Vanessa Regina Maciel Uzan A EXPRESSÃO GÊNICA DOS RNAs NÃO CODIFICADORES HOTAIR, MALAT1, HULC E BCYRN1 EM OSTEOSSARCOMA Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação da Fundação PIO XII – Hospital de Câncer de Barretos para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde. Área de concentração: Oncologia Orientador: Prof. Dr. Luiz Fernando Lopes Co-orientador: Dr. Daniel Onofre Vidal Barretos, SP 2015
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Vanessa Regina Maciel Uzan A EXPRESSÃO GÊNICA DOS … · A Deus, pelo dom da vida, de amar e me fortalecer a cada dia. Aos meus pais, Sandra M. Maciel Uzan e José Roberto Uzan
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Transcript
Vanessa Regina Maciel Uzan
A EXPRESSÃO GÊNICA DOS RNAs NÃO CODIFICADORES HOTAIR, MALAT1, HULC E BCYRN1
EM OSTEOSSARCOMA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós Graduação da Fundação PIO XII –
Hospital de Câncer de Barretos para
obtenção do Título de Mestre em Ciências
da Saúde.
Área de concentração: Oncologia
Orientador: Prof. Dr. Luiz Fernando Lopes
Co-orientador: Dr. Daniel Onofre Vidal
Barretos, SP
2015
FICHA CATALOGRÁFICA Preparada por Rafael de Paula Araújo CRB 8/9130
Biblioteca da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos
U99e Uzan, Vanessa Regina Maciel A expressão gênica dos RNAs não codificadores HOTAIR, MALAT1, HULC e
BCYRN1 em osteossarcoma / Vanessa Regina Maciel Uzan. - Barretos, SP 2015. 84 f. : il. Orientador: Luiz Fernando Lopes. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Fundação Pio XII – Hospital
de Câncer de Barretos, 2015. 1. Osteossarcoma. 2. RNAs não codificadores longos. 3. Metástase.
4. Expressão Gênica. 5. Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo
Real. 6. Biomarcadores. I. Autor. II. Lopes, Luiz Fernando CDD 572.86
FOLHA DE APROVAÇÃO
Vanessa Regina Maciel Uzan
A expressão gênica dos RNAs não codificadores HOTAIR, MALAT1, HULC E BCYRN1 em
osteossarcoma
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Fundação Pio XII – Hospital de
Câncer de Barretos para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde - Área de
Concentração: Oncologia
Data da aprovação: 26/02/2015
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Antônio Sergio Petrilli
Instituição: Instituto de Oncologia Pediátrica - Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP
Prof. Dr. Rui Manuel Vieira Reis
Instituição: Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos
Prof. Dr. Luiz Fernando Lopes
Orientador – Presidente da Banca
“Esta dissertação foi elaborada e está apresentada de acordo com as normas da Pós-
Graduação do Hospital de Câncer de Barretos – Fundação Pio XII, baseando-se no Regimento
do Programa de Pós-Graduação em Oncologia e no Manual de Apresentação de Dissertações
e Teses do Hospital de Câncer de Barretos. Os pesquisadores declaram ainda que este
trabalho foi realizado em concordância com o Código de Boas Práticas Científicas (FAPESP),
não havendo nada em seu conteúdo que possa ser considerado como plágio, fabricação ou
falsificação de dados. As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas
neste material são de responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão
da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos.”
“Embora o Núcleo de Apoio ao Pesquisador do Hospital de Câncer de Barretos tenha
realizado as análises estatísticas e orientado sua interpretação, a descrição da metodologia
estatística, a apresentação dos resultados e suas conclusões são de inteira responsabilidade
dos pesquisadores envolvidos. Os pesquisadores declaram não ter qualquer conflito de
interesse relacionado a este estudo.
DEDICATÓRIA
A Deus, pelo dom da vida, de amar e me fortalecer a cada dia.
Aos meus pais, Sandra M. Maciel Uzan e José Roberto Uzan por serem a minha referência
como ser humano e como profissional e pelo incentivo insaciável para a minha formação.
Aos meus irmãos Valéria e Márcio e aos meus sobrinhos Giovanna e Arthur pelo amor e
apoio na realização dos meus sonhos.
Ao meu namorado Alberto, pela força nas horas mais difíceis, pelo amor sincero,
companheirismo e por participar ativamente da concretização deste trabalho com seu
conhecimento e acreditando em mim.
Dedico à vocês este trabalho.
AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar a Deus, pela saúde, força, e por estar comigo todos os
dias, em todos os momentos incondicionalmente.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Luiz Fernando Lopes, por acreditar em mim como pessoa
e como profissional, pelas palavras de incentivo durante as “tempestades” que encontramos
neste caminho chamado mestrado e por contribuir para o meu crescimento profissional e
intelectual.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Daniel Onofre Vidal, por acrescentar palavras de
sabedoria nas linhas deste trabalho, pela exigência no meu aprendizado e na qualidade
deste trabalho.
Aos assessores das Bancas de Acompanhamento, Dr. Rui Reis e Dra. Ana Lucia
Ambujamra que a cada encontro acrescentavam seus conhecimentos e sugestões para o
aprimoramento deste trabalho.
Ao Dr. Carlos Alberto Scrideli, pela pronta colaboração com este projeto.
A Dra. Érica Boldrini, por me acompanhar na revisão dos prontuários e dividir seus
conhecimentos comigo.
A toda equipe do Núcleo de Apoio ao Pesquisador pelo suporte prestado,
especialmente aos estatísticos Cleyton, Marco e Anderson por todo o aprendizado, e pela
realização das análises metodológicas e estatísticas.
Aos professores, colegas e equipe de suporte da Pós Graduação do Hospital de Câncer
de Barretos que contribuíram para o meu aprendizado.
Ao Dr. Valter Penna, pela coleta de todas as amostras de osteossarcoma que
utilizamos neste projeto.
Aos funcionários do Biobanco, em especial ao Dr. Cristovam Scapulatempo por revisar
criteriosamente e pacientemente todas as lâminas do nosso estudo, e à minha amiga e
excelente profissional Jacqueline, por me auxiliar em todas as etapas no laboratório.
Ao Dr. Carlos Eduardo Bezerra, por avaliar os exames de imagem e redimensionar
pacientemente os tumores avaliados.
Ao André Van Helvoort Lengert, além do profissionalismo, agradeço imensamente
pela amizade, pelas palavras de força e por contribuir ativamente da conclusão deste
trabalho. Exemplo de humildade, simplicidade e inteligência.
A Direção da Fundação Pio XII, em especial ao Sr. Henrique Duarte Prata, pelo
incentivo aos estudos e permitindo que possamos nos ausentar em alguns (ou vários)
momentos para a realização desse sonho.
A minha Equipe de Farmacêuticos (34) e Auxiliares (63) da Farmácia da Fundação Pio
XII – Hospital de Câncer de Barretos, pela compreensão nos momentos em que precisei me
ausentar e pelas palavras de força nos momentos em que tudo parecia difícil.
A minha família por ter lutado e muitas vezes se sacrificado para me dar esse privilégio
de poder estar formada e realizar o sonho da Pós Graduação. Em especial, agradeço aos
meus pais José Roberto Uzan e Sandra M. Maciel Uzan, por me ensinarem o amor ao
próximo, a buscar os sonhos, a não desistir diante das dificuldades e pelo amor
incondicional. Com muito amor e gratidão dedico esse trabalho a vocês.
Ao meu médico particular, noivo e eterno namorado, Alberto Paiva de Moraes Filho,
que durante esse período tornou-se mestre no assunto junto comigo e por acrescentar seus
conhecimentos técnicos e científicos nesse trabalho. Meu companheiro de leituras de
prontuários, interpretação de laudos de tomografias, raio-x e ressonâncias. Agradeço
também por ser tão compreensivo, paciente, presente e incentivador. Obrigada pelas
palavras de força e de ânimo nas horas certas!
