NILMARA SANTANA DE OLIVEIRA VARIABILIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE Ricinus communis (EUPHORBIACEAE) PELA METODOLOGIA DE DAF (DNA AMPLIFICATION FINGERPRINTING) Dissertação de Mestrado Programa de Pós-Graduação em Genética Universidade Federal de Pernambuco Recife, PE Março, 2004
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VARIABILIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE Ricinus ...€¦ · OLIVEIRA, NS (2004) Variabilidade genética em Ricinus communis (Euphorbiaceae) através de DAF. 8 SUMÁRIO Página
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Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Genética.
Orientadora: Profª Drª Ana Maria Benko-Iseppon, Depto. de Genética, Centro de Ciências Biológicas, UFPE, Recife, PE.
Co-Orientador: Prof. Dr. Reginaldo de Carvalho, Depto. de Genética, Centro de Ciências Biológicas, UFPE, Recife, PE
Recife, PE Março, 2004
OLIVEIRA, NS (2004) Variabilidade genética em Ricinus communis (Euphorbiaceae) através de DAF.
Departamento de Biologia Universidade Federal do Rural de Pernambuco
Profª Drª Ana Christina Brasileiro Vidal Departamento de Botânica
Universidade Federal de Pernambuco
Prof. Dr. Reginaldo de Carvalho Departamento de Genética
Universidade Federal de Pernambuco Membros Suplentes
Prof. Dra. Neide Santos Departamento de Genética
Universidade Federal de Pernambuco
Prof. Dr. Leonardo Pessoa Felix Departamento de Agronomia
Universidade Federal da Paraíba
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A Deus, aos meus pais Gilbete
e Neto, às minhas irmãs e
irmãos, aos demais familiares
e a Daniel Plácido, dedico este
trabalho.
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“Quem não sonha, não realiza. Quem não ousa, não conhece seus limites”
Arquimedes Bastos
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AAGGRRAADDEECCIIMMEENNTTOOSS
A Deus, pelo dom da vida.
Aos meus pais, Gilbete e Neto, por todas as coisas que fizeram e fazem por seus filhos.
Aos meus irmãos e familiares por estarem sempre ao meu lado.
Ao meu noivo, Daniel Plácido, pelo amor e incentivo constantes.
À Ana Maria Benko Iseppon, pela orientação nesse trabalho e pela confiança durante a realização do mesmo.
A Reginaldo de Carvalho, pela co-orientação, apoio e amizade.
Aos professores Catarina Zita, Maria Helena Zucon, Myrna Landim, Ricardo Scher e Silmara Pantaleão, da Universidade Federal de Sergipe, pela iniciação na pesquisa científica e pelo aprendizado que serviu como base para chegar até aqui.
À Fabiola Spiaggia, por sua paciência e grandeza para ensinar e aprender.
À Claudete Maria Marques, por sua amizade e constante disposição de ajudar em todos os momentos.
A Adriano Barbosa, por sua alegria contagiante e pelo auxílio na análise in sílico dos dados.
A Jailson Gitaí, Maria Rita Sales e Mário Correia por compartilharem experiências e por toda ajuda recebida.
Aos meus colegas de Laboratório, Carol, David, Diego, Geyner, Lidiane, Luca, Natalia, Nina, Rafaela e Rodrigo pelo convívio do dia-a-dia.
Aos Professores Constância Ayres, Ederson Kido e Oswaldo Pompílio, pela colaboração laboratorial e em especial a Paulo Paes de Andrade.
À Professora Mônica Carvalho pela oportunidade de lecionar e aprender no estágio de iniciação à docência.
Aos Professores da Pós-Graduação em Genética que contribuíram para meu aprendizado.
A todos os meus colegas de curso, em especial a Amaro, Brígida, e Márcio, pelos momentos compartilhados.
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Aos Funcionários da Pós-Graduação e do Departamento de Genética e também a Márcio Pires pelo auxílio e apoio técnico dispensados.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) por viabilizar a realização deste trabalho com a concessão de bolsa de estudo.
A Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife-PE, em especial ao Departamento de Genética pela oportunidade de uso das suas instalações e laboratórios para a realização deste trabalho.
Por fim, agradeço a todos que direta ou indiretamente ajudaram na realização deste trabalho.
Muito Obrigada.
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SSUUMMÁÁRRIIOO
Página
Lista de Tabelas 10
Lista de Figuras 11
Lista de Abreviaturas 12
Resumo 14
1- Introdução 15
2- Revisão da Literatura 16
2.1- A espécie Ricinus communis L. – Classificação Botânica 16
2.2- Centro de Origem e Distribuição Geográfica 18
2.3- Importância Econômica 18
2.3.1. Importância no Brasil e na Região Nordeste 18
2.3.2. A Mamona e seus Produtos 19
2.4- Recursos Genéticos 21
2.5- Programas de Melhoramento da Mamona 21
2.6- Caracterização Genética 23
2.6.1. - Estudos Citogenéticos 23
2.6.2. - Marcadores Moleculares 25
2.7- Importância dos Marcadores Moleculares em Plantas 27
2.8- Informações Moleculares Disponíveis em R. communis 28
2.9- Análises Fenéticas e Filogenéticas incluindo Marcadores Moleculares
29
3- Referências Bibliográficas 31
4- Manuscrito de Artigo Científico
Genetic Diversity in Subspontaneous Populations
of Ricinus communis (Euphorbiaceae) Revealed
by DAF (DNA amplification Fingerprinting)
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5- Informações Complementares 61
5.1. Detalhamento do Protocolo de Extração de DNA 62
5.2. Limpeza do DNA Genômico 62
5.3. Planilha de Dados para Análise pelo Programa PHYLIP 63
6- Abstract 64
7- Conclusões 65
8- Anexos 66
8.1- Anexo 1: Instruções para Autores do Periódico Genetics and Molecular Biology
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8.2- Anexo 2: Instruções para Autores do Periódico Euphytica 70
OLIVEIRA, NS (2004) Variabilidade genética em Ricinus communis (Euphorbiaceae) através de DAF.
