Enzymologie 3-1 2017 Zentrum Biochemie Versuch 3: Enzymologie Bitte einen eigenen Laptop für die Auswertung mitbringen, da im Computerraum nur eine begrenzte Anzahl an Computern vorhanden ist. Versuche: 1. Bestimmung der Serum-Acetylcholinesterase Aktivität - Acetylcholinesterase-Bestimmung im Serum - Hemmung des Enzyms mit Diisopropylfluorophosphat (DIFP) - Reaktivierung mit Pyridin-2-Aldoxim-Methyljodid (PAM) 2. Enzymkinetik der Laktatdehydrogenase - Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration - Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit von der Substrat (Pyruvat-) Konzentration - Zeichnen des Michaelis Menten Plot und der Lineweaver-Burk-Darstellung - Ermittelung von KM und vmax, Vergleich der ermittelten Werte aus dem Michaelis-Menten-Plot und der Lineweaver-Burk-Darstellung Wissensgebiete Einteilung der Enzyme in Enzymklassen Aktivierungsenergie einer Reaktion Einfluss von Katalysatoren auf die Aktivierungsenergie Reaktionen 0. und 1. Ordnung Reaktionsgeschwindigkeit Enzymatische Reaktionen Enzymsubstrat-Komplex Substratspezifität Substrat- und Enzymkonzentrations-Diagramme Hemmsubstanzen, Mechanismus der Hemmung Kompetitive und nicht kompetitive Hemmung, Beispiele Quantitative Bestimmung der enzymatischen Aktivität Einheit der Enzymaktivität: Katal (neu), Units (alt) Lineweaver-Burk-Diagramme Km-Bestimmung Wechselzahl pH- und Temperatur-Einfluss auf enzymatische Reaktionen Isoenzyme Multienzym-Komplexe und multifunktionelle Enzyme Regulation der Enzymaktivität, Allosterie, negative Rückkopplung, Beispiele Neurotransmitter, Beispiele Acetylcholinesterase, Inhibitoren und Enthemmer Optische Eigenschaften sowie Coenzymfunktionen von NAD + , NADP + und FAD Optischer Test Kombinierter optischer Test (Kofaktor-gekoppelte Reaktion)
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Enzymologie 3-1
2017 Zentrum Biochemie
Versuch 3: Enzymologie
Bitte einen eigenen Laptop für die Auswertung mitbringen, da im Computerraum nur eine begrenzte Anzahl an Computern vorhanden ist.
Versuche: 1. Bestimmung der Serum-Acetylcholinesterase Aktivität
- Acetylcholinesterase-Bestimmung im Serum
- Hemmung des Enzyms mit Diisopropylfluorophosphat (DIFP)
- Reaktivierung mit Pyridin-2-Aldoxim-Methyljodid (PAM)
2. Enzymkinetik der Laktatdehydrogenase
- Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration
- Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit von der Substrat (Pyruvat-) Konzentration
- Zeichnen des Michaelis Menten Plot und der Lineweaver-Burk-Darstellung
- Ermittelung von KM und vmax, Vergleich der ermittelten Werte aus dem Michaelis-Menten-Plot
und der Lineweaver-Burk-Darstellung
Wissensgebiete
Einteilung der Enzyme in Enzymklassen
Aktivierungsenergie einer Reaktion
Einfluss von Katalysatoren auf die Aktivierungsenergie
Reaktionen 0. und 1. Ordnung
Reaktionsgeschwindigkeit
Enzymatische Reaktionen
Enzymsubstrat-Komplex
Substratspezifität
Substrat- und Enzymkonzentrations-Diagramme
Hemmsubstanzen, Mechanismus der Hemmung
Kompetitive und nicht kompetitive Hemmung, Beispiele
Quantitative Bestimmung der enzymatischen Aktivität
Einheit der Enzymaktivität: Katal (neu), Units (alt)
Lineweaver-Burk-Diagramme
Km-Bestimmung
Wechselzahl
pH- und Temperatur-Einfluss auf enzymatische Reaktionen
Isoenzyme
Multienzym-Komplexe und multifunktionelle Enzyme
Regulation der Enzymaktivität, Allosterie, negative Rückkopplung, Beispiele
Neurotransmitter, Beispiele
Acetylcholinesterase, Inhibitoren und Enthemmer
Optische Eigenschaften sowie Coenzymfunktionen von NAD+, NADP+ und FAD
Optischer Test
Kombinierter optischer Test (Kofaktor-gekoppelte Reaktion)
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Einführung
Bei reversiblen chemischen Reaktionen stellt sich ein Gleichgewicht ein. Im Gleichgewichtszustand ist
die Geschwindigkeit von Hin- und Rückreaktion gleich schnell. Katalysatoren erhöhen nur die Ge-
schwindigkeit der Reaktion und beschleunigen damit die Gleichgewichtseinstellung; sie beeinflussen
aber nicht die Lage des Gleichgewichts. Enzyme sind in der Regel Proteine, die als Katalysatoren
fungieren.