E por fim, aos pacientes, por nos conceder o uso de suas amostras para a realização
deste trabalho. O sorriso que vemos no rosto de vocês diariamente, apesar das lutas que
vocês enfrentam, é o que nos dá forças para continuar e não desistir.
“ Seja lá o que for que você faça, empregue toda tua energia e todo teu espírito nesta tarefa.
Ninguém conquista um sonho sem persegui-lo, ninguém anda uma milha sem dar o primeiro
passo. Se ao fim da estrada alguma sombra de arrependimento te atacar, ainda assim,
levante a cabeça, orgulhe-se por ter tentado, por ter buscado, por ter empregado todas as
tuas forças até o último instante. Tanto pior e sempre pior é arrepender-se daquilo que você
não fez” (Augusto Branco)
“Eu tudo posso, naquele que me fortalece”
Filipenses 4:13
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
1.1 Osteossarcoma 1
1.2 Alterações genéticas associadas ao osteossarcoma 3
1.3 Os RNAs não codificadores longos (lncRNAs) 5
1.4 Os lncRNAs associados aos processos de invasão e metástase em
Um dos primeiros lncRNAs a ser descrito com tal papel foi o MALAT1, um transcrito de
8kb, localizado no cromossomo 11q13.1 que é um ponto de quebra frequente de
translocações cromossômicas associadas ao câncer53-55. MALAT1 fica retido no núcleo e está
localizado nos speckles nucleares, que são estruturas envolvidas no processamento do pré-
mRNA56. Recentemente, MALAT1 foi demonstrado atuando na regulação do splicing
alternativo de pré-mRNAs pela modulação dos níveis de fatores de splicing. A supressão de
MALAT1 altera o processamento de um conjunto de pré-mRNAs, os quais desempenham um
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papel importante na biologia do câncer. Esse gene também é altamente conservado entre
diversas espécies ressaltando sua importância funcional53.
Primeiramente, o MALAT1 foi descrito com um aumento de expressão no tumor
primário, como um marcador prognóstico de metástase e pior sobrevida de pacientes
acometidos pelo carcinoma de pulmão de células não pequenas. Essa associação com a
metástase se mostrou estágio e histologia específica, dessa forma servindo como fator
prognóstico independente na sobrevida do paciente em estágios iniciais do adenocarcinoma
de pulmão57. A expressão de MALAT1 foi observada em diversos tecidos normais, com os
maiores níveis de expressão em pâncreas e pulmão57, entretanto sua expressão está
aumentada em uma gama de outros tumores quando comparados aos tecidos normais
correspondentes como, por exemplo, no carcinoma hepatocelular58. MALAT1 pode estar
associado com parâmetros clínicos e pode controlar a proliferação celular, a apoptose, a
migração, invasão, ou a disseminação metastática nas células tumorais59.
Um estudo demonstrou que o MALAT1 promove a mobilidade celular em células
tumorais de pulmão, por meio da regulação transcricional ou pós-transcricional de genes
importantes para este mecanismo celular60. Adicionalmente, MALAT1 suporta a proliferação
e invasão de células de câncer cervical (CaSki), e sua inibição leva ao aumento de expressão
de proteínas pró-apoptóticas como caspase 3, 8 e Bax61.
A expressão de MALAT1 também foi avaliada em pacientes com mieloma e mostrou
estar superexpresso em pacientes recém diagnosticados em comparação com pacientes pós
tratamento. A expressão desse gene foi relacionada com o status da doença e a mudança da
expressão pós tratamento teve relevância prognóstica. Pacientes que sofreram progressão
precoce tiveram uma alteração significativamente menor na expressão de MALAT1 após
tratamento. Sendo assim, MALAT1 mostrou ter um papel fundamental na patogênese do
mieloma62.
Recentemente, MALAT1 foi associado com o processo de proliferação e metástase em
osteossarcoma, através da ativação da via PI3K/Akt. Esses resultados indicaram que MALAT1
pode ser considerado como alvo terapêutico no osteossarcoma humano63.
1.4.2 HOTAIR (HOX transcript antisense RNA)
O HOTAIR é um gene de 2.2 kb localizado no cromossomo 12q13.13. HOTAIR atua na
interação e recrutamento do complexo repressivo polycomb 2 (PRC2) no locus do gene
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HOXD o que leva ao silenciamento transcricional de 40 kb a montante44. Devido a sua
importância na regulação epigenética da expressão gênica, não é surpreendente que a
expressão de HOTAIR esteja alterada em uma série de tumores.
Em um dos primeiros relatos, a expressão aumentada de HOTAIR foi associada a
tumores primários de mama em relação ao tecido normal. Ainda, o seu nível de expressão
nos tumores primários correlacionou-se positivamente com a ocorrência de metástases e
pior prognóstico nestes pacientes. A superexpressão de HOTAIR em células epiteliais
cancerosas levou ao aumento do potencial de invasão e formação de metástases destas
células. Em contrapartida, a supressão de HOTAIR levou a inibição de tais processos
biológicos64. Resultados semelhantes foram descritos em carcinoma hepatocelular, no qual a
expressão de HOTAIR também está aumentada em tumores primários e parece ser um
biomarcador potencial para ocorrência de metástases em linfonodos. Ainda, a expressão de
HOTAIR mostrou-se um fator independente de prognóstico associado à recorrência da
doença e sobrevida menor dos pacientes. A depleção de HOTAIR em células tumorais do
fígado reduz a capacidade de invasão e viabilidade dessas células65. Somado a isso, a
supressão de HOTAIR torna as células cancerígenas mais sensíveis à ação de quimioterápicos
como a cisplatina e doxorrubicina66.
A alta expressão do HOTAIR ainda está relacionada ao potencial invasivo e metastático
do adenocarcinoma gástrico67, do melanoma68, do carcinoma endometrial69 e do câncer de
colo de útero70, entre outros. Xue et al.71 identificaram variantes genéticas do HOTAIR que
se associam a um risco aumentado de câncer colorretal. Meta-análises recentes confirmam
a associação entre a expressão elevada de HOTAIR com prognóstico desfavorável e
sobrevida reduzida em um grande número de malignidades72, 73.
1.4.3 HULC (Hepatocellular carcinoma up-regulated long non-coding RNA)
O HULC é um gene de 500kb localizado no cromossomo 6p24.3. HULC foi inicialmente
descrito como um ncRNA específico do fígado que é altamente expresso em tumores
primários do fígado74. Também apresenta expressão elevada em metástases hepáticas de
pacientes com carcinoma colorretal, entretanto não é expresso nestes tumores primários75.
Recente relato demonstrou que HULC funciona como uma “esponja” de miRNAs, se ligando
e provocando a diminuição da expressão de uma série de miRNAs, incluindo o miR-372. A
redução na expressão deste miRNA leva ao aumento da expressão do seu alvo PRKACB, que
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por sua vez induz a fosforilação de CREB. Isso resulta na alteração dos processos de
deacetilação e metilação de histonas, gerando um impacto no remodelamento da cromatina
alterando assim a expressão de uma série de genes76.
Um estudo comparou a expressão tecidual e plasmática do HULC entre pacientes com
hepatocarcinoma e um grupo controle. Além de serem constatados níveis significativamente
maiores de HULC no tecido/plasma de pacientes com hepatocarcinoma, houve relação
direta entre os valores de expressão do HULC e outras variáveis, como o grau de
diferenciação histológica. Estes resultados sugerem um potencial uso deste RNA como
biomarcador diagnóstico e/ou prognóstico77.
