VARIASI GENETIK EMPAT VAR. PADI UNGGUL DENGAN ANALISIS RAPD MENGGUNAKAN 2 PRIMER OPR OLEH : Panagal M*., John B*., Arun K.**, Ali A.*** DKK. *Dept. BIOTEK. LINGK., Plant Science Univ. BHARATHIDASAN, TAMIL NADU, INDIA. **Dept. BIOTEKNOLOGI, PERG. TINGGI Marudhu Pandiyar, TAMIL NADU, INDIA. *** Dept. Kimia, Univ. Nasional PUKYONG, BUSAN KOREA SELATAN. Sumber : ARPN Journal Of Agricultural and Biological Science Vol. 5, No. 4, July 2010 Dikaji kembali : BAMBANG SURYOTOMO (Surakarta, 28 Juni 2013) (TUGAS BIOMOL & REKAYASA GENETIKA)
24
Embed
VARIASI GENETIK EMPAT VAR. PADI UNGGUL DENGAN ANALISIS RAPD MENGGUNAKAN 2 PRIMER OPR
VARIASI GENETIK EMPAT VAR. PADI UNGGUL DENGAN ANALISIS RAPD MENGGUNAKAN 2 PRIMER OPR. OLEH : Panagal M*., John B*., Arun K.**, Ali A.*** DKK. *Dept. BIOTEK. LINGK., Plant Science Univ. BHARATHIDASAN, TAMIL NADU, INDIA. - PowerPoint PPT Presentation
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
VARIASI GENETIK EMPAT VAR. PADI UNGGUL DENGAN ANALISIS RAPD
MENGGUNAKAN 2 PRIMER OPR OLEH :
Panagal M*., John B*., Arun K.**, Ali A.*** DKK.*Dept. BIOTEK. LINGK., Plant Science Univ. BHARATHIDASAN, TAMIL NADU, INDIA.
**Dept. BIOTEKNOLOGI, PERG. TINGGI Marudhu Pandiyar, TAMIL NADU, INDIA.*** Dept. Kimia, Univ. Nasional PUKYONG, BUSAN KOREA SELATAN.
Sumber : ARPN Journal Of Agricultural and Biological ScienceVol. 5, No. 4, July 2010
Dikaji kembali :BAMBANG SURYOTOMO(Surakarta, 28 Juni 2013)
(TUGAS BIOMOL & REKAYASA GENETIKA)
RINGKASAN-1
1. Untuk mengetahui keanekaragaman Genetik 4 Genotipe Padi (Oryza sativa ) digunakan Marker (Penanda) acak RAPD.
2. Genom DNA Padi (O. sativa ) diisolasi dari daunnya, dan dihitung menggunakan Spktrofotometer sinar UV serta diampliflikasi dgn menggunakan Primer OPR1 dan OPR2.
3. Dgn OPR1, Genom DNA 4 Genotipe Padi yg diamplifikasi, memberikan fragmen yang Non-Polymorfik (tidak dapat membedakan dari keempatnya).
RINGKASAN-2
4. Dgn OPR2, Genom DNA dari 4 Genotipe yg diam-plifikasi, menujukkan fragment yg Polymorfik. (dapat membedakan dari keempatnya).
5. Dgn menggunakan Software Jarak Genetik Nei’s (1978) dapat ditentukan variasi kekerabatan Genotipe padi yg diuji.
6. Kekerabatan Genotipe padi yg diuji secara berurutan adalah: ADT38, ASD16, IR20 dan PONNI (Gb.4)
7. Dari hasil tsb dapat digunakan sebagai bahan pertim-bangan untuk menghasilkan Hibrida dgn Heterosis yang maksimum (yg diinginkan).
PENDAHULUAN-1
• Beras mrpk tan.penting di dunia, menyediakan banyak kalori. Saat ini 90% beras diproduksi dan dikonsumsi di Negara-2 Asia (Parantha-man et al., 2009).
• Di India, dalam tahun 2003-2004, 87 juta ton beras, yg dipro-duksi dari daerah 42,41 juta ton (James Martin, 2007).
• Permintaan beras diperkirakan pd thn 2010, 100 juta ton dan akan meningkat menjadi 140 juta ton pd thn 2025 (Singh, 2004).
• Beras memp. Genom terkecil dr semua jenis cereal; 430 juta Nukleotida, dapat menjadi model genom tanaman berbunga
PENDAHULUAN-2
1. Genotipe ADT 38 Adaptip pada wil.dgn Irigasi yg tidak teratur Tahan thd embusan angin, tahan belalang,
Gall midge, Daya hasil = 58kw/ha2. Genotipe ASD 16 Toleran salinitas, cenderung tahan Wereng
penggerek batangDaya hasil 45 kw/ha.4. IR 20Tahan thd hama bakteri daun, Virus tungro,
penggerek batangDaya hasil 45 kw/ha.
PENDAHULUAN-4• Saat ini PCR (Polymeration Chain Reaction)
berbasis RAPD (Randomly Amplified Polymor-phic DNA) lebih murah & sederhana diban-dingkan RFLP (Retriction Fracment Length Polymorphism) (William et al., 1990).