Die International Union of Biochemistry and Molecular Biology hat 1961 und 1964 Regeln für die
Nomenklatur der Enzyme aufgestellt. Die Enzyme werden in sechs Hauptklassen eingeteilt, die jeweils
gleiche chemische Reaktionstypen katalysieren.
1. Oxidoreduktasen
übertragen Wasserstoff zwischen zwei Reaktionspartnern. Zu ihnen gehören die Dehydro-
genasen, Hydroxylasen und Oxigenasen.
2. Transferasen
katalysieren die Übertragung von Atomgruppen oder ganzen Molekülen zwischen zwei
Reaktionspartnern. Untergruppen dieser Klasse sind die "Kinasen": Carboxyl-Transferasen,
Amino-Transferasen, Glycosyl-Transferasen und Acyl-Transferasen.
3. Hydrolasen
sind Ester-, Peptid- und Glycosylbindungen spaltenden Enzyme. Bekannte Enzyme wie Pep-
sin, Chymotrypsin, Trypsin, Renin und Papain gehören dazu.
4. Lyasen
katalysieren die nichthydrolytische Spaltung kovalenter Bindungen: Decarboxylasen, Aldola-
sen, Dehydratasen.
5. Isomerasen
epimerisieren ein optisch aktives C-Atom oder racemisieren optisch aktive Verbindungen.
6. Ligasen
führen zur Verknüpfung zweier Substratmoleküle unter gleichzeitiger Spaltung von ATP in
AMP und Pyrophosphat. Wichtige Vertreter dieser Gruppe sind die Synthetasen, z.B. Amino-
acyl-tRNS-Synthetasen, Acyl-CoA-Synthetasen oder auch die Carboxylasen.
Die in Braunschweig angesiedelte Enzymdatenbank Brenda ist das zur Zeit ausführlichste
Informationssystem für alle Aspekte der zur Zeit bekannten Enzyme.
Die Enzymaktivität bestimmt man, indem Enzym und Substrat bei bestimmter Temperatur,
bestimmtem pH-Wert, definierter Substrat- und Enzymkonzentration sowie in Gegenwart erforderlicher
Kofaktoren inkubiert und die Reaktion in Abhängigkeit von der Zeit verfolgt. Der Umsatz muss
photometrisch zu verfolgen sein.
Enzymologie 3-3
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1) Reaktionen 1. Ordnung
Bei einer Reaktion 1. Ordnung hängt die Reaktionsgeschwindigkeit nur von der Konzentration des
Substrats ab. Das gängige Beispiel ist der radioaktive Zerfall. Welche Enzymreaktion ist eine Reaktion
erster Ordnung?
Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten k einer Reaktion 1. Ordnung
[1]
v = Reaktionsgeschwindigkeit k = Geschwindigkeitskonstante [S] = Substratkonzentration t = Zeit
[2]
Wenn x die Substratmenge ist, die in der Zeit t umgesetzt wurde, und a die Substrat-
Anfangskonzentration bei t = 0 ist, so gilt:
[3]
[4]
[5]
[6]
Bei der Halbwertszeit t½ ist x = a/2. Daraus ergibt sich:
[7]
2) Reaktionen 2. Ordnung
Die enzymatischen Reaktionen sind Reaktionen 2. Ordnung: Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt von
Konzentrationen zweier Komponenten ab, der Substrat- und der Enzymkonszentration.