Um trabalho mostrou superexpressão do HULC em tecidos de câncer gástrico,
notando-se associação direta com estádios mais avançados e presença de metástases. O
mesmo trabalho estudou os efeitos da superexpressão e do “knockdown” da expressão do
HULC em células, determinando que o HULC desempenha papel importante na proliferação,
migração e invasão celular, bem como na inibição da apoptose78.
Outro estudo investigou a expressão do HULC em tecidos de câncer de pâncreas,
observando-se correlação significativa entre maior expressão do gene com tamanho
tumoral, invasão vascular e o estádio da doença79.
1.4.4 BCYRN1 (Brain cytoplasmic RNA 1)
O BCYRN1, também conhecido como BC200, é um gene de 200pb localizado no
cromossomo 2p21, que é especificamente expresso em tecidos do sistema nervoso. Sua
expressão já foi descrita em células germinativas, entretanto normalmente não é expresso
em tecidos somáticos de origem não neural. Uma análise em 19 tipos diferentes de tumor
revelou sua expressão nos carcinomas de mama, colo do útero, esôfago, pulmão e ovário,
mas não nos tecidos normais correspondentes80. Em outro trabalho, os autores
identificaram a expressão elevada de BCYRN1 em carcinoma invasivo de mama, mas não em
tecido normal. Uma análise de sensibilidade e especificidade confirmou o poder prognóstico
da expressão do BCYRN1 como um marcador molecular deste tipo de tumor. Além disso, em
carcinoma ductal in situ, a expressão de BCYRN1 foi relacionada com alto grau nuclear,
apontando que possa ser utilizado como marcador prognóstico de progressão tumoral43.
Tais exemplos deixam evidente o importante papel funcional dos lncRNAs para a
ativação do mecanismo de invasão celular e formação de metástases. De fato, os lncRNAs
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descritos podem regular uma gama de genes envolvidos nestes processos. Por fim, lncRNAs
especificamente expressos ou silenciados em tumores humanos podem desenvolver um
papel importante no estabelecimento do fenótipo tumoral e, portanto, representar um
grupo de potenciais novos alvos terapêuticos no combate ao câncer.
Visto isso, nós avaliamos a expressão dos lncRNAs MALAT1, HOTAIR, HULC e BCYRN1
em amostras primárias de osteossarcoma ao diagnóstico e o potencial papel destas
moléculas como marcadores prognósticos nesta doença.
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2 JUSTIFICATIVA
Os lncRNAs estão associados a regulação da expressão gênica e podem atuar por
diferentes mecanismos. Os lncRNAs MALAT1, HOTAIR, HULC e BCYRN1 já foram associados a
diversos fatores prognóstico como presença de metástase, baixa resposta à quimioterapia e
o processo metastático em tumores humanos. Nossa hipótese é de que esses genes também
possam estar envolvidos com a progressão do tumor, resistência ao tratamento e o processo
metastático em osteossarcoma. Como estes tumores são muito agressivos e metade dos
pacientes apresenta metástase ao diagnóstico ou durante o tratamento, com um
prognóstico muito pobre, a avaliação dessas moléculas pode indicar novos marcadores
biológicos com potencial prognóstico para este tumor, bem como novos alvos para terapias
alternativas no osteossarcoma.
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3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar a expressão gênica de MALAT1, HOTAIR, HULC e BCYRN1 em amostras de
osteossarcoma e avaliar o potencial papel destes genes como marcadores prognósticos
nesses pacientes.
3.2 Objetivos específicos
Otimizar um protocolo de extração e análise de qualidade de RNA em osteossarcoma;
Correlacionar a expressão dos genes com os dados clínico-patológicos dos pacientes;
Analisar a sobrevida global e sobrevida livre de eventos dos pacientes de acordo com a
expressão dos genes avaliados.
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4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Amostras e seleção dos pacientes
O levantamento dos pacientes diagnosticados com OS entre os anos de 2006 e 2013
foi realizado por meio do SisOnco, um sistema informatizado, o qual contém a base de
dados da patologia do Hospital de Câncer de Barretos (HCB). Nesse período, foram
identificados 175 pacientes com OS. Ainda, por meio de uma colaboração estabelecida com
o Dr. Carlos Alberto Scrideli, 32 amostras de RNAs de OS provenientes do Banco de Tumores
do Laboratório de Pediatria da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de
São Paulo (FMRP/USP) foram incluídas em nossas análises.
Além das amostras de osteossarcoma, também avaliamos expressão dos genes de
interesse em uma linhagem celular não tumorigênica de osteossarcoma (SAOS).
Para a avaliação dos critérios de elegibilidade, foi utilizada uma ficha de coleta de
dados (Anexo A), contendo 62 parâmetros. Através dos dados obtidos em prontuário, a ficha
foi preenchida e criou-se um banco de dados no programa SPSS 21.
4.2 Critérios de inclusão
Os participantes deste estudo atenderam aos seguintes critérios de inclusão:
Qualquer idade ao diagnóstico;
Diagnóstico definido de osteossarcoma (ósseo), de qualquer localização anatômica e
histologia;
Tratamento realizado pela equipe de Pediatria;
Com metástase ou não ao diagnóstico;
Amostras criopreservadas disponíveis para a extração de RNA.
4.3 Critérios de exclusão
Os critérios de exclusão deste estudo foram:
Pacientes cujo início do tratamento quimioterápico ocorreu anteriormente a coleta do
material biológico;
Amostras que não possuíam representatividade de tumor maior que 50%;
Amostras cuja integridade do RNA estava comprometida (RIN < 4.0);
Diagnóstico de osteossarcoma como 2º tumor primário.
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4.4 Aspectos éticos
O projeto foi encaminhado ao Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) da Fundação Pio XII –
HCB (aprovado em abril de 2013 – número de referência 251.134) e do Hospital das Clínicas
da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP/USP)
(aprovado em setembro de 2014), de modo a atender as exigências da Resolução nº
466/2012 do Conselho Nacional de Saúde/Ministério da Saúde (Anexo B).
A dispensa do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) foi concedida pelo
CEP por se tratar de um estudo com uso de amostras retrospectivas e de risco mínimo para
os participantes da pesquisa, sendo este risco inerente a quebra acidental do sigilo de
informações. Os pesquisadores envolvidos se comprometeram a garantir o sigilo de todos os
pacientes, não divulgando publicamente o nome ou qualquer outra informação que possa
identificar os pacientes envolvidos neste estudo.
4.5 Coleta dos dados
A coleta dos dados clínicos-patológicos foi realizada no SAME (Serviço de Arquivo
Médico Especializado) na Fundação Pio XII – HCB e no mesmo departamento da Fundação
Pio XII - Hospital de Câncer Infantojuvenil de Barretos. Os dados clínico-patológicos das
amostras provenientes de Ribeirão Preto foram encaminhados pelo Dr. Carlos Alberto
Scrideli.
4.6 Avaliação da representatividade tumoral
Para as amostras do HCB, um fragmento de tecido congelado de cada amostra
selecionada para o estudo foi descalcificado, incluído em parafina e corado com
hematoxilina/eosina, seguindo os protocolos padronizados no departamento de patologia
do HCB. Em seguida, confeccionou-se lâminas de cada amostra e estas foram avaliadas pelo
patologista Dr. Cristovam Scapulatempo Neto, para determinar a porcentagem de tumor
presente no fragmento estocado e disponível no biobanco da instituição.
As amostras provenientes da FMRP/USP foram submetidas a macrodissecção manual
no laboratório de patologia da instituição, com o intuito de proporcionar o enriquecimento
das amostras para células tumorais. A microdissecção das amostras foi realizada em
criostato refrigerado e utilizando o composto Tissue Tek O.C.T (Sakura). Dois cortes de 8-
10µm foram utilizados na macrodissecção, após a marcação da área tumoral pelo
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patologista. A macrodissecção das amostras permite o enriquecimento maior do que 80%
para células tumorais.
