie 1000 x palielinājuma gaismas un elektronu mikroskopijā



JEOL JEM-100CJEOL JEM-7A


Priekšmetstila vietā - metāla (Cu) sietiņš


Preparātu sagatavošana

Apputināšana



Negatīvā kontrastēšana, ieslēgšana glutāraldehīda polimera blokā



Kontrastētu preparātu griešana - ultramikrotoms


Preparātu piemēri

Uzputināts preparāts (TEM) - virioni


Preparātu piemēri

Negatīvi kontrastēts preparāts (TEM) - virioni

Elektronu mikroskopijaPreparātu piemēri

Negatīvi kontrastēts un griezts preparāts (TEM) - virionu pumpurošanās,vīrusu “fabrika” šūnā


Uzputināts preparāts (SEM) - baktērijas, limfocīti


Uzputināts preparāts (TEM) - nukleīnskābju heterodupleksi

Elektronu mikroskopijaElektronu kriomikroskopija

ūdens vide


Ārons Klūgs [Klug] (1926, NP - 1982.)

Elektronu mikroskopijas

lietojums natīvu bioloģisku struktūru

pētījumos, t. sk. elektronu

kriomikroskopija

Heinrihs Rorers [Rohrer] (1933 - 2013, NP - 1986.)

Gerds Binnigs [Binnig] (1947, NP - 1986.)

Skenējošā tunelējošā (atomu spēka) mikroskopa izgudrošana

Virsmas skenēšanas mikroskopija

Virsmas skenēšanas mikroskopijaAtomu spēka mikroskopija (AFM)

http://www.nanomat.de/english/datenblaetter/tools_for_measuring_in_the_nanoscale.htm

Virsmas skenēšanas mikroskopijaAtomu spēka mikroskopija

Nanoscope - Digital Techniques LU ĶFI

Virsmas skenēšanas mikroskopija

Atomu spēka mikroskopija

Pielietojuma piemērihttp://www.parkafm.com/AFM_gallery/

http://www.icmm.csic.es/spmage/spmageview09.php?id=52

STED (stimulētās emisijas dzēšanas – Stimulated Emission Depletion)

mikroskopija Viens no 2006. gada “ top 10” sasniegumiem (Science, V314, dec.22, 2006)

Klar, T. A., S. Jakobs, M. Dyba, A. Egner and S. W. Hell (2000). Fluorescence microscopy with diffraction resolution limit broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15): 8206-8210.

Willig, K. I., S. O. Rizzoli, V. Westphal, R. Jahn, S. W. Hell (2006): "STED-microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis". Nature 440 (7086): 935–939.

STED mikroskopija, 2000. g. (EMBO, Heidelberga)Seffen Hell (dz. 1961., NP 2014.)

Membrānu proteīnu kopas

STED mikroskopijas princips

Vīrusu un proteīnu kristalogrāfija

1. attīrīšana;

2. kristalizācija;

3. kristāla ieregulēšana;

4. datu ievākšana;

5. datu apstrāde;

6. struktūras noskaidrošana;

7. struktūras precizēšana;

8. struktūras analīze.

http://www.jic.ac.uk/staff/david-lawson/xtallog/summary.htm

Vīrusu un proteīnu kristalogrāfija

Autrors Atklājums NPWilhelm Röntgen rentgena (X) stari 1901Max von Laue kristālos notiek X staru difrakcija 1914William Henry Bragg William Lawrence Bragg 1915James B. Sumner Preoteīni (ureāze) veido kristālus 1946John Kendrew, Max Perutz Mioglobīna un hemoglobīna struktūra 1962Francis Crick, John Watson, Maurice Wilkins DNS struktūra 1962Dorothy Hodgkin Vitamīna B12 struktūra 1964

Johan Deisenhofer, Robert Huber, Hartmut Michel Fotosintēzes reakcijas centra struktūra 1988 Paul D. Boyer, John E. Walker ATP sintetāzes strukt;ura 1997Peter Agre, Roderick MacKinnon Junu kanālu struktūra 2003Roger D. Kornberg Eikariotu RNS polimerāzes struktūra 2006Venkatraman Ramakrishnan, Thomas Steitz, Ada Yonath Ribosomas struktūra 2009Robert J . Lefkowitz, Brian K. Kobilka G-preteīna saistīto receptoru struktūra 2012

Rentgenstaru kristalogrāfijas slavas zāle

Jaunās paaudzes kristalogrāfija – neitronu izkliede, Lundas neitronu ģenerators, ESS / ESFRI

VIRUSOLOĢIJA (VĪRUSI UN ĀRPUSHROMOSOMU ĢENĒTISKIE ELEMENTI)

Documents