UMinho | 2016 Universidade do Minho Escola de Engenharia Vânia Isabel Novais Cunha Pôjo Seleção de Microalgas com Potencial de Produção de Biocombustíveis Janeiro de 2016 Vânia Isabel Novais Cunha Pôjo Seleção de Microalgas com Potencial de Produção de Biocombustíveis
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UM
inho |
2016
Universidade do Minho
Escola de Engenharia
Vânia Isabel Novais Cunha Pôjo
Seleção de Microalgas com Potencial
de Produção de Biocombustíveis
Janeiro de 2016
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Dissertação de Mestrado
Mestrado em Bioengenharia
Trabalho efetuado sob a orientação do
Professor Doutor Giuliano Marcelo Dragone Melnikov
Onde Pbiomassa é a produtividade da biomassa e Cf é o conteúdo final de lípidos, amido ou
proteínas (valores percentuais).
3. CAPÍTULO III
RESULTADOS
RESULTADOS | 45
3.1 Crescimento das microalgas em meio com azoto
A concentração celular das microalgas em estudo, o peso da biomassa seca e o pH do
meio de crescimento foram acompanhados ao longo do tempo de cultivo. Estes valores
encontram-se apresentados nas Figuras 5, 6 e 7, respetivamente para C. emersonii, C. vulgaris e
C. saccharophila. Os valores representam a média ± desvio padrão de duas réplicas.
3.1.1 Chlorella emersonii
No caso específico de C. emersonii, verificou-se que esta microalga teve um crescimento
superior no meio MP12 (Figura 5.A), em relação aos restantes meios, tendo atingido a fase
exponencial de crescimento às 306 h, o que representa cerca de 13 dias. Nesta altura, a
concentração celular foi 9,16 x 107 ± 1,19 x 107 cél. mL-1, e o valor do peso da biomassa seca 5,10
± 0,28 g L-1 (Figura 5.B).
Figura 5 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C. emersonii ACOI 516, ao longo do tempo, em diferentes meios com azoto.
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Mais próximo deste crescimento esteve o registado no meio TAP, com o valor 6,75 x 107 ± 6,19 x
106 cél. mL-1 (330 h), sendo que, nesta fase, o valor do peso seco foi 3,20 ± 0,07 g L -1. Nos
restantes meios, o crescimento de C. emersonii foi bastante semelhante apesar de ligeiramente
inferior no meio BBM, com 1,89 x 107 ± 1,94 x 106 cél. mL-1. O valor do peso da biomassa seca
mais baixo também se verificou no meio BBM, com 0,80 ± 0,07 g L -1. No que diz respeito às
variações de pH registadas em cada meio, foi possível observar que, inicialmente, o pH do meio
Chu_13 mod. encontrava-se mais ácido do que o pH dos restantes meios (Figura 5.C). Durante o
tempo de cultivo, observaram-se variações nos valores de pH de cada meio e, no final, os seus
valores estiveram compreendidos entre 7,31 ± 0,01 (no meio BBM) e 8,16 ± 0,20 (no meio BG-
11).
3.1.2 Chlorella vulgaris
No que diz respeito ao crescimento de C. vulgaris, constatou-se que esta microalga atingiu
um valor de concentração celular superior no meio BG-11 (Figura 6.A). Na fase exponencial, o seu
valor foi 3,42 x 108 ± 7,64 x 107 cél. mL-1 e o valor do peso seco 3,80 ± 0,49 g L-1 (Figura 6.B).
Verificou-se também que nos meios Chu_13 mod. e BBM, C. vulgaris atingiu a fase exponencial
primeiro, em comparação com os restantes, com concentrações celulares inferiores.
Quanto aos valores do peso da biomassa seca, representados na Figura 6.B, estes foram
superiores nos meios MP12, BG-11 e TAP, correspondendo a 6,33 ± 1,03 g L-1, 4,30 ± 0,35 g L-1 e
4,05 ± 0,14 g L-1, respetivamente. À semelhança do que aconteceu com a concentração celular, o
peso da biomassa seca nos meios BBM e Chu_13 mod. foi inferior ao observado nos outros meios
de crescimento. Durante o tempo de cultivo, observaram-se variações nos valores de pH de cada
meio, sendo que, no final, estes valores encontraram-se entre 6,68 ± 0,12 no meio MP12 e 7,89
± 0,03 no meio BG-11 (Figura 6.C).
RESULTADOS | 47
Figura 6 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C. vulgaris ACOI 879, ao longo do tempo, em diferentes meios com azoto.
3.1.3 Chlorella saccharophila
C. saccharophila teve um crescimento celular superior no meio TAP, tendo atingido, na
fase exponencial, o valor 6,35 x 107 ± 9,19 x106 cél. mL-1 (Figura 7.A). Muito semelhante a este
crescimento, foi o observado no meio MP12 com 5,84 x 107 ± 2,08 x107 cél. mL-1. O meio onde se
verificou uma concentração celular inferior foi o BG-11 com 1,14 x 107 ± 3,98 x106 cél. mL-1.
Quanto aos resultados obtidos referentes ao peso da biomassa seca (Figura 7.B), o valor
máximo obtido foi 3,00 ± 0,00 g L-1, no meio MP12, e o valor mínimo foi 0,05 ± 0,00 g L-1, no
meio BG-11. As variações de pH (Figura 7.C) nos diferentes meios foram registadas ao longo do
tempo de cultivo, sendo que não se verificaram grandes discrepâncias entre os diferentes meios.
No final, estes valores variaram entre 7,18 ± 0,10 e 7,50 ± 0,02 nos meios BG-11 e TAP,
respetivamente.
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Figura 7 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C. saccharophila ACOI 89, ao longo do tempo, em diferentes meios com azoto.
Num contexto geral, avaliando a variação do peso da biomassa seca referente às três
microalgas, verificou-se que este aumentou com o aumento da concentração celular.
3.2 Crescimento das microalgas em meio sem azoto
Como referido no Capítulo 2, no final de cada ensaio em meio com azoto, as células foram
centrifugadas e ressuspendidas em cada um dos diferentes meios, sem a principal fonte de azoto.
Relativamente ao crescimento das microalgas nestes meios, não se verificou proliferação celular,
tal como se pode observar nas Figuras 8; 9 e 10 (A).
RESULTADOS | 49
Figura 8 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C. emersonii ACOI 516, ao longo do tempo, em diferentes meios sem azoto.
Em C. emersonii (Figura 8.B), apenas se verificaram ligeiras variações do peso da
biomassa seca, em todos os meios de crescimento. Em C. vulgaris (Figura 9.B), somente no meio
MP12 se observou um aumento de cerca de 4 g L-1 e, nos restantes meios, o peso da biomassa
seca manteve-se constante. Em C. saccharophila (Figura 10.B), verificou-se um aumento de cerca
de 1 g L-1 para todos os meios, exceto para o meio BG-11, que se manteve constante e muito
próximo de 0 g L-1.