4.7 Extração de RNA
A extração do RNA total de todas as amostras foi realizada a partir de um fragmento
do tumor congelado, utilizando-se inicialmente o TRIZOL (Life Technologies), de acordo com
as recomendações do fabricante. Brevemente, aproximadamente 30mg de tecido tumoral
foram separadas em um tubo contendo 1mL de TRIZOL e esferas de cerâmica (CK28) para
maceração. Os tecidos foram macerados utilizando o equipamento precellys 24 (Bertin
Technologies) sendo submetidos a pelo menos 2 ciclos de maceração de 6500 rpm durante
10 segundos. Durante o intervalo de 5 minutos entre os ciclos, as amostras eram
armazenadas no gelo.
Após esse passo, todo o conteúdo foi transferido para um tubo de 1,5mL e
acrescentou-se 200L de solução salina 0,9%. As amostras foram incubadas à temperatura
ambiente por 5 minutos e adicionou-se 200L de clorofórmio. Em seguida, as amostras
foram homogeneizadas com auxílio de vórtex por 15 segundos e centrifugadas a 12.000G
por 15 minutos a 4°C. Após centrifugação, foi recolhido o sobrenadante (fase aquosa)
contendo o RNA. O RNA foi precipitado acrescentando-se 500L de isopropanol gelado. Os
tubos foram homogeneizados por inversão e armazenados no freezer a -20°C overnight.
No dia seguinte, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 12.000G na
temperatura de 4°C. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e realizaram-se duas
lavagens do RNA com 1mL de etanol 75%, sendo os tubos centrifugados a 7.500G por 5
minutos na temperatura de 4°C. Ao final, descartou-se o sobrenadante, e o pellet de RNA
resultante ficou à temperatura ambiente pelo tempo necessário para sua completa
secagem. O RNA obtido foi ressuspendido com 20 µL de água milli-Q RNase-free.
Para algumas amostras, que apresentaram baixa qualidade do RNA (RIN<6) a extração
do RNA foi realizada novamente. Assim, o RNA foi extraído novamente utilizando-se o
miRNeasy micro kit (Qiagen), de acordo com as recomendações do fabricante. Brevemente,
30mg de tecido tumoral foram adicionadas a 700µL de Qiazol nos tubos com esferas de
cerâmica (CK28) para maceração. Os tecidos foram macerados da mesma maneira como
descrito anteriormente, seguiram a extração pelo protocolo do kit e foram eluídas em 20 µL
de água milli-Q RNase-free.
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Após a extração, todas as amostras foram quantificadas e submetidas a análise de
qualidade/integridade do RNA e permaneceram estocadas a -80°C até a sua utilização.
4.8 Avaliação da quantidade e da qualidade do RNA total
A quantificação das amostras de RNA total foi realizada inicialmente no
espectrofotômetro NanoVue® (GE Healthcare Life Sciences) por análise da absorbância a
260nm. A pureza do RNA extraído foi avaliada através do cálculo das razões A260/A280 e
A260/A230, que indicam possíveis contaminações da amostra por proteínas e compostos
fenólicos. Posteriormente, para garantir uma quantificação mais precisa das amostras,
utilizamos uma metodologia de fluorescência com o equipamento Qubit (Life Technologies),
usando um kit que possui sondas moleculares específicas de RNA e portanto, se houver
proteína, DNA, ácidos nucleicos degradados presentes na amostra, estes não irão interferir
na quantificação.
A análise da qualidade do RNA total foi realizada por meio de eletroforese microfluida
no equipamento Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies), utilizando o RNA Nano Chip kit
(Agilent Technologies), de acordo com as recomendações do fabricante. Brevemente, após a
preparação do chip foram adicionados 9µL de Small RNA conditioning solution na posição
marcada como CS, 1µL de marcador na posição indicada como ladder e 5µL de RNA small
marker em cada posição do chip reservada para as amostras, bem como na posição do
marcador. As amostras foram desnaturadas por dois minutos a 70°C, para evitar a formação
de estruturas secundárias do RNA, e foi adicionado 1µL (100ng) de cada amostra nas
posições do chip marcadas de 1 a 12. O chip foi agitado no vórtex IKA MS3 (Manca),
horizontalmente por um minuto a 2.200rpm e, em seguida, foi colocado no aparelho para
leitura.
Com o auxílio do Agilent 2100 Expert Software obteve-se o resultado (eletroferograma
e densitometria dos géis) referente à qualidade das amostras que são representados pelo
RNA Integrity Number (RIN). As amostras apresentando RIN entre 1 e 3 foram consideradas
totalmente degradadas; entre 4-7 foram consideradas parcialmente degradadas; entre 8 e
10, amostras íntegras.
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4.9. Análise de contaminação do RNA com DNA genômico
Dos quatro genes escolhidos nesse estudo, dois (HOTAIR e BCYRN1) são formados por
apenas um exon, sendo assim os ensaios (iniciadores e sonda) para RT-qPCR (PCR em tempo
real) poderiam amplificar o DNA genômico, dessa forma prejudicando a análise de expressão
destes genes. Assim, com o intuito de avaliar a presença de contaminação por DNA nas
amostras de RNA previamente extraídas, nós realizamos uma PCR com iniciadores intrônicos
para o gene KRAS em todas as amostras. A reação foi desenvolvida utilizando-se
aproximadamente 100ng de RNA total, 1x Tampão GoTaq Flexi Buffer, 0,2mM de dNTPs,
2mM de MgCl2, 0,3µM dos iniciadores, 0,5U da enzima Go-Taq Hot Start Polymerase
(Promega), em um volume final de 15µL. Os iniciadores utilizados foram: Direto - 5’
ATGTTCTAATATAGTCACATTTTC 3’ e Reverso - 5’ GTCCTGCACCAGTAATATGC 3’. As amostras
foram incubadas no termociclador Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems), de acordo
com as condições descritas na tabela 1.
Tabela 1 - Condições de ciclagem para PCR do gene KRAS
A avaliação da amplificação do gene KRAS em todas as amostras foi realizada por
eletroforese em gel de agarose 2% (Life Technologies), corado com corante Ez-vision in gel
10.000x (Amresco,USA).
4.10 Tratamento com DNase
O tratamento com DNase (Sigma-Aldrich) foi realizado seguindo as orientações do
fabricante. Brevemente, a partir de 1µg de RNA o tratamento foi realizado com 1x do
Estágio Temperatura Tempo Ciclos
Desnaturação inicial 96°C 10 minutos
Desnaturação 96°C 45 segundos
40 X Anelamento 56,5°C 45 segundos
Extensão 72°C 45 segundos
Extensão final 72°C 10 minutos
Final 4°C ∞
20
tampão da enzima, 1U de DNase I, em um volume final de 10µL. As amostras foram
incubadas a 37°C por 20 minutos. Posteriormente, para inativação da enzima adicionou-se
1µL de Stop Solution (50mM EDTA) e as amostras foram incubadas a 70°C por 10 minutos,
sendo em seguida colocadas no gelo.
Para confirmar a eficiência do tratamento, após tratamento com DNase, a PCR do gene
KRAS foi realizada novamente como descrito anteriormente (tópico 4.9).
4.11 Síntese de cDNA
A síntese do cDNA foi realizada a partir de 1µg de RNA total tratado com DNAse
utilizando o High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies), de acordo com
as recomendações do fabricante. Brevemente, 1µg de RNA total tratado foi adicionado a 1x
RT buffer, 4mM de dNTPs, 1x RT Random primers, 50U de MultiScribe Reverse Transcriptase
e 20U de RNAse Inhibitor, em um volume final de 20µL. As amostras foram incubadas a 25°C,
por 10 minutos, 37°C por 120 minutos, 85°C por 5 minutos. A reação foi realizada no Veriti
Thermal Cycler (Applied Biosystems).