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LLIISSTTAA DDEE TTAABBEELLAASS
Manuscrito
Table 1. List of R. communis genotypes studied including accession identification, provenance and collection time. All Brazilians plants have been collected in the field by the authors
55
Table 2. Primers tested in the first round of selection (four genotypes) with sequence (5´-3´), number of amplicons and of polymorphic bands. Primers are ordered according to number or polymorphisms in decreasing order (from most to less informative primers)
56
Table 3. Primers tested in all 16 genotypes with sequence(5´-3´), number of amplicons and of polymorphicbands. Primers are ordered according to number orpolymorphisms in decreasing order (from most toless informative primers)
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LLIISSTTAA DDEE FFIIGGUURRAASS
Manuscrito
Figure 1. Representative pictures of R. communis phenotypes observed in Brazilian populations
58
Figure 2. A representative picture of DAF products with polymorphisms generated by the primers OP-C11 and OP-C02 in the genotypes of Ricinus communis
59
Figure 3. Consensus unrooted tree (out of 190 000 parsimonious trees) generated from DAF-Data by Maximal Parsimony method and bootstrap analysis after Wagner
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OLIVEIRA, NS (2004) Variabilidade genética em Ricinus communis (Euphorbiaceae) através de DAF.
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LLIISSTTAA DDEE AABBRREEVVIIAATTUURRAASS
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados
AL Alagoas
bp Base Pairs
Pares de Bases
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CCB Centro de Ciências Biológicas
CENARGEN Centro Nacional de Recursos Genéticos e Biotecnologia
CMA3 Cromomicina A3
CNPA Centro Nacional de Pesquisa do Algodão
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
DAPI 4´-6-diamidinofenilindol
DAF DNA Amplification Fingerprinting
Impressão Genômica do DNA Amplificado
DF Distrito Federal
DNA Desoxiribonucleic Acid
Ácido Desoxirribonucléico
dNTP Dinucleotídeo Trifosfato
EBDA Empresa Baiana de Desenvolvimento Agrícola S/A
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
ESTs Expressed Sequence Tags
Etiquetas de Seqüências Expressas
FACEPE Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de Pernambuco
h Hora
ha Hectare
IAC Instituto Agronômico de Campinas
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IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IPA Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária
kb kilo bases
MIX Mixed Method Discrete Caracters Parsimony
Método Mixto de Parsimônia de Caracteres Discretos
NCBI National Center for Biotechnology Information
Centro Nacional de Informação Biotecnológica
nr Número
OP Operon
PB Paraíba
PCR Polymerase Chain Reaction
Reação em Cadeia da Polimerase
PHYLIP Phylogeny Inference Package
Pacote de Inferência Filogenética
R$ Real – Moeda Brasileira
RAPD Random Amplification Polymorphism of DNA
Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição
s Segundo
Taq Thermophylus aquaticus
UFPE Universidade Federal de Pernambuco
UFRPE Universidade Federal Rural de Pernambuco
U Unidade
US$ Dólar – Moeda Americana
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RREESSUUMMOO
O Brasil ocupa mundialmente a terceira posição na produção de mamona (Ricinus
communis L.). Embora existam muitos estudos moleculares voltados às proteínas expressas nas
sementes, não existem até o momento análises com marcadores moleculares avaliando a
diversidade genética dessa espécie. O presente trabalho estudou a variabilidade genética de 16
genótipos de populações subespontâneas de mamona adquiridas através de coletas em quatro
diferentes localidades de Pernambuco e em duas outras regiões do Brasil, comparando-as a
acessos cultivados de quatro outros países. Para isso a metodologia de DAF (DNA
amplification Fingerprinting) foi utilizada, permitindo a geração de em média 14 bandas por
primer, sendo 10,72 polimórficas, a partir de 11 primers. Para a construção da matriz de dados
143 bandas foram analisadas, perfazendo 2.288 caracteres. A análise filogenética de máxima
parsimônia revelou uma diversidade genética significativa, entre genótipos da mesma
população, considerando os diferentes pontos de coleta no Brasil, bem como comparativamente
com acessos cultivados no exterior. O estudo confirma a variabilidade sugerida pelos
melhoristas para as populações subespontâneas de mamona e demonstra a eficiência deste tipo
de marcador para estudos de caracterização de germoplasma desta importante cultura vegetal.
PPAALLAAVVRRAASS--CCHHAAVVEE:: Ricinus communis, Mamona, Marcadores de DNA, DAF, DNA
Amplification Fingerprinting.
OLIVEIRA, NS (2004) Variabilidade genética em Ricinus communis (Euphorbiaceae) através de DAF.
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11-- IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO
O gênero Ricinus pertence à família Euphorbiaceae, uma das maiores dentre as
Angiospermae, compreendendo cerca de 300 gêneros e 8000 espécies, distribuídas
principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do mundo (Webster, 1987; 1994). As espécies
mais conhecidas desta família são a mandioca (Manihot esculenta Crantz), a seringueira (Hevea
brasiliensis Müell Arg.) e a mamoneira (Ricinus communis L.).