[8]
[E] = Enzymkonzentration (mg Protein)
[S] = Substratkonzentration (µMol/l)
Die Berechnung der Substratkonzentration in der Zeit t wird jedoch kompliziert.
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[9]
Man kann die Behandlung dieses Systems vereinfachen, indem man:
1. Substrat im Überschuss einsetzt oder
2. die Enzymkonzentration konstant hält.
1. Substratüberschuss: Die Reaktionsgeschwindigkeit ist proportional der Enzymkonzentration
Die Bestimmung der LDH zur Erkennung und Beobachtung von Herzerkrankungen und
Muskelerkrankungen ist durch den Ersatz besserer Marker (z.B. Troponin, CK-MB) abgelöst worden.
Stark erhöhte Werte der LDH-Aktivität finden sich bei Hämolyse, Vitamin B12/Folsäuremangel,
Herzinfarkt, Lebererkrankungen und malignen Erkrankungen. Ebenso können körperliche Arbeit und
Leistungssport zur Erhöhung führen.
Prinzip:
Die Pyridinnukleotide NAD+ und NADP+ können reversibel Wasserstoff aufnehmen. Ihre Funktion als
Coenzym vieler Dehydrogenasen (Oxidoreduktasen) beruht auf dieser Fähigkeit. Bei der Hydrierung
wird der aromatische Charakter des Nikotinsäureamid-Ringsystems aufgehoben. Das entstandene Di-
hydropyridin-Ringsystem besitzt eine spezifische Lichtabsorption mit einem Maximum von 340 nm, die
bei NAD+ fehlt. Man kann daher die Umwandlung von NAD+ in NADH und umgekehrt mit dem
Photometer messen.
NAD+ NADH
Enzymologie 3-14
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Abbildung 3-10: Absorptionsspektren von NADH und NAD+. Die Konzentration des gebildeten bzw. verbrauchten NADH oder die Konzentration der entsprechenden Reaktionspartner der Enzyme werden mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes berechnet.
Pyruvat wird von Laktatdehydrogenase (LDH) in Gegenwart von NADH nach folgender Gleichung zu
L+-Laktat reduziert.
CH3-CO-COO- + NADH + H+ CH3-CH(OH)-COO- + NAD+
Die Gleichgewichtskonstante dieser Reaktion ist bei 25 °C:
K = [Laktat]/[Pyr] = 3,6 . 1011 l/mol
Pyruvat wird daher praktisch vollständig zu Laktat reduziert.
Abbildung 3-11: NADH Verbrauch als indirekter Nachweis der Pyruvat-Umsetzung nach Zugabe der
LDH
Enzymologie 3-15
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Durchführung der Versuche
I. Bestimmung der Serum-Acetylcholinesterase-Aktivität
1. Bestimmung der Acetylcholinesterase-Aktivität
2. Hemmung der Acetylcholinesterase mit Diisopropylfluorophosphat (DIFP)
3. Reaktivierung mit Pyridin-2-aldoximmethyljodid (PAM)
II. Enzymkinetik der Lactatdehydrogenase
1. Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration
2. Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit von der Substrat (Pyruvat-) Konzentration
3. Zeichnen des Michaelis-Menten-Plot und der Lineweaver-Burk-Darstellung
4. Ermittelung von KM und vmax, Vergleich der beiden Werte aus dem Michaelis-Menten-Plot und
der Lineweaver-Burk-Darstellung
Enzymologie 3-16
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I. Bestimmung der Serum-Acetylcholinesterase-Aktivität
1. Bestimmung der Acetylcholinesterase-Aktivität
2. Hemmung der Acetylcholinesterase mit Diisopropylfluorophosphat (DIFP)
3. Reaktivierung mit Pyridin-2-aldoximmethyljodid (PAM)
die Acetylcholinesterase katalysiert die Umsetzung von Acetylthiocholinjodid zu Thiocholin
indirekter kolorimetrischer Nachweis von Thiocholin mit 5,5‘-Dithio-bis-(2-nitro-benzoesäure)
als Indikator, welches zur gelb gefärbten 5-Mercapto-2-nitrobenzoesäure reduziert wird
Photometer auf λ= 405 nm einstellen
in vier beschriftete Küvetten werden folgende Lösungen pipettiert:
Photometer vor jeder Zeitmessreihe mit Küvette 1 (Leerwert) nullen!
nach 1, 3, 5, 10, 15, 20 min Extinktionen der Küvetten 2-4 im Photometer messen, indem die
Küvette ins Photometer gestellt und der Wert abgelesen wird
Werte in die Tabelle 1.1 eintragen
Achtung: DIFP ist hoch toxisch!!!!
