Vidljiva UV IRinstrumentalne.tmf.bg.ac.rs/Predavanja/3. Fluorimetrija.pdfuveo nemački naučnik Wiedemann 1888. godine, kao zajednički naziv za fluorescencu i fosforescencu. UVOD

Molekulska spektroskopija

APSORPCIONA Vidljiva UV IR

EMISIONA Fluorimetrija

Fluorimetrija

Molekulska emisiona spektroskopija u UV i vidljivoj oblasti

Rastvori koji pod UV svetlošću fluoresciraju u vidljivoj oblasti

UVOD - LUMINESCENCIJA

fenomen u kome se supstanca pobuđuje nekom vrstom spoljašnje energije, a zatim se apsorbovana energija emituje u formi svetlosti;

svetlost ne podrazumeva samo elektromagnetne talase u vidljivoj oblasti, već i u bliskoj UV i bliskoj IR.

Fenomen se pominje 1500 godina pre n.e. (svici); Aristotel, 4. vek pre n.e. (ribe); Termin luminescenca (lat. lumen - svetlost) je prvi

uveo nemački naučnik Wiedemann 1888. godine, kao zajednički naziv za fluorescencu i fosforescencu.

UVOD – FLUORESCENCIJA

Reč fluorescenca je uvedena da opiše pojavu karakterističnu za mineral fluorit (CaF2), kod koga je prvi put uočen kratki sjaj nakon ultraljubičaste ekscitacije;

traje koliko i ozračivanje (osvetljavanje)

UVOD –FOSFORESCENCIJA

fosforescenca se odnosila na dugotrajnu emisiju koja može trajati i satima nakon prestanka pobuđivanja;

traje i posle osvetljavanja.

Kako pobuđeni molekul oslobađa apsorbovanu energiju?

Neradijacioni prelazi – emituje se toplota Radijacioni prelazi - emituje se svetlost

Fluorofore

Teoretski sve supstance koje apsorbuju UV i VIS bi mogle da fluoresciraju

Većina, ipak, ne fluorescira, jer imaju strukturu koja omogućava neradijativne (brže) puteve relaksacije

Fluorofore su grupe atoma ili molekuli odgovorni za pojavu fluorescencije

Jedinjenja koja mogu da fluoresciraju

Nezasićena jedinjenja Konjugovana jedinjenja Policiklični aromatični ugljovodonici

Jedinjenja koja nemaju sposobnost fluoresciranja mogu se obeležavati fluorescirajućim agensima ili podvrgnuti hemijskim reakcijama u kojima će se dobiti

njihovi fluorescirajući derivati

Fluorimetar

Fluorimetar

Osnovni delovi fluorimetra

izvor zračenja primarni (ekscitacioni) monohromator uzorak sekundarni (emisioni) monohromator detektor

Pravac upadnog (ekscitacionog) i emitovanog (emisionog) zračenja je pod uglom od 90o To omogućava osvetljavanje detektora samo emitovanom svetlošću (ne upadnom ili reflektovanom sa uzorka).

IZVORI ZRAČENJA (200-900 nm)

Lampe (deuterijumova, vodonična) Ksenonska lampa daje intenzivan, relativno

kontinualan spektar između 200 i 800 nm

LED diode Laseri

PRIMENA

Kvalitativna analiza (indentifikacija nepoznatih supstanci) poređenjem maksimuma talasne dužine

emisionog zračenja nepoznate supstance sa podacima iz baze

Kvantitativna analiza

Niska granica detekcije posledica direktnog merenja inteziteta

proporcionalnog koncentraciji

Nepoznata koncentracija se određuje metodom kalibracione krive

PRIMENA

neorganska hemija, organska hemija, biohemija... detekcija sastojaka u tragovima u biološkim i ekološkim

uzorcima detekcija u hromatografiji i elektroforezi određivanje vitamina (B1, B2) u biološkim ekstraktima DNA sekvenciranje izučavanje vezivanja liganda u biološkim sistemima... luminescentne materijale sadrže televizori, monitori

računara, fluorescentne lampe, medicinski uređaji za rendgensko snimanje, laseri…

Prednosti fluorimetrije nad UV-Vis spektroskopijom

Visoka osetljivost (1000 puta niže koncentracije nego UV- Vis) Velika specifičnost (neznatna interferencija

drugih komponenti)

LUMINESCENCIJA

različite pojave emisije svetlosti nakon pobuđivanja supstance različitim vrstama energije, bez zagrevanja.

Prefiks u nazivu vrste luminescencije ukazuje upravo na metod kojim je izazvano pobuđivanje.

Fotoluminescencija – apsorpcija elektromagnetnog zračenja (fluorescencija i fosforescencija)

Hemiluminescencija - pobuđeni molekul se formira u hemijskoj reakciji

Bioluminescencija - proces se odvija u živim organizmima, energijom metaboličkih reakcija.

Luminescencija

Luminescencija u forenzici

Bioluminescencija