Seria expectável que a concentração celular inicial na cultura das microalgas na condição
sem azoto fosse aproximadamente igual à concentração celular final observada na condição com
azoto. No entanto, isto não se verificou, o que pode dever-se a perda de material biológico
aquando da transferência das células para os meios sem azoto.
50 | RESULTADOS
Figura 9 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C. vulgaris ACOI 879, ao longo do tempo, em diferentes meios sem azoto.
No que diz respeito às variações de pH observadas, de uma maneira geral, as curvas de
pH das três espécies encontraram-se mais afastadas, em comparação com o que se verificou na
condição com azoto. Em C. vulgaris, em particular, observou-se que no meio Chu_13 mod., o pH
manteve-se sempre ácido (entre 3 e 4).
RESULTADOS | 51
Figura 10 - Concentração celular (A), peso da biomassa seca (B) e valores de pH (C) de C. saccharophila ACOI 96, ao longo do tempo, em diferentes meios sem azoto.
3.3 Análise da Biomassa
Os resultados obtidos após extração de proteínas, lípidos e amido estão representados nas
Figuras 11, 12 e 13, respetivamente. Os valores correspondem à média ± desvio padrão de, pelo
menos, duas réplicas de medições. Os resultados que não apresentam desvio padrão
correspondem a apenas uma medição, sendo que não foi possível fazer mais medições por falta
de biomassa suficiente.
3.3.1 Proteínas
A análise da Figura 11.A permitiu verificar que nas condições em que foi efetuado um pré-
tratamento com NaOH, C. emersonii apresentou valores percentuais superiores, em comparação
com os valores obtidos na extração inicial, com H3PO4. Observou-se também que em meio sem
52 | RESULTADOS
azoto a percentagem de proteínas diminuiu em todos os meios estudados. Em relação a C.
vulgaris, observou-se maior percentagem de proteínas em meio sem azoto, contrariamente ao
observado em C. emersonii. Na microalga C. saccharophila, foi possível observar que a
percentagem de proteínas nos meios TAP e BBM foi superior na condição sem azoto.
Figura 11 - Percentagem de proteínas em C. emersonii ACOI 516 (A), C. vulgaris ACOI 879 (B) e C. saccharophila ACOI 96 (C), nos diferentes meios em estudo, nas condições com e sem azoto e com e sem pré-tratamento com NaOH. N – Não determinado.
3.3.2 Lípidos
O conteúdo lipídico de C. emersonii, no meio MP12, não apresentou variações relevantes
nas três condições. Nos meios TAP, BG-11 e Chu_13 mod., a percentagem de lípidos foi superior
na condição sem azoto, tendo-se verificado o caso contrário no meio BBM. Em C. vulgaris
verificou-se um aumento desta percentagem nos meios MP12, TAP e BBM, na ausência de azoto.
No entanto, no meio BG-11 a percentagem de lípidos foi superior na condição com azoto. A
RESULTADOS | 53
percentagem de lípidos nas amostras de C. saccharophila permitiu aferir que, na ausência de
azoto, este valor foi superior nos meios BBM e Chu_13 mod..
Figura 12 - Percentagem de lípidos em C. emersonii ACOI 516 (A), C. vulgaris ACOI 879 (B) e C. saccharophila ACOI 96 (C), nos diferentes meios em estudo, no inóculo e nas condições com e sem azoto. N – Não determinado.
3.3.3 Amido
O conteúdo de amido de C. emersonii aumentou na condição sem azoto, em todos os
meios de cultura. Em C. vulgaris, a percentagem de amido foi superior na presença de azoto nos
meios MP12, TAP, BG-11 e BBM. Para C. saccharophila verificaram-se percentagens superiores
na ausência de azoto nos meios MP12, TAP, BBM e Chu_13 mod..
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Figura 13 - Percentagem de amido em C. emersonii ACOI 516 (A), C. vulgaris ACOI 879 (B) e C. saccharophila ACOI 96 (C), nos diferentes meios em estudo, no inóculo e nas condições com e sem azoto. N – Não determinado.
3.4 Determinação das Produtividades
A Tabela 9 apresenta as produtividades de biomassa, lípidos, amido e proteínas obtidas
para as microalgas C. emersonii, C. vulgaris e C. saccharophila nos meios MP12, TAP, BG-11,
BBM e Chu_13 mod., nas condições com e sem azoto. De um modo geral, na condição com
azoto, C. vulgaris obteve produtividades de biomassa superiores, em relação às restantes
microalgas, tendo atingido uma produtividade de 0,41 ± 0,34 g L-1 d-1 no meio MP12. C. emersonii
e C. saccharophila também apresentaram produtividades de biomassa superiores neste meio de
cultura. Na condição sem azoto, o maior valor de produtividade de biomassa obtido registou-se em
C. vulgaris, 0,80 ± 0,06 g L-1 d-1, no meio MP12. Em C. emersonii, os valores da produtividade da
biomassa diminuíram da condição com azoto para a condição sem azoto em todos os meios,
exceto no BG-11. O mesmo se verificou em C. vulgaris, exceto nos meios MP12 e TAP. Em C.
RESULTADOS | 55
saccharophila, os valores da produtividade da biomassa aumentaram da condição com azoto para
a condição sem azoto, em todos os meios de cultura. Em relação aos valores de produtividade
lipídica e de amido obtidos, na condição com azoto, estes foram superiores em C. vulgaris,
comparativamente com as restantes microalgas, tendo sido 77,20 ± 0,02 mg L-1 d-1 e 106,82 ±
0,01 mg L-1 d-1 os maiores valores de produtividade lipídica e de amido obtidos, respetivamente.
Num contexto geral, a produtividade de lípidos aumentou da condição com azoto para a condição
sem azoto em C. vulgaris (exceto nos meios BG-11 e BBM) e em C. saccharophila, contrariamente
ao que se verificou para C. emersonii, cuja produtividade de lípidos diminuiu da condição com
azoto para sem azoto (exceto no meio BG-11). Em relação à produtividade de amido, verificou-se a
sua diminuição em C. vulgaris, após cultivo em meio sem azoto, ao contrário do que aconteceu
em C. saccharophila. Em C. emersonii, a produtividade de amido aumentou na condição sem
azoto, nos meios MP12 e BG-11. No que diz respeito à produtividade de proteínas, o maior valor
obtido na condição com azoto foi 56,36 ± 0,01 mg L-1 d-1 em C. emersonii, no meio MP12 e na
condição sem azoto foi 160,50 ± 0,00 mg L-1 d-1 em C. vulgaris, no mesmo meio de cultura. Em C.
vulgaris e C. saccharophila, a produtividade de proteínas aumentou da condição com azoto para a
condição sem azoto, no entanto, em C. emersonii, isso não se verificou.
56 | RESULTADOS
Tabela 9 - Produtividades obtidas (biomassa, lípidos, amido e proteínas) para as microalgas C. emersonii ACOI 516, C. vulgaris ACOI 879 e C. saccharophila ACOI 96 nos meios MP12, TAP, BG-11, BBM e Chu_13 mod. nas condições com e sem azoto.