A mamoneira (R. communis L.) pertence ao gênero Ricinus, o qual é considerado
atualmente um gênero monotípico. Em vista de sua ampla ocorrência e distribuição, existem
controvérsias sobre a origem de R. communis, considerando-se que possa ter-se originado no
continente africano ou no asiático (Hemerly, 1981). A Etiópia e o leste da África são apontados
como os principais centros de diversidade, ao lado de outros centros secundários (Moshkin, 1986;
Webster, 1994).
O Brasil é um dos maiores produtores mundiais de mamona e um dos maiores
exportadores do seu principal produto, o óleo, que é extraído das sementes (Hermerly, 1981;
Carvalho et al., 2002). É possível encontrar a mamoneira em praticamente todo o Brasil de forma
subespontânea, mas a importância comercial de seus produtos e subprodutos tem despertado o
interesse do governo e dos pesquisadores para trabalhos objetivando o cultivo racional e
econômico desta cultura (Savy-Filho, 1999). A mamonocultura no Brasil tem a maior produção
no Nordeste, mais precisamente, no Estado da Bahia (Hemerly, 1981; Carvalho et al., 2002).
A mamoneira pode ser totalmente aproveitada, pois tudo o que ela produz tem
utilização na indústria ou na própria agricultura, além de perspectivas de uso como fonte
energética (biodiesel). A mamonocultura em certas áreas do semi-árido nordestino é a mais
rentável cultura de sequeiro, contribuindo como cultura alternativa, devido à presença de
condições favoráveis ao seu desenvolvimento e a sua adequação à agricultura familiar,
colaborando também na fixação de mão-de-obra e auxiliando na geração de empregos e de
matéria-prima industrial (Azevedo et al., 1998; Parente, 2003).
O melhoramento genético da mamona vem sendo direcionado principalmente à
otimização de caracteres como porte da planta, tamanho e teor de óleo da semente, precocidade,
deiscência da cápsula, produtividade, resistência às pragas e doenças (Moreira et al., 1996; Savy-
Filho, 1999; Freire et al., 2001). As mamoneiras possuem uma taxa de alogamia, ou fecundação
cruzada, de até 40%, proporcionando um aumento da variabilidade genética. Por outro lado, essa
alogamia dificulta a fixação e a manutenção de cultivares melhoradas (Freire et al., 2001).
OLIVEIRA, NS (2004) Variabilidade genética em Ricinus communis (Euphorbiaceae) através de DAF.
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Marcadores bioquímicos ou moleculares como isoenzimas, podem contribuir com
programas de melhoramento genético, caracterizando com segurança um genótipo a partir de
células ou tecidos, detectando polimorfismos para alelos de um determinado gene ou de pequenos
fragmentos de DNA, permitindo acelerar o processo de seleção e recombinação dos indivíduos
desejáveis (Ramirez et al., 1991; Ferreira e Grattapaglia, 1998; Benko-Iseppon, 2001). Weising et
al. (1995) efetuaram uma ampla revisão bibliográfica sobre marcadores do tipo Fingerprinting de
DNA (Impressão Genômica do DNA). Tais marcadores são considerados altamente informativos,
em vista da complexidade de locos que acessam concomitantemente, prestando-se para distinguir
inclusive indivíduos proximamente relacionados.
Segundo os últimos levantamentos bibliográficos, o presente trabalho, realizado em
populações de R. communis, é um dos pioneiros no estudo molecular desse gênero, bem como no
uso da metodologia de DAF.
O presente estudo objetivou realizar uma caracterização genética com o auxílio de
marcadores moleculares em algumas populações de R. communis, ocorrentes principalmente no
estado de Pernambuco, através da metodologia de DAF (DNA Amplification Fingerprinting),
visando inferir sobre a diversidade genética dessa espécie.
22-- RREEVVIISSÃÃOO DDAA LLIITTEERRAATTUURRAA
2.1- A espécie Ricinus communis L.. –– Classificação Botânica
A mamoneira (Ricinus communis L.) pertencente à família Euphorbiaceae,
subfamília Acalyphoideae, tribo Acalypheae, subtribo Ricininae, e ao gênero Ricinus, o qual é
considerado monotípico. A família Euphorbiaceae por sua vez, está entre as maiores das
Angiospermae, compreendendo cerca de 300 gêneros e 8000 espécies, distribuídas
principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do mundo (Webster, 1987; 1994).
A taxonomia de Ricinus é bastante complexa, havendo divergência entre os sistemas
de classificação. Bayma (1958), por exemplo, sugeriu que o gênero seria composto por sete
variedades: (1) R. communis var. communis, (2) R. communis var. sp., (3) R. communis var.
viridis, (4) R. communis var. inermis, (5) R. communis var. zanzibarensis, (6) R. communis var.
sanguineus e (7) R. communis var. minor. Por outro lado, Popova e Moshkin (1986) descreveram
seis subespécies do gênero: (1) R. communis ssp. zanzibarinus G. Pop., (2) R. communis ssp.
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communis, (3) R. communis ssp. indicus G. Pop. et V. Moshk, (4) R. communis ssp. ruderalis G.
Pop. et V. Moshk., (5) R. communis ssp. sinensis G. Pop. et V. Moshk., (6) R. communis ssp.
persicus G. Pop., além de 25 variedades botânicas. Mais recentemente, Savy-Filho (1999)
reconheceu a existência de apenas quatro subespécies: (1) R. communis var. zanzibarensis, (2) R.
communis var. africanus, (3) R. communis var. sinensis e (4) R. communis var. persicus, bem
como 25 variedades botânicas.