4.12 Análise de expressão dos RNAs não codificadores longos por RT-qPCR .
A análise de expressão dos quatro lncRNAs foi realizada por RT-qPCR utilizando-se os
ensaios PrimeTime qPCR assay (Integrated DNA Technologies). Estes ensaios contêm sondas
e iniciadores específicos que permitem a amplificação e avaliação da expressão do gene de
interesse.
Após a síntese, 1µL do cDNA foi utilizado como molde nas reações de RT-qPCR que
foram realizadas com 1x Kapa Probe Fast Master Mix (Kapa Biosystems), 1x PrimeTime qPCR
assay (50X) específico para o gene em análise, em um volume final de 20µL. Essa reação foi
desenvolvida a 95°C por 10 minutos; seguida de 40 ciclos a 95°C por 15 segundos e 60°C por
1 minuto.
Além dos genes de interesse, foi realizada a avaliação dos genes endógenos ACTB e
GAPDH que serviram para a normalização dos dados de expressão dos genes de interesse
avaliados.A expressão normalizada de cada gene de interesse do estudo foi calculada por
meio do modelo matemático 2-∆Ct, no qual o ∆Ct corresponde ao Ct do gene de interesse
subtraído pelo Ct do gene normalizador81. A análise de expressão foi realizada no 7900 HT
21
Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems) e todas as reações foram realizadas em
duplicata.
4.13 Análise estatística
Os dados obtidos dos prontuários foram digitados e arquivados em um banco de
dados com auxílio do programa Statistical Package for Social Science (SPSS) versão 21.0. A
análise estatística foi realizada utilizando-se o mesmo programa.
Para este estudo, foram consideradas as variáveis epidemiológicas: sexo e idade ao
diagnóstico e variáveis clínico-patológicas: tipo histológico, grau de Huvos, localização do
tumor, tamanho do tumor, presença ou ausência de metástase e momento do diagnóstico
da metástase.
Para a análise estatística, algumas variáveis foram categorizadas da seguinte forma:
Sexo: masculino ou feminino;
Idade: menor/igual ou superior a 10 anos;
Tipo histológico: osteoblástico ou condroblástico/fibroblástico/telangectásico;
Grau de Huvos: grau 1/2 ou grau 3/4;
Local do tumor: fêmur ou fíbula/tíbia/úmero;
Tamanho do tumor: menor/igual ou superior a 12cm; a medida foi realizada por um
radiologista através de exames de imagem ao diagnóstico (Raio X /Ressonância/Tomografia
computadorizada;
Presença de metástase: Ausente ou Presente;
Momento do diagnóstico da metástase: não metastático ou metástase ao diagnóstico
ou metástase após diagnóstico;
As variáveis contínuas foram apresentadas como média, desvio padrão, mediana,
valores mínimo e máximo. As variáveis categóricas foram apresentadas pelas frequências e
porcentagens.
Inicialmente, a expressão gênica foi considerada como uma variável numérica e a
correlação da média de expressão dos genes com os fatores clínico-patológicos considerados
no estudo foi realizada utilizando-se o teste de Mann-Whitney. A avaliação da diferença da
qualidade do RNA medida pelo RIN, entre os métodos de extração utilizados (kit ou TRIZOL),
também foi realizada pelo teste de Mann-Whitney.
22
Posteriormente, para categorizar a expressão dos genes foi determinado um ponto de
corte utilizando a curva ROC e considerado o melhor ponto aquele que apresentou a melhor
sensibilidade e especificidade na comparação entre pacientes não metastáticos e
metastáticos. Para a avaliação desse ponto, foram analisados a área sob a curva (AUC), a
sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e acurácia e
seus respectivos intervalos de confiança de 95%.
Após essa análise, a expressão dos genes foi correlacionada com as características
clínicas por meio do teste de qui-quadrado ou teste exato de Fisher, quando os pressupostos
no teste do qui-quadrado não foram satisfeitos. Como a variável metástase foi divida em
três categorias (não metastático, metástase ao diagnóstico ou metástase após o
diagnóstico), utilizou-se o teste Kruskal-Wallis para avaliar a correlação com a expressão dos
genes.
A sobrevida global (SG) foi definida como o período da admissão (diagnóstico) até a
avaliação mais recente de acompanhamento ou óbito. Para a análise da sobrevida livre de
eventos (SLE), foi considerado como evento a recaída, a progressão de doença ou óbito (o
que ocorreu primeiro). O tempo até o evento foi estimado entre a data do diagnóstico até a
data do evento.
Para estimar os tempos de sobrevida global e os tempos de sobrevida livre de evento
utilizou-se o método de Kaplan-Meier. Para a comparação das curvas de sobrevida em
relação a cada categoria dentro de uma determinada variável utilizou-se o teste não-
paramétrico de LogRank.
Para todas as análises foi considerado um nível de significância de 5%.
23
5. RESULTADOS
5.1 Tamanho da Amostra
Nos registros do HCB, das 175 amostras identificadas inicialmente, 76 permaneceram
elegíveis para análise após avaliação dos prontuários.
As demais foram excluídas pelos seguintes critérios:
68 amostras foram coletadas após início de quimioterapia;
12 amostras de pacientes que não receberam tratamento no Departamento de
Pediatria do HCB;
05 amostras possuíam classificação incorreta pelo SisOnco;
03 amostras eram de recidiva;
02 amostras com radioterapia prévia;
03 amostras de metástase;
03 amostras com laudo inconclusivo;
02 amostras não estavam armazenadas no Biobanco;
01 amostra com fragmento pequeno, impossibilitando a avaliação pelo patologista.
As 32 amostras de Ribeirão Preto já haviam sido avaliadas em relação a todos os
critérios de inclusão e de exclusão com exceção da avaliação da integridade do RNA.
Abaixo, segue uma representação esquemática da estratégia utilizada para a avaliação
de expressão dos lncRNAs em osteossarcomas (figura 3). Cada etapa será descrita
detalhadamente nos tópicos a seguir.
24
Figura 3 – Representação esquemática da estratégia desenvolvida neste trabalho para a avaliação da
expressão de lncRNAs em osteossarcoma.
25
5.2 Avaliação da representatividade tumoral
Inicialmente, as 76 amostras do HCB foram avaliadas para a confirmação da presença
de tumor, das quais 56 foram confirmadas com pelo menos 50% de tecido tumoral no
fragmento disponível. As 32 amostras provenientes da FMRP/USP já haviam passado por
essa avaliação anteriormente e, após microdissecção manual houve um enriquecimento
para 80% de tecido tumoral nestas amostras. Assim, foram consideradas para seguimento
no projeto 88 amostras, das quais 71% (77 amostras) apresentaram pelo menos 80% de
tecido tumoral viável. A figura 4 ilustra a quantidade de amostras analisadas e a
porcentagem tumoral presente em cada uma delas.
Figura 4. Representatividade tumoral nas amostras selecionadas para avaliação da expressão dos lncRNAs.
Para as amostras do HCB esta avaliação foi realizada pelo patologista em lâmina de fragmento corado com
hematoxilina e eosina. Para as amostra da FMRP/USP esta avaliação foi feita previamente e as amostras
macrodissecadas garantindo a presença de pelo menos 80% de tecido tumoral viável.
5.3 Extração, quantificação e avaliação da qualidade do RNA total
Inicialmente, a extração do RNA total foi realizada utilizando o método do TRIZOL.
Após a extração, a quantificação e a pureza do RNA extraído foi avaliada pela análise de
absorbância (260/280nm) utilizando o espectrofotômetro NanoVue.