Meio de crescimento
Produtividade Biomassa (g L-1 d-1)
Produtividade Lipídica (mg L-1 d-1)
Produtividade Amido (mg L-1 d-1)
Produtividade Proteínas (mg L-1 d-1)
Com Azoto Sem Azoto Com Azoto Sem Azoto Com Azoto Sem Azoto Com Azoto Sem Azoto
* Ensaios em que a extração de proteínas foi efetuada com pré-tratamento com NaOH.
4. CAPÍTULO IV
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS | 59
A presente dissertação teve como objetivo monitorizar o crescimento celular das
microalgas C. emersonii, C. vulgaris e C. saccharophila e avaliar o potencial da biomassa
microalgal como matéria-prima para a produção de biocombustíveis. Para isso, as microalgas
foram cultivadas em cinco meios de cultura diferentes, e depois transferidas para os mesmos
meios, sem a sua principal fonte de azoto.
Relativamente à concentração celular das microalgas nos diferentes meios, na presença
de azoto, observou-se que C. emersonii, C. vulgaris e C. saccharophila atingiram valores
superiores nos meios MP12 e TAP; BG-11 e MP12; e TAP e MP12, respetivamente. Desta forma, é
notório que o MP12 foi um dos melhores meios de crescimento para o cultivo das três microalgas.
O azoto e o fósforo são os principais nutrientes essenciais para o crescimento das microalgas
(Dragone et al. 2010). Em cada um dos meios, existe uma fonte de azoto diferente, o que pode
ser um dos motivos diferenciadores da concentração celular obtida para cada microalga. No meio
MP12, a principal fonte de azoto é a ureia, numa concentração de 18310 µM. No meio TAP, é o
NH4Cl (7500 µM), enquanto que nos meios BBM e BG-11 a principal fonte de azoto encontra-se no
composto NaNO3, nas concentrações 2940 µM e 17600 µM, respetivamente. No meio Chu_13
mod., as microalgas consomem o azoto a partir do composto KNO3 (1980 µM). No entanto, a
ureia está descrita, na literatura, como sendo a fonte mais favorável de azoto porque, para uma
concentração de azoto equivalente, permite atingir rendimentos superiores e causa variações de
pH inferiores durante o crescimento das microalgas (Shi et al. 2000). No que diz respeito à
presença de fósforo nos diferentes meios, é também no MP12 que este se encontra em maior
concentração, estando associado ao composto KH2PO4 numa concentração de 1740 µM. Como se
pode verificar na Tabela 8, nenhum outro meio tem uma concentração em fósforo tão elevada
como a que aqui se verifica. É importante que o fósforo esteja presente numa quantidade
significativa visto que, por vezes, encontra-se ligado a iões metálicos, o que dificulta o seu
consumo na totalidade (Chisti 2007).
Ainda sobre a evolução do crescimento celular ao longo do tempo, observou-se uma
característica comum às três microalgas, no meio Chu_13 mod.. Estas mantiveram-se em fase lag
durante mais tempo, o que pode ser justificado pelo valor de pH deste meio no tempo inicial, que
se verificou inferior (≈ 4), em relação aos outros meios (> 6).
Para além disto, verificou-se o fenómeno de auto-floculação com as microalgas C.
emersonii e C. saccharophila, o que poderá ser a causa destas não terem atingido uma
concentração celular e peso da biomassa seca superiores, uma vez que, não estando em
60 | DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
circulação permanente por todo o meio de cultura, estão privadas do acesso apropriado aos
nutrientes. A auto-floculação pode ter sido provocada por vários fatores, tais como: valores de pH
moderadamente básicos (< 8) ou básicos (≈ 10 – 11) (Dupré et al. 1995; Spilling et al. 2011);
ligações entre as células das microalgas através de matéria orgânica extracelular excretada pela
própria microalga (Tenney & Verhoff 1973); precipitação de sais contidos num meio de cultura
com pH superior (≈ 8,5 – 10,5) causado pela fotossíntese e remoção do CO2 dissolvido nas bolhas
de ar (Sukenik & Shelef 1984).
Como referido acima, no final de cada cultivo, as células foram transferidas para meios
desprovidos de azoto. Sabe-se que o crescimento celular em meio sem azoto é importante para
induzir estados de stresse metabólico nas microalgas (Sheehan et al. 1998). Nesta situação, as
células param de proliferar, mas é mantida a fixação de CO2. Desta forma, a concentração celular
das microalgas em estudo, nesta condição, evoluiu como previsto (Herrera-Valencia et al. 2011;
Widjaja et al. 2009) uma vez que não se verificou crescimento celular. Em relação ao peso da
biomassa seca, num contexto geral, verificou-se um decréscimo destes valores para as três
microalgas em estudo, o que está de acordo com o observado em estudos anteriores (Chu et al.
2013), que registaram uma diminuição destes valores, devido à interrupção do crescimento
celular. Contudo, os autores Illman et al. (2000); Fidalgo et al. (1998); Guschina & Harwood
(2006); Douskova et al. (2008) e Herrera-Valencia et al. (2011) reportaram que, nesta condição, é
expectável o aumento do peso da biomassa seca, uma vez que o estado de stresse induz a
produção de lípidos e / ou amido.
A eficiência de produção das microalgas é estimada com base nos valores de
produtividade (g L-1 d-1) do material gerado, incluindo biomassa, lípidos e hidratos de carbono (Ho
et al. 2010; Fu et al. 2012; Converti et al. 2009; Rodolfi et al. 2009; S.-H. Ho et al. 2012). Desta
forma, o cálculo das produtividades de biomassa, lípidos, amido e proteínas foi efetuado e os
resultados foram analisados. Em relação aos valores de produtividade de biomassa obtidos em C.
emersonii, estes variaram entre 0,06 g L-1 d-1 (no meio BG-11) e 0,37 g L-1 d-1 (no meio MP12), na
condição com azoto. No entanto, na condição sem azoto os valores atingidos foram inferiores e
variaram entre 0,01 ± 0,07 g L-1 d-1 (no meio Chu_13 mod.) e 0,23 ± 0,05 g L-1 d-1 (no meio BG-11).
Produtividades inferiores na condição sem azoto devem-se à interrupção do crescimento celular
nesta condição. Em condições normais de crescimento, as produtividades obtidas foram
superiores às publicadas por Illman et al. (2000), que registaram 0,03 g L-1 d-1 em C. emersonii
cultivada em condições normais de crescimento (no meio Watanabe; biorreator agitado a 200
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS | 61
rpm; intensidade de luz de 25 µmol m-2 s-1 na superfície do biorreator, arejamento de 1 L min-1 com
5 % (v/v) CO2 e Tª 25 °C).