Indivíduos da espécie R. communis apresentam-se polimórficos, com hábito
predominantemente arbustivo, podendo em alguns casos atingir até dez metros de altura (Popova
e Moshkin, 1986). Em geral, o sistema radicular da mamoneira é do tipo axial, com uma raiz
principal pivotante e as demais raízes laterais. Suas folhas são simples, longo-pecioladas e
palmatilobadas. As plantas possuem uma grande variação em suas características, principalmente
quanto à coloração de caule, folhas, frutos e sementes, além da ocorrência, ou não, de cera no
pecíolo e/ou no caule. Os frutos podem ser deiscentes ou indeiscentes, tricocas, na sua maioria
com acúleos, triloculares, com sementes que variam de tamanho, formato, cor e teores de óleo
(Savy-Filho, 1999; Beltrão et al., 2001).
Trata-se de uma planta monóica com inflorescência racemosa, formando cachos
terminais. As flores femininas ocupam a porção superior e as masculinas a parte basal da
inflorescência, proporcionando dois tipos de reprodução: autofecundação e fecundação cruzada,
sendo sua polinização geralmente anemófila. Embora seja considerada uma planta autógama por
alguns pesquisadores, o nível de alogamia pode atingir até 25% nas mamoneiras de porte anão e
40% nas de alto porte, o que favorece a heterogeneidade e a mistura varietal. Por outro lado, esta
ocorrência dificulta o estabelecimento e a manutenção de cultivares melhoradas (Savy-Filho,
1999; Beltrão et al., 2001; Freire et al., 2001).
A maturação das flores femininas ocorre aproximadamente cinco a dez dias antes
das flores masculinas caracterizando o fenômeno da protoginia, o que proporciona a manutenção
da taxa de alogamia (Savy-Filho, 1999; Beltrão et al., 2001). A quantidade de flores masculinas e
femininas, bem como a produção da planta, estão diretamente ligados às condições ambientais,
tipos de solo e idade da planta. Em solos férteis, por exemplo, com nutrição adequada, condições
hídricas e temperatura satisfatórias, as flores femininas aparecem em maior número (Savy-Filho,
1999), enquanto altas temperaturas, deficiência hídrica e aumento da idade da planta favorecem o
desenvolvimento de flores masculinas (Weiss, 1983). Em condições normais, a mamoneira se
desenvolve adequadamente em clima quente e úmido. A temperatura ideal é cerca de 20oC a
OLIVEIRA, NS (2004) Variabilidade genética em Ricinus communis (Euphorbiaceae) através de DAF.
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30oC, e a exigência hídrica no período vegetativo é de, no mínimo, 100 mm de chuva por mês
Sharp, P.J., Kreiss M., Shewry P. & M.D. Gale 1988. Location of b-amylase sequences in
wheat and its relatives. Theor Appl Genet 75: 289-290
Simon, M.V., Resende, L.V., Benko-Iseppon, A.M., Winter, P. & G. Kahl, 2002. Aplicabilidade
da análise de fingerprinting de DNA na determinação da diversidade genética intra e
interespecífica do gênero Vigna. Hortic Bras 20(2): 1-5.
Webster, G.L., 1987. The saga of the spurges: a review of classification and relationships in the
Euphorbiales. Bot J Linn Soc 94: 3-46.
Webster, G.L., 1994. Synopsis of the genera and suprageneric taxa of Euphorbiaceae. Ann Miss
Bot Gard 81: 33-144.
OLIVEIRA, NS (2004) Variabilidade genética em Ricinus communis (Euphorbiaceae) através de DAF.
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Winter, P., Benko-Iseppon, A.M., Hüttel, B., Ratnaparkhe, M., Tullu, A., Sonnante, G., Plaff, T.,
Tekeoglu, M., Santra, D., Sant., V.J., Rajesh, P.N., Kahl, G. & F.J. Muehlbauer, 2000. A
linkage map of the chickpea (Cicer arietinum L. genome based on recombinante inbred lines
from a C. arietinum x C. reticulatum cross: localization of resistence genes for fusarium wilt
races 4 and 5. Theor Appl Genet 101: 1155-1163.
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Table 1 List of R. communis genotypes studied including accession identification, provenance and collection time. All Brazilians plants have been collected in the field by the authors
Accession Identification
Provenance, collection time
Bras-Bno-Gre Brazil, Alagoas state, city of Barra Nova, restinga vegetation, 300 m from the beach. Collected in July/2003.
Bras-Car-Gre-01
Bras-Car-Gre-02
Bras-Car-Gre-03
Brazil, Pernambuco state, city of Carpina, semi-arid vegetation, near Engenho Caraúba. Individual 1, 2, 3. Collected in Setember/ 2003.
Bras-Rec-Gre-D1*
Bras-Rec-Gre-D2*
Brazil, Pernambuco state, city of Recife, Dois Irmãos Village, near an area of natural Atlantic forest. Individual 1, 2. Collected in July/2003.
Bras-Rec-Red-S1*
Bras-Rec-Lre-S2
Brazil, Pernambuco state, city of Recife, ruderal area, Setúbal village (Boa Viagem Beach). Individual 1, 2. Collected in July/ 2003.
Bras-Rec-Red-S3 Brazil, Pernambuco state, city of Recife, ruderal area, Setúbal village (Boa Viagem Beach). Individual 3. Collected in 1997.