A avaliação da qualidade/integridade do RNA foi realizada com auxílio do equipamento
Bioanalyzer 2100. Das 88 amostras avaliadas, três possuíam um fragmento tumoral muito
pequeno que resultou em baixa quantidade de RNA e não foi possível obter o valor de RIN, e
26
nem a realização de nova extração/análise. Das 85 amostras restantes, 56 apresentaram
degradação parcial do RNA (RIN < 6) e por isso, na tentativa de atingir melhores resultados,
para 25 amostras com tecido remanescente o RNA foi extraído novamente utilizando-se o
miRNeasy micro kit (Qiagen). A re-extração utilizando-se o kit não resultou em uma melhor
qualidade do RNA visto que a maioria das amostras não apresentou diferença relevante em
relação ao valor de RIN observado inicialmente. Neste processo de re-extração, apenas
quatro amostras que inicialmente apresentaram RIN<4, foram recuperadas com RIN>4 e
incorporadas na análise. A comparação dos valores do RIN entre os dois procedimentos de
extração de RNA utilizados estão descritos na figura 5.
Figura 5 - Comparação da integridade do RNA de amostras de osteossarcoma após extração com dois
protocolos diferentes. O gráfico apresenta as médias e desvios padrão dos RINs obtidos nas extrações. A
coluna da esquerda (em vermelho) representa as amostras extraídas com TRIZOL e a da direita (em azul),
extraídas por kit. Não houve diferença estatística significativa (p=01642). Teste de Mann-Whitney.
De acordo com o gráfico, podemos observar que não houve diferença significativa de
qualidade do RNA entre os dois métodos de extração utilizados em nosso trabalho
(p=0,1642).
Em nosso trabalho, amostras com RIN > 4 apresentaram uma qualidade satisfatória
para a análise, o que foi comprovado pela baixa variação dos Cts (1,27) observada na análise
de expressão gênica dos genes normalizadores (endógenos), que será apresentada na tabela
4. Portanto, independentemente do método utilizado para a extração, as 31 amostras que
obtiveram o RIN ≥ 4 foram selecionadas para o estudo. A mesma análise de qualidade foi
aplicada as 32 amostras de RNA provenientes da FMRP/USP. Dessas, 12 amostras
27
apresentaram RIN > 4 e foram incluídas nas análises subsequentes. Assim, totalizando 43
amostras aptas a análise de expressão dos genes alvos (Figura 3).
5.4 Avaliação de contaminação com DNA genômico e tratamento das amostras de RNA
com DNase
Após a extração de RNA, para as amostras do HCB pôde-se observar que todas
amplificaram o gene KRAS, o que confirma a contaminação por DNA nessas amostras (Figura
6).
Figura 6 - Gel de agarose para a avaliação da amplificação do gene KRAS nas amostras de RNA. M: Ladder
(1Kb plus - Life Technologies); C+: controle positivo (DNA genômico); C-: controle negativo (sem amostra). O
tamanho esperado para o fragmento amplificado é de 202 pares de bases.
Após o tratamento com DNAse, as amostras foram novamente submetidas a
amplificação do gene KRAS, para a avaliação da eficiência do tratamento. O tratamento foi
eficiente para eliminar a contaminação das amostras de RNA com DNA genômico, pois não
observamos a amplificação do fragmento esperado deste gene, exceto para a amostra nº 70
(Figura 6). Como não havia mais RNA disponível dessa amostra, optamos por excluí-la das
análises. Estes resultados foram obtidos após a quantificação do RNA com o aparelho Qubit,
para os quais os motivos serão apresentados no tópico a seguir.
Figura 7 - Gel de agarose para a avaliação da amplificação do gene KRAS nas amostras de RNA após
tratamento com DNase. M: Ladder (1Kb plus - Life Technologies); L: linhagem celular de ostessarcoma SAOS;
C+: controle positivo (DNA genômico); C- : controle negativo (sem amostra). O tamanho esperado para o
fragmento amplificado é de 202 pares de bases.
28
5.5 Análise da expressão dos normalizadores e requantificação das amostras utilizando o
Qubit
Para a avaliação da expressão gênica dos alvos selecionados, utilizou-se a técnica de
RT-qPCR. Inicialmente foi avaliada a expressão gênica dos dois genes endógenos (ACTB e
GAPDH) com o intuito de selecionar o melhor gene normalizador, ou seja, aquele que
apresentou menor variação de Cts dentre todas as amostras de osteossarcoma avaliadas.
Sendo assim, a partir da quantificação obtida pelo Nanovue, 1µg de RNA foi tratado
com DNase e após confirmação da eficiência do tratamento, as amostras foram submetidas
a síntese de cDNA e avaliação da expressão dos genes endógenos. Essa análise revelou um
alto desvio padrão na análise de expressão dos genes endógenos quando consideradas todas
as amostras do estudo, o que não é satisfatório para genes que servirão de normalizadores
para a análise de expressão gênica dos genes alvo (tabela 2).
Tabela 2 – Média e desvio padrão dos Cts dos normalizadores ACTB e GAPDH, obtidos após análise de expressão gênica a partir de RNA quantificado por meio do Nanovue.
Gene Média Ct Desvio Padrão
ACTB 24,48 2,66
GAPDH 22,84 2,08
Devido à degradação parcial observada nas amostras de RNA (RIN entre 4 e 7), optou-
se por realizar a quantificação com o Qubit, já que esse método utiliza sondas moleculares
específicas para a quantificação de RNA íntegro e portanto, proporciona uma análise mais
fidedigna da quantidade de RNA nas amostras em estudo.
Diante dos resultados de quantificação descritos na tabela 3, observa-se a grande
variação apresentada entre a quantificação realizada pelo NanoVue e pelo Qubit, o que
mostrou a necessidade de requantificar todas as amostras utilizando-se essa nova
abordagem mais precisa.
29
Tabela 3 – Comparação da quantificação de RNA realizada pelos dois métodos utilizados neste trabalho
Nº Amostra NanoVue (ng/µL) Qubit (ng/µL)
13 2292 17,4
48 1338 556
49 1325 794
63 305 119
64 4276 1350
Assim, após a requantificação das amostras utilizando-se o Qubit, duas foram excluídas
devido à baixa quantidade de RNA disponível e impossibilidade de re-extração do RNA a
partir do fragmento de tecido. Portanto, baseado na quantificação das amostras pelo Qubit,
1µg das 41 amostras de RNA remanescentes foi novamente tratado com DNase e após
confirmação da eficiência do tratamento, houve a necessidade de exclusão de mais uma
amostra. Dessa forma, o RNA de 40 amostras foi submetido a síntese de cDNA e avaliação da
expressão dos genes endógenos.
Ainda, na análise de expressão dos genes endógenos, quatro amostras apresentaram
níveis muito baixos de expressão para estes genes (alto Ct) quando comparados a média
geral das amostras. Mesmo sendo aprovadas em todos os parâmetros determinados em
nosso trabalho, optamos por excluir essas amostras, pois isso poderia gerar um viés nas
análises de expressão dos lncRNAs para estas amostras. Assim, as análises de expressão dos
genes alvos seguiram com 36 amostras de RNAs de osteossarcoma.
A análise de expressão dos genes endógenos (ACTB e GAPDH), nestas 36 amostras
revelou que o gene ACTB apresentou a menor variação de expressão entre todas amostras
avaliadas, sendo então escolhido para normalização dos dados de expressão gênica dos
genes alvos (Tabela 4).
Tabela 4 - Média e desvio padrão dos Cts dos normalizadores ACTB e GAPDH, obtidos após análise de expressão gênica a partir de RNA quantificado por meio do Qubit.