De notar que estes autores forneceram ao cultivo apenas ¼ da intensidade de luz utilizada
no presente trabalho. Valores de produtividade de biomassa bastante superiores foram publicados
pelos autores Takeshita et al. (2014), que obtiveram 1,00 g L-1 d-1 em C. emersonii (células
cultivadas no meio TAP, em condições normais de crescimento, com irradiação de 600 µmol m-2 s-
1 incidente na superfície do fotobiorreator; Tª 23 ºC; 20 mL min-1 de ar contendo entre 2 - 3 % de
concentração de CO2; 0,25 vvm; agitação a 2 rpm, utilizando um agitador rotativo), ou seja, um
valor de produtividade de biomassa elevado, associado a uma intensidade de luz igualmente
elevada e a uma concentração de CO2 inferior à utilizada neste trabalho.
No que diz respeito aos valores de produtividade de biomassa obtidos em C. vulgaris, na
condição com azoto, estes variaram entre 0,15 ± 0,00 g L-1 d-1 (no meio Chu_13 mod.) e 0,41 ±
0,34 g L-1 d-1 (no meio MP12). As produtividades obtidas nesta condição mostraram-se superiores a
alguns valores publicados na literatura, nomeadamente pelos autores Illman et al. (2000), que
obtiveram uma produtividade máxima de 0,04 g L-1 d-1 (condições de crescimento supracitadas). O
mesmo se verificou no trabalho realizado por Scragg et al. (2002), que também registaram 0,04 g
L-1 d-1, quando cultivaram C. vulgaris no meio Watanabe, com 6 % (v/v) CO2 (16 h de luz com
intensidade de 76 µmol m−2 s−1; Tª 25 °C; células agitadas a 60 rpm num agitador rotativo), assim,
apesar destes autores Scragg et al. (2002) terem testado a mesma concentração de CO2 que se
usou neste trabalho, a intensidade de luz utilizada foi inferior e foi aplicada durante menos tempo.
A variação da produtividade de biomassa da condição com azoto para a condição sem azoto
também foi analisada, tendo-se verificado uma diminuição destes valores, exceto nos meios MP12
e TAP. O mesmo se verificou nos estudos realizados por Illman et al. (2000), que obtiveram uma
diminuição da produtividade de 0,041 g L-1 d-1 (condição com azoto) para 0,037 g L-1 d-1 (condição
sem azoto) (condições do crescimento mencionadas anteriormente) e por Scragg et al. (2002) que
observaram uma diminuição de 0,040 g L-1 d-1 para 0,024 g L-1 d-1 (condições do cultivo
supracitadas). Esta diminuição da produtividade de biomassa na condição sem azoto é uma
consequência da diminuição do peso da biomassa seca, causada pela interrupção da proliferação
celular. Uma possível explicação para o facto da produtividade de biomassa ter aumentado para o
dobro, no meio MP12 sem azoto, e de se ter mantido no meio TAP sem azoto, foi a constância da
concentração celular e o aumento do conteúdo de lípidos e proteínas, nestes meios, embora o
peso da biomassa seca tenha diminuído cerca de 2 g L-1. Produtividades de biomassa superiores
62 | DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
às observadas no presente trabalho, em condições normais de crescimento foram publicadas por
vários autores. No entanto, em todos os casos analisados em que isso se verificou, os autores
forneceram intensidades de luz superiores, como foi o caso de Ho et al. (2013), que obtiveram
1,36 g L-1 d-1 para C. vulgaris, cultivada sob uma intensidade de luz de 450 µmol m -2 s-1 (no meio
Basal Modificado; 2 % CO2; 0,2 vvm; Tª 28 °C; células agitadas a 300 rpm num agitador rotativo).
Os autores Přibyl et al. (2012) registaram 0,91 g L-1 d-1 de produtividade de biomassa com as
células cultivadas no meio SŠ, com 2 % CO2 (v/v), irradiação de 500 μmol m−2 s−1 e Tª 28 °C. Os
autores Takeshita et al. (2014) observaram em C. vulgaris uma produtividade de biomassa de
0,55 g L-1 d-1 (condições do cultivo supracitadas).
Em relação às produtividades de biomassa obtidas para C. saccharophila, na condição
com azoto, os valores variaram entre 0,06 ± 0,00 g L-1 d-1 (no meio Chu_13 mod.) e 0,22 ± 0,00 g
L-1 d-1 (no meio MP12). No meio TAP com azoto, obteve-se 0,15 g L-1 d-1. O mesmo valor foi
publicado pelos autores Herrera-Valencia et al. (2011) (células cultivadas no meio TAP, a 25 ± 2 º
C, sob um ciclo de luz de 16:8 h; intensidade de luz de 20 µmol m -2 s-1 cultivo agitado a 140 rpm),
no entanto, estes autores referiram que, na condição sem azoto, a produtividade aumentou
ligeiramente para 0,16 g L-1 d-1. No presente trabalho, o aumento registado foi superior, para 0,28
± 0,11 g L-1 d-1. Chinnasamy et al. (2010) obtiveram uma produtividade de 0,02 g L-1 d-1, com as
células cultivadas no meio BG-11 (meio suplementado com 5 mL de água residual; crescimento a
25 º C, sob uma intensidade de luz de 75 – 80 µmol m-2 s-1 e um fotoperíodo de 12:12 h), ou seja,
semelhante ao obtido neste trabalho, no mesmo meio (0,01 ± 0,00 g L-1 d-1).
De forma a avaliar o potencial de C. emersonii, C. vulgaris e C. saccharophila para a
produção de biocombustíveis, após crescimento celular em meio com e sem azoto, procedeu-se à
extração de lípidos, amido e proteínas.
Uma variedade de fatores ambientais pode influenciar a acumulação de lípidos nas
microalgas, nomeadamente a disponibilidade de nutrientes. Como referido no Capítulo 1, há
nutrientes presentes no meio, cuja carência pode induzir maior acumulação de lípidos, que
funcionam como energia de reserva para ser utilizada após terminar a fase de stresse (Guschina &
Harwood 2006).
Neste trabalho, verificou-se que o conteúdo de lípidos obtido em C. emersonii foi
semelhante em todos os meios, no entanto, observou-se um ligeiro aumento na condição sem
azoto, nos meios TAP, BG-11 e Chu_13 mod.. Os valores variaram de 13,9 % para 19,3 %; 12,5 %
para 14,7 % e 15,4 % para 18,0 %, respetivamente. O aumento do conteúdo de lípidos é
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS | 63
expectável em meio sem azoto, no entanto, os valores obtidos ainda ficam aquém dos publicados
pelos autores Illman et al. (2000), que verificaram o aumento de 29 % para 63 % do conteúdo
lipídico, em C. emersonii. Para além disso, os mesmos autores obtiveram, em meio com azoto,
um conteúdo lipídico superior (29 %), em comparação com o obtido no presente trabalho, ainda
que em diferentes condições de crescimento (supracitadas). De lembrar que em cima referiu-se
que estes autores (Illman et al. 2000) obtiveram valores de produtividade de biomassa, em C.
emersonii, inferiores aos obtidos no presente trabalho, no entanto, o conteúdo lipídico foi superior,
o que poderá significar que as condições de cultivo usadas por estes poderão ser mais favoráveis
à acumulação de lípidos nas células.