Bras-Rec-Red-S4 Brazil, Pernambuco state, city of Recife, ruderal area, Setúbal village (Boa Viagem Beach). Individual 4. Collected in June/1996.
Fran-Vcf-Gre France, city of Ville de Clermont-Ferrand, Jardin Botanique de Clermont-Ferrand. Index Seminum 2000.
Germ-Ham-Gre* Germany, city of Hamburg, Botanical Gardens of the Hamburg University. Index Seminum 1997.
Germ-Old-Gre Gemany, city of Oldenburg, Botanical Gardens of the Oldenburg University. Index Seminum 1999.
Japa-Kyo-Gre Japan, Kyoto city, The Nippon Shiniaky Institute for Botanical Research. Index Seminum 1998.
Port-Gsl-Gre Portugal, city of Porto, Porto University, Botanical Institute Dr. Gonçalo Sampaio – Lordelo do Ouro. Index Seminum 1997.
Port-Por-Gre Portugal, city of Porto, Science Faculty of the Porto University, Hortus Botanicus. Cat. Nr. 099. Index Seminum 2002.
First letters of accession identification designates the country of provenance (Bras=Brazil; Fran=France; Germ=Germany; Japa=Japan; Port=Portugal), second group of three letters refers to the city of provenance or collection, third group of three letters refers to the predominant color of the leaves and petioles at the time of collection (Gre=green; Red=red; Lre=redish leaves with red petioles). For the collections from Recife, two different populations have been considered, designed by the letter D=Dois Irmãos and S=Setúbal. The sign * after accessions number indicate genotypes that have been used for selection of primers listed in Table 2
OLIVEIRA, NS (2004) Variabilidade genética em Ricinus communis (Euphorbiaceae) através de DAF.
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Table 2 Primers tested in the first round of selection (four genotypes) with sequence (5´-3´), number of amplicons and of polymorphic bands. Primers are ordered according to number or polymorphisms in decreasing order (from most to less informative primers)
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Table 3 Primers tested in all 16 genotypes with sequence (5´-3´), number of amplicons and of polymorphic bands. Primers are ordered according to number or polymorphisms in decreasing order (from most to less informative primers)
Order Primer Sequence 5´- 3´
Number of Amplicons
Number of Polimorphic
Bands
1. OP-A04 AATCGGGCTG 23 23
2. OP-C11 AAAGCTGCGG 18 15
3. OP-G05 CTGAGACGGA 15 15
4. OP-C05 GATGACCGCC 15 13
5. OP-C19 GTTGCCAGCC 14 10
6. OP-G03 GAGCCCTCCA 11 10
7. OP-AB09 GGGCGACTAC 10 09
8. OP-C02 TTGAGGCGTC 11 09
9. OP-D05 TGAGCGGACA 07 07
10. OP-B05 TGCGCCCTTC 07 06
11. OP-A13 CAGCACCCAC 12 01
Total number of generated bands 143 118
Average number of bands generated per primer 13.0
10.72
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Figure 1 RepBrazilian popbrownish leavwith bright re
A
resentative pictures of R. culations. A. Completely grees with bright red petioles ad petioles and fruits. Pictures
C
B
ommunis phenotypes observed in en leaves and petioles; B. Red-nd fruits; C. Light brownish leaves from Benko-Iseppon.
58
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Figure 2 A representative picture of DAF products with polymorphisms generated by the primer OP-C11 and OP-C02 in the genotypes of R. communis. Fragment size for polymorphic bands (in bp) are indicated in the picture, as calculated from a 100 bp of DNA ladder (L). Order of the genotypes: (1) Fran-Vcf-Gre; (2) Port-Por-Gre; (3) Bras-Bno-Gre; (4) Bras-Rec-Red-S3; (5) Bras-Red-Red-S4; (6) Bras-Car-Gre-01; (7) Bras-Car-Gre-02; (8) Bras-Car-Gre-03; (9) Bras-Rec-Red-S1; (10) Bras-Rec-Lre-S2; (11) Bras-Rec-Gre-D1; (12) Bras-Rec-Gre-D2; (13) Port-Gsl-Gre; (14) Germ-Ham-Gre; (15) Japa-Kyo-Gre; (16) Germ-Old-Gre. First letters of accession identification designates the country of (Bras=Brazil; Fran=France; Germ=Germany; Japa=Japan; Port=Portugal), second group of three letters refers to the city of provenance or collection, third group of three letters refers to the predominant color of the leaves and petioles at the time of collection (Gre=green; Red=red; Lre=redish leaves with red petioles). For the collections in Recife, two different populations have been considered, designed by the letter D=Dois Irmãos and S=Setúbal.
OLIVEIRA, NS (2004) Variabilidade genética em Ricinus communis (Euphorbiaceae) através de DAF.
Figure 3 Consensus unrooted tree (out of 190 000 parsimgenerated from DAF-Data by Maximal Parsimony method aanalysis after Wagner. Numbers in the base of the branches indicate necessary for the construction of the emerging clade. First letters of accessdesignates the country of provenance (Bras=Brazil; Fran=France; GJapa=Japan; Port=Portugal), second group of three letters refers to the city collection, third group of three letters refers to the predominant color ofpetioles at the time of collection (Gre=green; Red=red; Lre=redish leaves wFor the collections in Recife, two different populations have been considered,letter D=Dois Irmãos and S=Setúbal.