Gene Média Ct Desvio Padrão
ACTB 19,50 1,27
GAPDH 19,00 2,06
30
5.6 Características clínicas, patológicas e demográficas dos pacientes com osteossarcoma
A caracterização das amostras foi realizada para os 36 pacientes, para os quais a
análise de expressão dos genes foi realizada. A maioria eram do sexo feminino (55,6%), com
idade entre 4 e 29 anos. A média de idade ao diagnóstico foi de 15 anos.
Quanto às características clínicas, ao diagnóstico, a maioria dos pacientes (53,6%)
apresentaram tumores menos volumosos (<12cm). Dos 36 pacientes do estudo, foi possível
obter o tamanho do tumor de 20 pacientes, sendo que a medida de 9 pacientes foi obtida
através da radiografia convencional, 7 através de ressonância magnética e 4 por tomografia
computadorizada. A localização mais frequente do tumor foi o fêmur em 16 pacientes
(44,4%), sendo o subtipo histológico mais comum o osteoblástico, que foi confirmado em 28
casos (77,8%). Em relação ao grau de resposta à quimioterapia (grau de Huvos-Ayala), a
maioria dos pacientes apresentou resposta parcial com mais de 50% de necrose, grau 2 de
Huvos-Ayala que foi observado em 14 pacientes (41,17%), sendo que 12 pacientes (35,3%)
não responderam a quimioterapia (grau 1 de Huvos-Ayala), seis (17,64%) apresentaram mais
que 90% de necrose tumoral, com tumor viável presente, dois (5,88%) apresentaram grau 4,
sem tumor viável e, para dois pacientes o grau de Huvos não se aplicava pois os pacientes
não realizaram cirurgia após quimioterapia. Em relação à presença de metástases, 20
pacientes (55,6%) não apresentaram metástases, e nos 16 pacientes metastáticos (44,4%), a
metástase pulmonar foi a mais frequente. Todos esses dados podem ser visualizados na
tabela 5.
31
Tabela 5 – Características clínicas, patológicas e demográficas dos pacientes com osteossarcoma para a análise
de expressão dos lncRNAs.
Variável Categoria n (%)
Sexo feminino 20 (55,6)
masculino 16 (44,4)
Idade ao diagnóstico
<10 anos 7 (19,4)
>10 anos 29 (80,6)
Média 15 anos
Local do tumor
Fêmur 16 (44,4)
Tíbia 11 (30,6)
Úmero 6 (16,7)
Fíbula 3 (8,3)
Tipo histológico
Osteoblástico 28 (77,8)
Condroblástico 5 (13,9)
Fibroblástico 2 (5,6)
Telangectásico 1 (2,8)
Grau de Huvos*
Grau 1 12 (35,3)
Grau 2 14 (41,17)
Grau 3 6 (17,64)
Grau 4 2 (5,88)
Tamanho do tumor*
<12 15 (53,6)
>=12 13 (46,4)
Metástases*
Não metastático 20 (57,1)
Metástase ao diagnóstico
7 (20,0)
Metástase após diagnóstico
8 (22,9)
*nº de pacientes cuja variável foi possível obter os dados
5.7 Análise da expressão dos lncRNAs
O presente estudo avaliou a expressão dos lncRNAs nas 36 amostras tumorais de OS
por meio da RT-qPCR.
Os resultados obtidos e normalizados mostram uma ampla variação na expressão dos
quatro genes avaliados. Interessante notarmos que para algumas amostras, a expressão dos
32
genes não foi detectada demonstrando que os genes não eram expressos nestas amostras,
principalmente para os genes HOTAIR e BCYRN1. Neste experimento, foi utilizada uma
linhagem celular de osteossarcoma (SAOS2) a fim de verificar o perfil de expressão desses
genes nesta linhagem. Como podemos notar, estes genes apresentam uma baixa expressão
nessa linhagem celular de osteossarcoma.
Abaixo estão demonstrados os gráficos (Figura 8), referentes a expressão de cada um
dos lncRNAs nas 36 amostras de OS.
Figura 8 - Expressão normalizada dos lncRNAs em osteossarcoma avaliada por RT-qPCR. A: MALAT1; B: HULC;
C: HOTAIR; D: BCYRN1. No eixo x, cada número representa uma amostra. No eixo y está representado o valor
normalizado de expressão do lncRNA avaliado. A normalização foi realizada de acordo com o modelo
matemático 2- ΔCt, sendo o gene endógeno ACTB utilizado como normalizador.
33
Figura 8 (Continuação) - Expressão normalizada dos lncRNAs em osteossarcoma avaliada por RT-qPCR. A:
MALAT1; B: HULC; C: HOTAIR; D: BCYRN1. No eixo x, cada número representa uma amostra. No eixo y está
representado o valor normalizado de expressão do lncRNA avaliado. A normalização foi realizada de acordo
com o modelo matemático 2- ΔCt, sendo o gene endógeno ACTB utilizado como normalizador.
5.8 Associação da expressão dos lncRNAs com os fatores clínico-patológicos dos
pacientes
Tendo em vista o potencial papel dos lncRNAs na carcinogênese e sua influência no
prognóstico de pacientes com câncer, foi avaliada a correlação da expressão desses genes
com os fatores clínicos-patológicos considerados no estudo como tipo histológico, grau de
Huvos, sexo, idade ao diagnóstico, local do tumor, tamanho do tumor e presença de
metástase.
34
Considerando a expressão dos genes como uma variável numérica, podemos observar
que para o gene BCYRN1 sua maior expressão está associada significativamente com
pacientes que apresentam idade acima de 10 anos (p=0,036). Apesar de não significativos,
nós podemos destacar algumas observações como por exemplo o grupo de tumores com
grau histológico condroblástico, fibroblástico e telangectásico, apresenta em média pelo
menos quatro vezes maior expressão de BCYRN1 quando comparado aos tumores
osteoblásticos. Além disso, a maior expressão deste gene também pode ser observada nos
tumores menos responsivos a quimioterapia (grau Huvos 1/2) quando comparados aos que
respondem (Huvos 3/4). Em relação a presença de mestástases, tumores associados a
metástases apresentaram maior expressão de BCYRN1 (em média três vezes maior) em
comparação aos casos não metastáticos (Tabela 6).
Para o gene HOTAIR, apesar da associação da expressão gênica e as características
clínico-patológicas dos pacientes não serem significativas, podemos observar maior
expressão de HOTAIR no grupo de tumores com tipo histológico condroblástico, fibroblástico
e telangectásico, aproximadamente 13 vezes maior, quando comparado aos tumores
osteoblásticos. Podemos observar também uma maior expressão de HOTAIR nas amostras
de pacientes não metastáticos, ainda em tumores localizados na fíbula, tíbia ou úmero ou
que responderam pior à QT pré-operatória (Huvos 1/2) e que ao diagnóstico apresentaram
tamanho do tumor menor que 12cm (Tabela 7).
Para o gene HULC, a associação da expressão gênica e as características clínico-
patológicas dos pacientes também não foram significativas, entretanto podemos observar
que a média de expressão foi maior em pacientes que apresentaram tumores do tipo
histológico osteoblástico, em tumores de pacientes com idade igual ou superior a 10 anos e
em tumores para os quais o paciente apresentou metástase após o diagnóstico (Tabela 8).
Em relação ao MALAT1, sua maior expressão foi associada significativamente a
pacientes com idade igual ou superior a 10 anos. Apesar de não encontrarmos associação
significativa às demais características clínico-patológicas, observamos a maior expressão de
MALAT1 em pacientes do sexo masculino, em tumores localizados na fíbula, tíbia ou úmero.
Ainda, quando consideramos a presença de metástase independente do momento,
observamos uma expressão um pouco aumentada de MALAT1 em pacientes não
metastáticos. Entretanto, quando os pacientes que tem metástase são estratificados em
35
dois grupos, observamos que a maior expressão do gene ocorre nos tumores de pacientes
que desenvolvem metástase ao longo do tratamento (Tabela 9).