A limitação de azoto pode induzir a produção de um elevado conteúdo lipídico, no entanto,
também pode diminuir a produtividade da biomassa. Como consequência, a produtividade de
lípidos também é afetada, ficando inferior ao obtido sob condições normais de crescimento
(Griffiths & Harrison 2009; Widjaja et al. 2009; Wijffels & Barbosa 2010), o que se verificou em C.
emersonii, exceto no meio BG-11. Na condição com azoto, os valores de produtividade lipídica
variaram entre 12,29 ± 0,00 mg L-1 d-1 (no meio Chu_13 mod.) e 53,66 ± 0,01 mg L-1 d-1 (no meio
MP12). No entanto, na condição sem azoto, a variação esteve entre 1,80 mg L-1 d-1 (no meio
Chu_13 mod.) e 33,76 ± 0,00 mg L-1 d-1 (no meio BG-11). Os valores obtidos em condições
normais de crescimento, em comparação com o que foi publicado pelos autores Takeshita et al.
(2014), são bastante baixos, uma vez que estes obtiveram em C. emersonii, uma produtividade
lipídica de 230 mg L-1 d-1, com crescimento no meio TAP (irradiação de 600 µmol m-2 s-1, incidente
na superfície do fotobiorreator), contudo, a intensidade de luz utilizada por estes foi 6 vezes
superior à fornecida no presente trabalho.
Em relação ao conteúdo lipídico obtido para C. vulgaris, é de notar que, para a produção
de lípidos, em condições normais de crescimento, os meios BBM e Chu_13 mod. destacaram-se
em relação aos restantes, embora o crescimento celular desta microalga tenha sido inferior
precisamente nestes dois meios, o que pode ser justificado pelo facto da concentração da principal
fonte de azoto ser mais baixa nestes do que nos restantes, indicando que concentrações inferiores
de azoto no meio de crescimento são mais favoráveis à acumulação de lípidos (Yeh & Chang
2011; Hsieh & Wu 2009; Rodolfi et al. 2009; Takagi et al. 2000). O aumento do conteúdo lipídico
da condição com azoto para a condição sem azoto, foi mais visível no meio TAP, tendo-se
verificado um aumento de 27,8 % para 39,2 %. Em estudos anteriores, verificou-se que, após
diminuir a concentração de azoto até 75 %, a percentagem de lípidos aumentou de 5,9 % para
64 | DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
16,4 %, no meio BBM (usando como fonte de carbono o CO2 presente no ar – 300 ppm) (Converti
et al. 2009), ou seja, em comparação com o que foi obtido, neste trabalho, no meio TAP, o
aumento do conteúdo lipídico foi semelhante, ainda que, para os autores mencionados, os valores
percentuais atingidos tenham sido inferiores. No entanto, no presente trabalho, no meio BBM, o
aumento do conteúdo lipídico, na condição sem azoto foi de apenas 1 %. Illman et al. (2000)
verificaram, em C. vulgaris, que a percentagem de lípidos aumentou de 18 % (condição com azoto)
para 40 % no meio Watanabe sem azoto (condições de crescimento acima citadas), pelo que este
aumento foi superior ao maior aumento observado neste trabalho, em C. vulgaris. Conteúdos
lipídicos superiores aos obtidos no presente trabalho, em condições normais de crescimento,
foram publicados pelos autores Přibyl et al. (2012), que obtiveram uma média de 50,80 %
(condições de crescimento supracitadas) e pelos autores Chu et al. (2013), que registaram um
conteúdo lipídico de 37,60 % no meio BG-11 (células cultivadas com fotoperiodicidade 16:8 h; 0,5
vvm com 4 % CO2; Tª 25 ± 2 °C), sendo que estes últimos verificaram o aumento do conteúdo
lipídico para 50,27 %, na condição sem azoto. No meio BG-11 do presente trabalho verificou-se o
oposto, ou seja, diminuição do conteúdo lipídico na condição sem azoto. Regra geral, tem-se
verificado que os autores que utilizam uma concentração de CO2 inferior à utilizada no presente
trabalho, assim como intensidades de luz superiores, obtêm conteúdos lipídicos mais elevados.
Para além disso, o facto de não se estar a comparar com as mesmas estirpes e adicionalmente as
condições de crescimento serem diferentes, em comparação com as usadas neste trabalho, torna
expectável diferenças nos resultados obtidos.
Em relação aos valores de produtividade lipídica obtidos em C. vulgaris, em condições
normais de crescimento, estes variaram entre 50,22 ± 0,00 mg L-1 d-1 (meio MP12) e 77,20 ± 0,02
mg L-1 d-1 (meio TAP). Produtividades lipídicas superiores às obtidas neste trabalho foram
publicadas por Přibyl et al. (2012), que obtiveram em C. vulgaris uma média de 460 mg L-1 d-1
(condições do cultivo acima mencionadas). Os autores Chu et al. (2013) obtiveram em C. vulgaris
uma produtividade lipídica de 43,17 mg L-1 d-1, no meio BG-11, em condições normais de
crescimento (condições de crescimento supracitadas), tendo este valor aumentado para 58,39 mg
L-1 d-1, na condição sem azoto. Neste trabalho, a produtividade lipídica de C. vulgaris no meio BG-11
variou de 74,09 ± 0,00 mg L-1 d-1 para 13,97 ± 0,00 mg L-1 d-1, ou seja, foi superior na condição
com azoto, em relação aos mesmos autores, no entanto, diminuiu bastante na condição sem
azoto. Esta queda da produtividade lipídica na condição sem azoto foi uma consequência da
diminuição da produtividade de biomassa, no mesmo meio, assim como do conteúdo lipídico.
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS | 65
Estudos anteriores (Widjaja 2010) demonstraram que expondo C. vulgaris a condições de
privação de azoto, são obtidas produtividades lipídicas inferiores, causadas pela diminuição do
crescimento celular, nesta situação. No entanto, estes também verificaram que após exposição a
períodos superiores de limitação de azoto (17 dias), é possível obter não só um conteúdo lipídico
superior como também o aumento da produtividade lipídica para valores semelhantes e até
superiores aos obtidos no final do cultivo sob condições normais. Pelo que, produtividades lipídicas
superiores poderão ser obtidas variando não só a duração do período de privação de azoto, assim
como, do período de cultivo normal (Widjaja 2010; Yeh & Chang 2011).