V
O
K
N
M
L
C
A B Group I C
D
60
H
I
F
G
J
E
U
a
Group II Basal Clades
onious trees) nd bootstrap number of steps ion identification erm=Germany;
of provenance or the leaves and ith red petioles). designed by the
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Revista GGEENNEETTIICCSS AANNDD MMOOLLEECCUULLAARR BBIIOOLLOOGGYY
ISSN 1415-4757 Ribeirão Preto, Brasil
OLIVEIRA, NS (2004) Variabilidade genética em Ricinus communis (Euphorbiaceae) através de DAF.
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Genetics and Molecular Biology - NOTICE TO CONTRIBUTORS Scope and policyGenetics and Molecular Biology (formerly named Revista Brasileira de Genética/Brazilian Journal of Genetics - ISSN 0100-8455) is published quarterly by the Sociedade Brasileira de Genética (Brazilian Society of Genetics). The Journal considers contributions that present the results of original research in genetics, evolution and related scientific disciplines. Although Genetics and Molecular Biology is an official publication of the Brazilian Society of Genetics, contributors are not required to be members of the Society. It is a fundamental condition that submitted manuscripts have not been and will not be published elsewhere. With the acceptance of a manuscript for publication, the publishers acquire full and exclusive copyright for all languages and countries. The use of registered names and trademarks does not imply, even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations and therefore free for general use. Submission of papers1. Manuscripts should be submitted to:Fábio de Melo Sene, Editor-in-Chief Genetics and Molecular Biology Rua Capitão Adelmio Norberto da Silva, 736 14025-670 Ribeirão Preto, SP - Brasil2. A submission package sent to the Editorial Office must contain:a. A cover letter signed by all authors stating that they
have approved the submission of the manuscript and that the findings have not been published or are not under consideration for publication elsewhere;
b. Three copies of the manuscript and figures. c. Two copies of any unpublished or in-press
companion articles referred to in the submission. d. A copy of the text, tables and figures on a disk. Be
sure that the disk is adequately protected; if a disk arrives damaged, a new disk will be requested, causing delays in publication. Formats for text are Word or RTF, in Windows platform. Images in TIF or JPG formats should be sent in separate files (For Figures, see detailed instructions in 3.1.g). Disk must be labeled with the first author’s last name, platform and software. (See detailed instructions below). Failure to adhere to these guidelines can delay the handling of your contribution, and manuscripts may be returned before being reviewed.
3. Categories of Contribution:3.1.Research ArticlesManuscripts must be written in English in double-spaced, 12-point type throughout, including the References Cited section, appendices, tables and legends; printed on one side only of A4 paper with 2.5 cm margins; marked with consecutive page numbers, beginning with the cover page. The following elements must start on a new page and be ordered as they are listed below: a) The title page must contain: a concise and informative title; the authors’ names (first name at full length); the authors’ institutional affiliation, including department, institution, and city, state or province, and country;
different affiliations indicated with superscript numbers; a short running title of about 35 characters, including spaces; up to five key words; the corresponding author’s name, postal address, phone and fax numbers and email address. The corresponding author is the person responsible for checking the page proofs, and arranging for the payment of color illustrations and author alterations charges. b) The Abstract must be a single paragraph that does not exceed 200 words and summarizes the main results and conclusions of the study. It should not contain references. c) The text: must be as succinct as possible. Text citations: articles should be referred to by authors’ surnames and date of publication; citations with two authors must include both names; in citations with three or more authors, name the first author and use “et al”. Only articles that are published or in press should be cited. In the case of personal communications or unpublished results, all contributors must be listed by initials and last name (“et al” should not be used). Numbers: In the text, numbers nine or less must be written out except as part of a date, a fraction or decimal, a percentage, or a unit of measurement. Use Arabic numerals for numbers larger than nine. Avoid starting a sentence with a number. Binomial Names: Latin names of genera, species and intraspecific taxa in the text must be printed in italics; names of orders and families should be in the Title. The text includes the following elements: Introduction – Description of the background that led to the study. Material (or Subjects) and Methods – Details relevant to the conduct of the study. Statistical methods should be explained at the end of this section. Results – Undue repetition in text and tables should be avoided. Comment on significance of results is appropriate but broader discussion should be part of the Discussion section. Discussion – The findings of the study should be placed in context of relevant published data. Ideas presented in other publications should not be discussed solely to make an exhaustive presentation. Some manuscripts may require different formats appropriate to their content. d) The Acknowledgments must be a single paragraph that immediately follows the discussion and includes references to grant support. e) The References Section: citations must be ordered alphabetically by the first author; only articles that are published or in press should be included; personal communications must be cited within the text; journal titles must be abbreviated according to Medline (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/jrbrowser.cgi). Genetics and Molecular Biology Sample journal article citation: Breuer ME and Pavan C (1955) Behaviour of polytene chromosomes of Rhynchosciara angelae at different stages of larval development. Chromosoma 7:371-386. Bertollo LAC, Takahashi CS and Moreira-Filho O (1978) Cytotaxonomic consideration on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Rev Bras Genet 1:103-120. Sample book citation