Küvetten-Nr. 1
Leerwert
2
Aktivität
3
Hemmung
4
Reaktivierung
5,5‘-Dithio-bis-(2-nitro-
benzoesäure) 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
Serum (enthält
Acetylcholinesterase) 20 l 20 l 20 l 20 l
DIFP (Hemmstoff) 50 l - 50 l 50 l
Jede Lösung mit dem Plastikspatel gut mischen und 5 min warten, dann PAM in die
angegebenen Küvetten geben !!
PAM (Enthemmer) 50 l - - 50 l
Jede Lösung mit dem Plastikspatel gut mischen und 10 min warten, dann Substrat in
die angegebenen Küvetten geben!!
Acetylthiocholinjodid (Substrat) - 100 l 100 l 100 l
Jede Lösung mit dem Plastikspatel gut mischen!
Achtung Reaktion startet jetzt, da Substratzugabe!!!! Zeit nehmen!!
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Tabelle: 1.1
Zeit nach
Substratzugabe
Werte für
Aktivität
Werte für
Hemmung
Werte für
Reaktivierung
1 min
3 min
5 min
10 min
15 min
20 min
a) Stellen Sie die Ergebnisse graphisch mit Excel dar (X,Y-Diagramm). (Extinktion gegen Zeit)
b) Berechnen Sie die Acetylcholinesterase-Aktivität in der Einheit U/l im normalen,
gehemmten und reaktivierten Zustand.
c) Diskutieren Sie die Graphen für Aktivität, Hemmung und Reaktivierung. Was sind die
Unterschiede? Welche Aussage kann man anhand der Ergebnisse machen ?
Die Aktivität wird mit Hilfe von Steigungsdreiecken aus dem linearen Bereich der Kurven bestimmt, die
Extinktionsveränderung der Kurve pro Minute (E/t) angegeben und mit Hilfe des Lambert-
Beerschen Gesetz berechnet. Wichtig: Wählen Sie für alle drei Fälle (Normalzustand, gehemmter
und reaktivierter Zustand) den gleichen Zeitraum (z.B. immer zwischen der 1. und 3. Minute, oder
zwischen der 1. und 5. Minute).
E=*c*d
E : aus Werten errechnen [z.B. E(405nm)5 min - E(405nm)1min] t : aus Werten errechnen [z.B. 5 min - 1min] d : 1 cm : 13,3 * 103 [l/(mol * cm)] c/min : umgesetztes Substrat/min [mol/(l * min)] VF : Verdünnungsfaktor (Enzym) für jede Küvette unterschiedlich daher einzeln
berechnen, z.B Plastikküvette I (3120 l : 20 l = 156) (Gesamtvolumen:Volumen Serum)
Unit : 1 mol Substratumsatzerhöhung / min [Vorsicht: mol in mol umrechnen (x 106)]
ΔE c/min [U/l] = x VF
d * * t
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II. Enzymkinetik der Lactatdehydrogenase
1. Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration
die Laktatdehydrogenase katalysiert die Umwandlung von Pyruvat zu Laktat mit Hilfe von
NADH, das dabei zu NAD+ oxidiert wird
NADH besitzt im Gegensatz zu NAD+ ein zusätzliches Extinktions-Maximum bei λ= 340nm;
dadurch kann der Verbrauch von NADH photometrisch bestimmt werden
Photometer auf =340nm einstellen
Photometer mit H2O nullen
Lösungen in die bereitgestellten Küvetten pipettieren und mit einem Plastikspatel gut mischen!
(Spatel zwischendurch abwischen), eine Küvette zurückhalten für H2O um das Photometer zu
nullen!
Pipettierschema:
REAKTION STARTET JETZT! DIREKT ZEIT MESSEN!
alle 15 sec in einem Zeitraum von 2 min die Extinktion ablesen und in Tabelle 2.1
eintragen (Die Küvette bleibt die ganze Zeit im Photometer stehen!)