No que diz respeito ao conteúdo lipídico obtido em C. saccharophila, os valores
percentuais aumentaram da condição com azoto para a condição sem azoto nos meios BBM e
Chu_13 mod., de 22,7 % para 30,5 % e de 19,9 % para 25,9 %, respetivamente, sendo que
também foi nestes meios que se observou o maior conteúdo lipídico. Griffiths & Harrison (2009)
reportaram uma percentagem lipídica média de 23,0 % para algas verdes (Chlorophyta). Assim, as
percentagens obtidas para esta microalga encontram-se próximas desta média. Contudo, o mesmo
não se verificou em meio sem azoto, uma vez que a média referida pelos mesmos autores é 41,0
%. Herrera-Valencia et al. (2011) verificaram na condição com azoto, do meio TAP, uma
percentagem lipídica de 50 %. Na ausência de NH4Cl, observaram o aumento desta percentagem
para 63,6 % (condições de crescimento mencionadas anteriormente). Outros estudos também
obtiveram valores percentuais de lípidos superiores em C. saccharophila, em relação ao que foi
obtido no presente trabalho, como é o caso dos autores Hempel et al. (2012), que obtiveram um
conteúdo lipídico de 27,6 % (células cultivadas no meio Tamiya modificado, com 2 % (v/v) CO2;
irradiação de 200 µmol fotões m-2 s-1). Em condições heterotróficas de crescimento, os autores Tan
& Johns (1991), também registaram um conteúdo lipídico superior – 46,7 %. No presente
trabalho, não foi possível fazer extração de lípidos do meio BG-11 na condição com azoto, por falta
de biomassa suficiente, no entanto, na literatura, vem descrito que, neste meio (suplementado
com solo), C. saccharophila apresenta um conteúdo lipídico aproximado de 12,9 % (células
cultivadas a 25 °C sob uma intensidade de luz a variar entre 75 – 80 µmol fotões m-2 s-1 e com
fotoperiodicidade 12:12 h) (Chinnasamy et al. 2010).
No que diz respeito aos valores de produtividade lipídica obtidos com esta microalga,
verificou-se que, na condição com azoto, variaram entre 11,37 mg L-1 d-1 (no meio Chu_13 mod.) e
29,70 ± 0,00 mg L-1 d-1 (no meio TAP). Estes valores encontram-se abaixo da média reportada para
microalgas cultivadas sob condições normais de crescimento – 50 mg L-1 d-1 (Griffiths & Harrison
66 | DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
2009). Na condição sem azoto, do presente trabalho, as produtividades variaram entre 5,17 mg L-1
d-1 (no meio BG-11) e 66,17 mg L-1 d-1 (no meio BBM). Estes valores também se encontram abaixo
do que publicaram os autores Herrera-Valencia et al. (2011), uma vez que estes registaram em C.
saccharophila uma produtividade lipídica de 99,33 mg L-1 d-1 quando as células foram cultivadas
em meio sem azoto (condições do cultivo acima mencionadas). No entanto, neste trabalho, em C.
saccharophila, verificou-se em todos os meios de crescimento, o aumento da produtividade
lipídica, na condição sem azoto, o que pode ser o resultado da síntese de novo lipid synthesis,
uma característica de algumas microalgas oleaginosas, que consiste em direcionar o excesso de
carbono e energia em lípidos de armazenamento (principalmente TAG), quando cultivadas em
condições de carência de azoto ou sob uma tensão que limita o crescimento (Rodolfi et al. 2009).
Várias microalgas do género Chlorella estão descritas como sendo capazes de produzir
níveis mais elevados de amido do que de lípidos, como polímeros de reserva (Fernandes et al.
2012). Sabe-se que a acumulação de amido pelas microalgas é dependente da estirpe e varia de
acordo com o meio e com as condições da luz (Takeshita et al. 2014; Liu et al. 2008; Dragone et
al. 2011). Várias espécies foram descritas como sendo ideais para a produção de bioetanol, por
produzirem grandes quantidades de amido sob privação de azoto (Mussatto et al. 2010).
No presente trabalho, extraiu-se o amido presente nas microalgas, nas condições com e
sem azoto. Os resultados obtidos em C. emersonii mostraram-se bastante satisfatórios, uma vez
que se verificou em todos os meios o aumento da percentagem de amido na condição sem azoto,
o que de acordo com a literatura é expectável (Douskova et al. 2008; Converti et al. 2009; Lv et al.
2010; Přibyl et al. 2012; Widjaja et al. 2009; Behrens et al. 1989). Para além disso, nos meios
MP12, BG-11 e Chu_13 mod., observou-se um aumento de 9,9 % (com azoto) para 35,2 % (sem
azoto); de 16,1 % para 42,7 % e de 29,5 % para 38,0 %, respetivamente. Assim, o maior conteúdo
de amido obtido é semelhante, ainda que ligeiramente superior, à percentagem máxima registada
pelos autores Dragone et al. (2011), que obtiveram um conteúdo de amido de 41,0 % (na
condição sem azoto) (C. vulgaris cultivada com ar enriquecido com 2 % (v/v) CO2, taxa de
arejamento de 0,83 vvm; irradiação de 70 µmol m-2 s-1 de luz).
Em relação aos valores das produtividades de amido obtidas em C. emersonii, na
condição com azoto, estes variaram entre 9,95 ± 0,00 mg L-1 d-1 (no meio BG-11) e 48,44 ± 0,01
mg L-1 d-1 (no meio TAP). Estes valores encontraram-se bastante abaixo do publicado na literatura
pelos autores Takeshita et al. (2014), que obtiveram uma produtividade de amido de 180 mg L -1 d-
1, em C. emersonii (condições do crescimento referidas anteriormente). No entanto, de notar que
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS | 67
os autores citados forneceram uma intensidade de luz 6 vezes superior à utilizada neste trabalho e
intensidades de luz superiores induzem a produção de polissacáridos em microalgas (Friedman et
al. 1991; Tredici et al. 1991).
Em relação ao conteúdo de amido obtido em C. vulgaris, verificou-se maior percentagem
deste na condição com azoto, em todos os meios. Nesta condição, os valores obtidos são
semelhantes aos reportados pelos autores Cheng et al. (2015), que verificaram nesta microalga
uma percentagem de amido de 21,0 %, numa cultura com 2 % (v/v) CO2. Um conteúdo de amido
superior foi publicado pelos autores Ho et al. (2013), que obtiveram 31,25 % (C. vulgaris cultivada
sob uma intensidade de luz elevada, 450 µmol m -2 s-1). No que diz respeito à variação do conteúdo
de amido da condição com azoto para a condição sem azoto, os estudos encontrados na literatura
apresentam resultados que contrariam os obtidos no presente trabalho. Douskova et al. (2008)
induziram uma acumulação de amido na microalga C. vulgaris (cultivada no meio MP12, numa
concentração de CO2 > 10 %) pela privação de azoto e o teor em amido nas células aumentou 50
%. Os autores Dragone et al. (2009) verificaram que o conteúdo de amido em C. vulgaris (cultivada
no meio MP12, nas mesmas condições utilizadas no presente trabalho) sob condições de privação
de azoto, constituiu 36 % da biomassa algal, enquanto que, sob condições normais, esta
percentagem foi apenas 8 %, o que enfatiza o facto da privação de azoto ser um fator chave para a
acumulação de amido pelas microalgas. De notar que estes autores, não determinaram o
conteúdo de amido pelo mesmo método utilizado no presente trabalho. Ainda assim, tendo em
conta que os resultados obtidos, em C. vulgaris, não foram de encontro à literatura, tudo indica
que alguns dos fatores que podem influenciar a produção de amido pelas células, se possam ter
alterado, nomeadamente a intensidade da luz, a concentração de CO2, a temperatura e / ou a
concentração de ferro (aumenta a eficiência fotossintética) (Van Oijen et al. 2005; Warr et al.