• Keuntungan RAPD, sederhana, DNA sedikit, mampu meregenerasi polymorfisme.(Yu& Ngu yen, 1994). Memp.Primer Universal, butuh primer sedikit unt. Identifikasi polymorfisme suatu Spesies. Krn itu penel. Ini dilakukan
Bahan dan Metoda-1
1. Bahan Tanaman Empat Var. biji O. sativa yi, PONNI, ADT38, IR20, & ASD 16, Diperoleh dari Bank-benih dr Univ. Pertanian , India. Benih ditanam dalam pot pada kondisi laboratorium.
2. Isolasi Genom DNA Metode Isolasi menurut Sambrook et. Al., (1989) dgn sedikit
modifikasi. Contoh daun tan. (0,5 g/kg) digiling dgn 1 ml buffer yg homogen.
1 ml sample lysis kmd disentrifugasi pada kecep.8000 rpm selama 10 menit pada suhu 4⁰ C. Supernatan dipindahkan dalam tabung baru berukran 1,5 ml dan dicampur dngn Fenol, Isoamyllalcohol disentrifugasi pada 1.000 rpm selama 10 Menit pada suhu 4⁰
Bahan dan Metoda-2
3. Gel Elektrofrensis15 µl DNA dicampur dgn Pewarna bermuatan
(Genei, Bangalore), dan diloading pd 0.8% Gel Agarosa.
Genomik DNA dielektroforensis pd 75 Volt selama 1 jam, dan Amplifikasi PCR dilakukan selama 1-2 jam pd 55 Volt.
Gel diwarnai dgn Etidium Bromida dan disinari dengan UV untuk visualisasinya (Bend2nya)
Bahan dan Metoda-3
4. Penghitungan DNA dgn Spektrofotometer UV
Sampel DNA yg diisolasi diukur dgn Spektrofotometer sinar tampak UV. Dgn absorbansi pada 260-280 nm, maka Konsentrasi DNA dapat ditentukan.
Konsentrasi DNA = OD260 x 50 µg/ml x faktor pengenceran.
5. Primer Primer Acak disintesis di Genei Bangalore. Panjang masing2 Primer 10 bp (pasang basa), dgn urutan sequen
sbb: Primer Sequence
OPR1 GCACCGATCT
OPR2 GATTCCGCGG
Bahan dan Metode-4
6. Reaksi RAPD-PCR Reaksi amplifikasi dilakukan men. Saker et al. (2005) dgn
sedikit modifikasi, yg berisi Template (1.5 µl), Primer (1 µl), Campuran Enzim induk (12,5 ml) dan Air Milli Q (10 ml).
Amplifikasi dilakukan pd siklus termal DNA pd profile PCR; Pre denaturasi pd 94⁰C selama 5 menit, 36 siklus pd 94⁰C selama 30 dtik, 36⁰C selam 30 dtk dan 72⁰C selama 1 menit dan akhir ekstensi pd 72⁰C selama 5 menit, produk akhirnya diamplifikasi pd 4⁰C.
15 µl produk (DNA) diamplifikasi pd 2% Gel Agarosa dgn Ethidum Bromida. Elektroforensis tampak pd sinar UV
Bahan dan Metoda-5
7. Analisis Data Analisis dilakukan dgn membandingkan Pola RAPD
setiap individu Genom DNA sempel. Fragmen yg memberikan marker jelas/kuat untuk
setiap individu diberi skor shg muncul pd grafik data. Pola pita Gen dievaluasi berdasarkan Jarak Genetik
Nei’s (1978) dgn Program Free-Tree-Free (Pavlicek et al., 1999).
Pohon Filogenetic dibuat dengan bantuan Software
Hasil dan Pembahasan-1
1. Genom DNA padi yg diisolasi dan diuji dg. Elelektroforensis, menghasilkan pita yang beragam dgn konsentrasi 3,8-93 ng.(Gbr. 1).
2. Dgn Primer OPR1 Genom 4 Var yg diuji menghslkan 27 pita yg memp. 300-1600 ps basa (bp),Primer tsb Tidak Bisa membedakan genom ke-4 Var. Padi yg diuji (dgn Primer OPR1 Amplifikasi Genon DNA Padi yg diuji, menunjukkan Non Polymorphic, pola pita identik, gbr. 2).
Hasil dan Pembahasan - 23. Dgn Primer OPR2, hsilnya lebih informatif di-
banding Primer OPR1, artinya dgn Primer OPR2 dapat menunjukkan Pola pita yg ber-beda dari 4 Var. Genom padi yg diuji. (gb.3).
4. Analisis RAPD dgn Primer OPR2 yg memp. sequence GATTCCGCGG dpt digunakan untuk membedakan pola pita genom DNA padi yg diuji dan menganalisis hub. kekerabatan (dgn menggunakan Dendrogram UPGMA, Gb. 4).
Ilustrasi PCR berbasis RAPD
Ilustrasi Genomic DNA
Hasil Analisa Elektroforensis GENOM DNA Padi (Oryza sativa) yg diuji (Gb. 1)