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Salzano FM and Freire-Maia N (1967) Populações Brasileiras. Companhia Editora Nacional and EDUSP, São Paulo, 178 pp. Dobzhansky T (1951) Genetics and Origin of Species. 3rd edition. Columbia University Press, New York, 364 pp. Sample chapter-in-book citation: Carvalho A, Monaco LC and Krug CA (1966) Melhoramento genético das plantas e sua repercussão econômica. In: Pavan C and da Cunha AB (eds) Elementos de Genética. 2nd ed. EDUSP and Companhia Editora Nacional, São Paulo, pp 587-653. Sample abstracts in meeting citation: Basile R (1973) Cromossomos Politênicos em células nutritivas de ovócitos de ovário atrofiado de Rhyncosciara. Ciênc e Cult 25 (suppl): 248. XXV Reunião Anual da SBPC, Rio de Janeiro, Brazil. Sample Thesis/Dissertation citation: Frota-Pessoa O (1953) Revision of the Tripunctata group of Drosophila with description of fifteen new species. PhD Thesis, Universidade do Brasil, Rio de Janeiro. f) Tables each table must start on a new page. A concise title should be provided above the table. Tables must be numbered consecutively in Arabic numerals. Each column must have a title in the box head. Footnotes, typed directly below the table, should be indicated in lowercase superscript numbers. g) Figures must be numbered consecutively in Arabic numerals. Legends should be typed on a separate sheet. Three sets of illustrations of the highest quality must be provided, one original and two copies in glossy paper. If you have created figures electronically, submit them also as hard copies. Scanned figures should not be submitted. Images should be in TIF or JPG format and provided in separate files. Figures in Word format cannot be published. Journal quality reproduction will require grayscale and color at resolution yielding 300 ppi. Authors should submit bitmapped line art at resolution yielding 600–1200 ppi. These resolutions refer to the output size of the file; if it is anticipated that images will be enlarged or reduced, the resolutions should be adjusted accordingly. Identify each illustration by affixing on the back a label containing: the number of the figure, the name of the first author, and an arrow indicating top of illustration. Illustrations supplied on disks must follow instructions in item 2 (Submission package). Color illustration can be accepted, but authors are asked to defray the cost. For costs of color figures, check with the Editorial Office. h) Nomenclature: current standard international nomenclature should be adhered to. i) Sequences may appear in text or in figure. DNA must be sequenced on both strands. DNA, RNA , or protein sequences equal to or greater than 50 units must be entered into appropriate data bank and the accession number must be provided before publication of the article. Long sequences requiring more than two pages to reproduce will not be published unless the Editorial decision is that the publication is necessary. Complete mtDNA sequence will not be published. j) Data access: reference should be made to availability of detailed data and materials used for reported studies. k) Ethical issues: Reports of experiments on live vertebrates must include a brief statement that the work was approved by the institutional review board. For experiments involving human subjects, authors must also include a statement that informed consent was obtained
from all subjects. If photos or any other identifiable data are included, a copy of the signed consent must accompany the manuscript. 3.2 Short Communications present brief observations that do not warrant full-length articles. They should not be considered preliminary communications. Their format is that of full-length article. The text must be kept to a minimum. 3.3 Letters to the Editor relate or respond to recent published items in the journal. Discussions of political, social and ethical issues of interest to geneticists are also welcome in this form. 3.4 Review Articles are welcome. 3.5 Book Reviews: publishers are invited to submit books on Genetics, Evolution and related disciplines, for review in the journal. 3.6 History, Story and Memories: accounts on historical aspects of Genetics relating to Brazil. 4. Proofs: Page proofs will be sent to the corresponding author. Changes made to page proofs, apart from printer’s errors, will be charged to the authors. Notes added in proof require Editorial approval.
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Euphytica International Journal of Plant Breeding
Manuscripts should be written in standard English and four good, clear, legible copies containing original figures should be submitted to the:
Editorial Office Euphytica Kluwer Academic Publishers P.O. Box 990 3300 AZ Dordrecht The Netherlands The author should retain a copy of the manuscript. Manuscripts should be typed double-spaced throughout on one side of DIN A4 paper (21 x 29 cm or 8.5 x 11 inch), with sufficiently wide margins (3-5 cm). All pages (including the tables, figures, legends and references) should be numbered consecutively. The manuscript should be arranged in the following order (typed cap. + lower case): Title page (page 1) • Title (the title should be as short as possible, but
should contain adequate information regarding the contents).
• Subtitle (this may be used to supplement and thereby shorten an excessively long main title).
• Author‘s full name (if more than one, use ’&‘ before the last name).
• Affiliation(s)/Address(es). Key words/Abstract/Abbreviations (page 2) • Key words (maximum of 6, in alphabetical
order, suitable for indexing). • Abstract (brief and informative, not to exceed
250 words). • Abbreviations (arranged alphabetically, only
those which are not familiar and/or commonly used). Main text • The relative importance of headings and
subheadings should be clear. The approximate location of figures and tables should be indicated in the margin. New paragraphs should be indicated by clear indentation.
• The use of footnotes should be avoided. However, if essential, they should be typed on the appropriate pages, but clearly separated from the text with a line above them.
After the main text • Acknowledgements (also grants, support etc. if
any) should follow the text and precede the references.
References • The literature references should be arranged
alphabetically, typed double-spaced and in text referred to as: author and year of publication, e.g.: (Dawson 1987). Citations of personal communications and unpublished data should be avoided, unless absolutely necessary. Such citations should in text appear only as: (E.D. Smith, personal communication), and not in the reference list.
• Abbreviate titles of periodicals according to the style of the Bibliographic Guide for Editors and
Authors (Biosis, Chemical Abstract Service and Engineering Index, Inc., 1974).