1985) ou até a possibilidade de existência de erros no procedimento de extração de amido das
células.
Em relação aos valores de produtividade de amido obtidos com esta microalga, na
condição com azoto, estes variaram entre 23,78 ± 0,00 mg L-1 d-1 (no meio Chu_13 mod.) e
106,82 ± 0,01 mg L-1 d-1 (no meio MP12). Uma produtividade superior foi obtida pelos autores
Dragone et al. (2011), que registaram em C. vulgaris, 199 mg L-1 d-1 (condições de crescimento
referidas anteriormente), que pode estar relacionado com o facto destes autores terem usado uma
taxa de arejamento superior e uma concentração de CO2 inferior, em relação ao que se utilizou
neste trabalho. No entanto, um valor próximo dos que foram obtidos com os meios TAP e BG-11
68 | DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
foi reportado pelos autores Takeshita et al. (2014), que obtiveram 69 mg L-1 d-1 (condições do
cultivo supracitadas).
No que diz respeito ao conteúdo de amido obtido em C. saccharophila, verificou-se que os
valores obtidos foram inferiores aos observados nas outras microalgas. Nos meios em que foi
possível analisar o conteúdo de amido, na condição sem azoto, verificou-se que estes valores
foram ligeiramente maiores, em comparação com os observados na condição com azoto. Como
demonstram os estudos acima citados, é possível obter conteúdos de amido superiores (para as
microalgas, na generalidade) às observadas em C. saccharophila.
Uma troca entre a acumulação de lípidos e de amido tem sido observada em algumas
espécies de Chlorella (Mizuno et al. 2013). Os autores Ho et al. (2013) verificaram o aumento da
concentração de carbohidratos em condições de privação de azoto. No entanto, o conteúdo lipídico
não variou significativamente durante este período. Alguns estudos demonstraram que o fluxo de
carbono nas microalgas está alocado em compostos ricos em energia, e há uma competição entre
a síntese de lípidos e de amido (Rismani-Yazdi et al. 2011; Siaut et al. 2011). No entanto, o
aumento da síntese de lípidos ou de carbohidratos sob condições de stresse difere entre espécies
(S. H. Ho et al. 2012). No presente trabalho, em C. emersonii foi predominante a produção de
amido, contudo, em C. vulgaris e C. saccharophila, predominou a produção de lípidos.
O elevado conteúdo de proteínas presente em várias espécies de microalgas é uma das
principais razões para considerar estes microrganismos fontes convencionais de proteínas (Soletto
et al. 2005). Como as células são capazes de sintetizar todos os aminoácidos, podem fornecer os
essenciais para os seres humanos e os animais (Guil-Guerrero et al. 2004), desta forma Chlorella
é reconhecida como ingrediente alimentar seguro a nível mundial (Guccione et al. 2014; Spolaore
et al. 2006; Cornet 1998; Soletto et al. 2005). Vários estudos já demonstraram que a alteração na
concentração de nutrientes pode modificar o crescimento e o metabolismo secundário das
microalgas. Como referenciado acima, condições de limitação de azoto induzem a acumulação de
lípidos e / ou amido, o que não se verifica no caso das proteínas, sendo que, nestas condições,
ocorre uma diminuição da sua concentração nas células (Biller et al. 2011; Lv et al. 2010; da Silva
et al. 2009; Pruvost et al. 2011).
No que diz respeito ao procedimento de extração de proteínas efetuado no presente
trabalho, é importante lembrar que foram testadas duas condições diferentes em C. emersonii. Na
primeira condição, as proteínas foram extraídas com o auxílio de uma solução de H3PO4 (0,15 M),
no entanto, após observação dos resultados obtidos, verificou-se que este procedimento não
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS | 69
deveria ser adequado, uma vez que estavam a obter-se percentagens de proteínas muito baixas,
comparativamente com o que vem descrito na literatura (Dragone et al. 2010). Desta forma,
testou-se uma segunda condição que implicou a extração das proteínas com NaOH (1 M). Após
testar a segunda condição, os resultados mostraram-se mais apropriados (ainda assim, aquém do
que se esperaria), pelo que, para a extração das proteínas das microalgas C. vulgaris e C.
saccharophila, apenas se utilizou a segunda condição. No entanto, do ponto de vista prático, o
segundo procedimento apresentou uma desvantagem em relação ao primeiro. Após adicionar a
solução de NaOH à biomassa liofilizada, levou-se a mistura a um banho de 80 °C e, no final,
terminou-se a reação com gelo. Este último passo provocou a solidificação da solução de NaOH
com as amostras de microalgas, pelo que foi difícil retirar volume de sobrenadante suficiente para
a determinação das proteínas. Esta desvantagem pode estar na origem dos resultados obtidos
para as três microalgas em estudo. C. vulgaris apresentou um conteúdo de proteínas superior na
condição sem azoto, o que contradiz os resultados publicados por Ho et al. (2012) e Siaut et al.
(2011) que demonstraram que a privação de azoto diminui o conteúdo de proteínas das células,
uma vez que força estes microrganismos a transformar as proteínas em lípidos ou carbohidratos.
O conteúdo de proteínas médio publicado na literatura para C. vulgaris, em condições normais de
crescimento, encontra-se entre 41 % e 58 % (Dragone et al. 2010), desta forma verificou-se que os
resultados obtidos com esta microalga ficaram abaixo do expectável.
No que diz respeito aos valores de produtividade de proteínas obtidos em C. vulgaris,
variaram entre 3,65 ± 0,00 mg L-1 d-1 (no meio MP12) e 26,24 ± 0,01 mg L-1 d-1 (no meio BG-11).
Na literatura encontraram-se valores bastante superiores a estes, nomeadamente os que foram
publicados pelos autores Chen et al. (2015), que obtiveram em C. vulgaris uma produtividade de
proteínas de 146 mg L-1 d-1 (cultivada no meio Basal Modificado, com uma intensidade de luz de
150 µmol m-2 s-1; concentração inicial de ureia de 9,3 mM e de Fe2+ de 180 µM) e por Mahboob et
al. (2012), que registaram uma produtividade de proteínas de 2260 mg L -1 d-1 com uma espécie de
C. vulgaris termotolerante cultivada no meio N-8 otimizado. Uma produtividade inferior e
semelhante à que foi obtida, neste trabalho, na condição com azoto do meio BG-11, foi publicada
pelos autores Wang et al. (2014), que obtiveram com outra espécie de Chlorella (ellipsoidea) uma
produtividade de proteínas de 21,67 ± 2,24 mg L-1 d-1 (com células cultivadas no meio BG-11, 16 h
luz por dia e irradiação de 35 µmol m_2 s_1).
Em relação ao conteúdo de proteínas obtido em C. saccharophila, verificou-se que, nos
meios MP12 e TAP, na condição com azoto, os valores foram superiores aos obtidos em C.
70 | DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
emersonii e C. vulgaris. No entanto, também ficaram aquém dos resultados publicados na
literatura, nomeadamente pelos autores Hempel et al. (2012) (condições de crescimento acima
citadas), que reportaram para a microalga C. saccharophila um conteúdo de proteínas de 42,4 % e
para Chlorella sp. 44,3 %. Guccione et al. (2014) demonstraram que o conteúdo de proteínas em
nove estirpes de Chlorella em meio com azoto foi, em média, 39,7 %. Após um período de
limitação de azoto, a percentagem de proteínas registada foi 24,6 % (valor médio). Illman et al.
(2000) obtiveram em C. vulgaris uma percentagem de proteínas de 29,0 %, na condição com
azoto, tendo este valor diminuído até 7,0 % na condição sem azoto. Em C. emersonii, os mesmos
autores obtiveram 32,0 % e 28,0 % nas condições com e sem azoto, respetivamente (condições do
cultivo supracitadas). Ho et al. (2013) verificaram uma diminuição no conteúdo de proteínas de
58,8 % para 20,1 %, quando colocaram C. vulgaris em meio com carência de azoto. Uma razão
possível para justificar que o conteúdo de proteínas diminua na condição sem azoto é o facto de
todas as estruturas de carbono produzidas durante o processo metabólico serem direcionadas
para a produção de carbohidratos e lípidos, enquanto que, na presença de azoto, a maior parte
das estruturas de carbono são incorporadas em compostos azotados (como aminoácidos,
proteínas e ácidos nucleicos) (Dragone et al. 2011; El-Moneim M. R. Afify et al. 2010; Widjaja
2010).
5. CAPÍTULO V
CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPETIVAS FUTURAS
CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPETIVAS FUTURAS | 73
A capacidade de produção atual de biocombustíveis provenientes de microalgas ainda é
inferior ao necessário para o estabelecimento de uma sociedade mais sustentável. Desta forma,
este trabalho surge na tentativa de acrescentar informação nesta área, com a seleção de
microalgas com potencial de produção de biocombustíveis.
A elaboração da presente dissertação permitiu concluir que para as condições avaliadas, o
meio MP12 demonstrou ser um dos melhores para o crescimento das microalgas estudadas, pelo
facto de apresentar concentrações de azoto e fósforo superiores, em relação aos outros meios de
crescimento. Concluiu-se também que C. vulgaris foi a microalga que obteve valores de
concentração celular e peso da biomassa seca superiores, tendo, desta forma atingido o maior
valor de produtividade de biomassa, no meio MP12.
Analisando os conteúdos lipídicos obtidos, concluiu-se que, de uma maneira geral, C.
vulgaris apresentou percentagens superiores (inclusive 39,2 % na condição sem azoto do meio
TAP). O facto de ter sido a microalga que atingiu maior peso da biomassa seca, juntamente com o
facto de ter produzido o maior conteúdo lipídico, refletiu-se na maior produtividade lipídica obtida,
pelo que revelou ter o maior potencial de produção de lípidos. No entanto, para poder afirmar que
tem potencial de produção de biodiesel, por exemplo, seria necessário dar continuidade ao
presente trabalho no sentido de obter a caracterização dos lípidos, uma vez que espécies
diferentes de microalgas produzem diferentes tipos de ácidos gordos e alguns ácidos gordos são
mais adequados para a transesterificação em biodiesel do que outros, nomeadamente os TAG e os
AGL.
O conteúdo de amido obtido em C. emersonii faria crer que esta seria a melhor microalga
para a produção de amido, no entanto, a análise dos valores de produtividade de amido obtidos
demonstraram que C. vulgaris é mais adequada porque, embora tenha produzido, em média,
menos amido, o facto de ter atingido uma concentração de células superior, tornou esta espécie
mais rentável.
Os resultados obtidos referentes ao conteúdo de proteínas não permitiram tirar conclusões
em relação à capacidade de produção das microalgas em estudo.
Estudos experimentais adicionais serão necessários para determinar com melhor precisão
as condições de crescimento ideais, por exemplo, através da alteração de condições ambientais
(pH, temperatura, nível de nutrientes, percentagem de CO2, intensidade da luz e arejamento).
Idealmente, as microalgas deveriam ser colhidas num ponto de elevada concentração de
biomassa e elevada produtividade de lípidos e/ou amido, no entanto, sabe-se que as microalgas
74 | CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPETIVAS FUTURAS
aumentam o conteúdo de lípidos e/ou amido sob privação de nutrientes e, nestas condições,
estes microrganismos produzem menos biomassa. Desta forma, é importante encontrar um
equilíbrio entre este dilema, através da otimização da concentração de azoto no meio de
crescimento.
De forma a compreender melhor a relação entre o crescimento celular e a acumulação de
lípidos seria útil medir a clorofila presente nas células durante o processo de cultivo, uma vez que
esta é um componente essencial das algas verdes, responsável por capturar CO2 e energia solar
para gerar um fluxo metabólico tanto para o crescimento celular como para a acumulação de
lípidos. Para além disso, e tendo em conta que o cultivo de microalgas em condições mixotróficas
tem sido considerado um processo muito eficiente para a produção de biomassa microalgal,
comparativamente com as condições fotoautotróficas, seria também interessante cultivar as
microalgas estudadas nessas condições.
Um rápido progresso no campo de produção de biocombustíveis a partir de microalgas
tem sido feito a todos os níveis, desde a identificação de espécies de alto rendimento à melhoria
das técnicas de colheita e extração. No entanto, a utilização industrial de microalgas para a
produção de biocombustíveis poderá ser rentabilizada através da utilização de co-produtos de alto
valor produzidos pelas mesmas, para outros fins. Adicionalmente, utilizar espécies de microalgas
de rápido crescimento para a fixação de CO2 é uma alternativa muito promissora para a mitigação
de CO2. O mérito principal desta estratégia reside no facto de que, através do cultivo de
microalgas, a mitigação de CO2 e a produção de biocombustíveis poderiam ser combinados de
uma forma economicamente viável e ambientalmente sustentável. A viabilidade desta estratégia
pode ser reforçada através da fixação de CO2 dos gases industriais e pela integração do cultivo de
microalgas no tratamento de águas residuais. Seria também importante identificar espécies
capazes de manter o cultivo estável, sob uma intensidade de luz elevada, utilizando
fotobiorreatores ao ar livre, uma vez que a luz solar exterior pode variar entre 100 µmol fotões m_2
s_1 (em tempo nublado) e mais de 1000 µmol fotões m_2 s_1 em clima moderado. Pode ainda atingir
um máximo de mais de 2000 µmol fotões m_2 s_1 na luz direta do sol do solstício de verão.
6. BIBLIOGRAFIA
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