• Follow the style shown below: Periodicals Dawson, W.O. & C. Boyd, 1987. TMV protein synthesis is not translationally regulated by heat shock. Plant Molec Biol 8: 145-149. Books (edited by someone other than author of article) Lefebvre, D.D. & J.-F. Laliberte, 1987. Mammalian metallothionein functions in plants. In: D.P.S. Verma (Ed.), Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions, pp. 32-40. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht. Books (identical author and editor) Bonga, J.M. & D.J. Durzan, 1987. Cell and Tissue Culture in Forestry. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht.
Tables • Each table should be typed on a separate
page. • Tables should be numbered with arabic
numerals, followed by the title. Horizontal rules should be indicated; vertical rules should not be used. Table-footnotes should be marked with superscript letters.
• Each table should be mentioned in the text. • Tables may be edited by the publisher to
permit more compact typesetting. Figures • Each figure should be mentioned in the
text. • Line drawings should be in a form
suitable for reproduction without modification. Extremely small type should be avoided as figures are often reduced in size.
• Photographs should be supplied as black-and-white, high-contrast glossy prints. Colour plates may be inserted at the author‘s own expense.
• Figures as well as legends should be identified by arabic numbers. Where multi-part figures are used, each part should be clearly identified in the legend, preferably with (lower case) letters.
• The top of the figure should be indicated on the back. Figures which need to be placed landscape should be avoided if possible.
• Identify each illustration, on the back, by lightly writing author‘s name and figure number.
Nomenclature Taxonomical
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• Binary nomenclature; names and genera and higher categories may be used alone.
Genetic • Applications of the terms phenotype and
genotype should be in accordance with Demerec et al. (Genetics 54:61-74, 1966).
• For summaries of the abbreviations, consult Journal of Bacteriology, Instructions to Authors.
Abbreviations and units Only SI units and abbreviations should be used. Abbreviations should be explained when they first appear in the text. If a non-standard abbreviation is to be used extensively, it should be defined in full on page 2 as mentioned above. Whenever in doubt use SI (System International) units. Format 1. We strongly prefer manuscripts typed on IBM-
compatible computers, with operating system MS DOS (versions 3.2 or higher), and wordprocessing package WordPerfect (4.2 or higher).
2. We also accept files in most other wordprocessing packages, that run under MS DOS, and Apple Macintosh diskettes.
3. If this combination is not available to you, please contact us as soon as possible.
4. If you work with the Graphical User Interface Windows or on a Macintosh computer, use only regular fonts like Courier, Times, Helvetica or standard Symbol.
Do‘s 1. File. Identify your file clearly with a sensible
name. Make absolutely sure that you send us your final version, and that the printout is identical to what you have saved on the diskette.
2. Consistency. Be absolutely consistent and check the use of punctuation, abbreviations, capitals and lower case in headings, spelling, etc. If possible, use the spelling checker on your computer.
3. Special characters. If the ASCII character set or the character set(s) of your wordprocessing package does not contain the special characters you need, key in a code between angle brackets and use this each and every time you want the character to appear. Note: Always supply us with a list of the codes that you have used!
4. Headings. Start headings etc. flush left, with two space lines above (i.e. three Hard Returns) and one space line below (two Hard Returns). Distinguish different levels of headings and be consistent.
5. Paragraphs. Indent all paragraphs with a [TAB] code, and separate them from one another with one Hard Return.
6. Block quotations should be indented with an [Indent] code and should have one space line (i.e. two Hard Returns) above and below.
7. Figures should be submitted in camera-ready form. The position of the figure in the text should be indicated in the margins of the hard copy. Figure legends should be placed at the end of your file.
8. Tables. We prefer tables to be submitted in camera-ready form. If you also put your tables on diskette, please separate columns with [TAB] codes (not with spaces) and, consequently, adjust the tabular stops to position the columns.
9. Equations. One-line equations without fractions can be typeset from the diskette when they are keyed in as plain text. Other equations can not be used from the diskette: they will be typeset manually from the hard copy.
10. References and Notes. Strictly follow the Instructions for Authors of the journal in which the article will be published for the style of referencing and the use of notes.
Don‘ts 1. Hyphenation. Do not hyphenate words at
the end of a line. Use only one hyphen for words such as ’’well-being‘‘, and ’’re-do‘‘ and use two hyphens for sequences of dates and years such as ’’conference dates are 12--15 September, 1992‘‘, ’’age groups between 20--30 years are welcome‘‘, and page number indications in References, e.g. ’’pp. 240--243‘‘.
2. Hard Returns. Do not use Hard Returns except when absolutely necessary, such as at the end of paragraphs, headings, etc. Otherwise, let the word wrap feature of your wordprocessor do this work for you.
3. TAB feature and Spacebar. If you need more than one space between two items, e.g. when you write in columns, always use the [TAB] feature of your wordprocessing package. Use the spacebar only for separating words from one another. Do not use the spacebar to format tables, for centering or laying out texts, or for any other form of line or page formatting.
Proofs Proofs will be sent to the corresponding author by e-mail (if no e-mail address is available or appears to be out of order, proofs will be sent by regular mail). Your response, with or without corrections, should be sent within 72 hours. Please do not make any changes to the PDF file. Minor corrections (+/- 10) should be sent as an e-mail attachment to: [email protected]. Always quote the four-letter journal code and article number and the PIPS No. from your proof in the subject field of your e-mail. Extensive corrections must be clearly marked on a printout of the PDF file and should be sent by first-class mail (airmail overseas). Offprints Fifty offprints of each article will be provided free of charge. An order form for additional offprints (both hard copies and PDF files) will be sent to the corresponding author. The corresponding author receives a copy of the issue containing her/his article free of charge.