Analisando os resultados obtidos, podemos notar que as amostras analisadas
mostraram uma ampla variação de expressão dos quatro genes analisados, como
demonstrado anteriormente (Figura 8). Os valores de média, desvio padrão, mediana e
percentis dos resultados obtidos para os genes analisados estão demonstrados nas tabelas
de 6 a 9.
36
Tabela 6 – Comparação da média de expressão do BCYRN1 com as características clínico-patológicas dos pacientes avaliados.
No nosso estudo, a maior expressão do MALAT1 foi associada significativamente a
pacientes com idade igual ou superior a 10 anos quando analisamos a média da expressão
(p=0,048), e após a categorização da expressão (p=0,008). Na literatura, não encontramos
associação significativa deste gene com a idade63, 129-132.
Apesar de não encontrarmos associação significativa com as demais características
clínico-patológicas, observamos uma maior expressão do MALAT1 em pacientes do sexo
masculino, em tumores localizados na fíbula, tíbia ou úmero. MALAT1 se mostrou com uma
expressão um pouco aumentada em pacientes não metastáticos quando avaliamos a
presença de metástase independente do momento diagnosticado. Entretanto, após a
estratificação dos pacientes metastáticos, pudemos observar que a maior expressão do gene
ocorre nos tumores de pacientes que desenvolvem metástase durante o tratamento. Além
disso, observamos também que a maioria dos pacientes com baixa expressão não obtiveram
boa resposta à quimioterapia (grau 1/2).
O mecanismo de ação molecular do MALAT1 é ainda muito discutido. Em linhagem de
células tumorais humanas, a inibição de MALAT1 suprimiu a migração e invasão57. Ao injetar
em camundongos, xenoenxertos de células tumorais de câncer de pulmão não pequenas
células, a formação e o crescimento dos tumores se mostraram prejudicada com a
diminuição da expressão do MALAT1130. Diversos estudos têm mostrado uma forte
associação da superexpressão do MALAT1 com a presença de metástase e um prognóstico
ruim57, 63, 99, 129-132.
Um estudo pioneiro com MALAT1 propôs identificar diferenças na expressão gênica
entre tumores de pulmão não pequenas células que metastatizaram ou não e encontrou
uma expressão maior (cerca de três vezes mais) nas amostras de pacientes que
desenvolveram metástases, além da drástica piora na sobrevida global57.
A superexpressão de MALAT1 foi avaliada em amostras de tumores como mieloma
múltiplo e revelou que este lncRNA possui um papel na patogênese da doença e que a
alteração na expressão desse gene depois do tratamento foi clinicamente significativa e
pode servir como um preditor molecular dos pacientes em risco de progressão precoce.
Além disso, este estudo revelou que pacientes com menor expressão do MALAT1 tinham
65
significativamente maior sobrevida livre de progressão em comparação com os pacientes
com uma menor alteração na expressão62.
Em osteossarcoma, um estudo que teve como objetivo demonstrar a associação entre
os níveis de expressão de MALAT1 e características clínico-patológicas encontrou que a
expressão do gene nos tecidos tumorais foi significativamente maior do que em tecidos
normais; a presença de metástases pulmonares e acometimento linfonodal foram
significativamente mais comuns no grupo de maior expressão; não houve associação entre a
expressão do gene e o sexo, tamanho do tumor e sobrevida em 5 anos, e em relação a
idade, o grupo com maior expressão do MALAT1 foi o mais jovem (em média, 16 anos)
(p=0,05). Neste estudo, o autor concluiu que o osteossarcoma apresenta expressão elevada
de MALAT1 e que o nível de expressão associa-se a uma maior probabilidade de desenvolver
metástases pulmonares e acometimento linfonodal63. Outro estudo em osteossarcoma
mostrou que a expressão do MALAT1 foi significativamente maior no grupo de maus
respondedores ao tratamento quimioterápico, mas não encontrou associação com a
sobrevida global e livre de eventos, assim como no nosso estudo99.
6.4 Limitações do estudo
Como podemos observar, para a maioria das análises desenvolvidas em nosso estudo
não foi possível encontrar associações significativas indicando o papel prognóstico destes
genes em OS. Entretanto, uma limitação do nosso projeto foi o pequeno número de
amostras (36) que pôde ser avaliado, uma vez que temos no biobanco da instituição
amostras tumorais congeladas provenientes de 175 pacientes (os motivos da exclusão
dessas amostras já foi descrito anteriormente). Uma parte considerável dessas amostras foi
excluído devido aos restringentes critérios de qualidade determinados para que as amostras
fossem utilizadas em nossas análises. Em contrapartida, esses critérios nos permitem afirmar
com segurança, que nossos dados refletem com fidelidade a expressão destes genes em OS.
Somado a essa pequena amostragem, temos o fato de que 35% dos pacientes
apresentam um tempo de seguimento menor do que dois anos, o que pode não ser tempo
suficiente para um paciente acometido por OS apresentar metástase ou óbito.
Reconhecemos tais limitações e sugerimos que o aumento da amostragem,
principalmente com a inclusão de pacientes com um tempo maior de seguimento pode nos
revelar o real papel prognóstico destes genes em OS.
66
7 CONCLUSÕES
Não houve diferença em termos de qualidade na extração do RNA entre o TRIZOL e
método comercial baseado em coluna;
A quantificação das amostras utilizando o Qubit é mais precisa e deve ser utilizada nas
análises de expressão gênica quando o RNA apresenta degradação parcial;
A maior expressão de BCYRN1 foi associada significativamente a pacientes com idade
acima de 10 anos e com o subtipo condroblástico/fibroblástico/telangectásico;
A expressão de HOTAIR não tem associação significativa com as características clínico-
patológicas avaliadas;
A expressão de HULC não tem associação significativa com as características clínico-
patológicas avaliadas;
A maior expressão de MALAT1 foi associada significativamente a pacientes com idade
acima de 10 anos;
As expressões de BCYRN1, HOTAIR, HULC e MALAT1 não foram significativamente
associadas a SG e SLE dos pacientes.
67
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Motivo da interrupção / Não seguimento no protocolo – Quimioterapia adjuvante
1- Crescimento do tumor após indução; 2- Ulceração / Sangramento do tumor;
3- Dor intratável; 4- Outros ____________
335
336
Radioterapia 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
336
337
Cirurgia 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
337
338
Data da cirurgia DD/MM/AAAA
338
339
Tipo de Cirurgia 1- Urgente; 2- Eletiva; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
339
440
Tipo de ressecção 1- Com preservação do membro; 2- Sem preservação do membro
(amputação); 88- Não se aplica; 99- Ignorado
440
441
Se realizou cirurgia, qual resultado? 1- Completamente ressecado com margens livres;
2- Completamente ressecado com margens comprometidas; 3- Ressecção incompleta
441
442
Reconstrução 1- Biológica; 2- Mecânica; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
442
443
Complicações cirúrgicas 0- Não; 1- Sim; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
443
444
Infecção de ferida operatória 0- Não; 1- Sim, precoce (até 30 dias); 2- Sim, tardia; 88- Não se aplica; 99-
Ignorado
444
445
Eventos tromboembólicos 0- Não; 1- TVP; 2- TEP
445
446
Deiscência de ferida operatória 0- Não; 1- Sim, sem necessidade de reabordagem; 2- Sim, com necessidade
de reabordagem; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
446
447
Tipo histológico DESCREVER
447
448
Huvos (Aplicavel apenas para Osteossarcoma) 1- Grau 1; 2- Grau 2; 3- Grau 3; 4- Grau 4; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
448
80
449
Estadiamento utilizado
449
550
Metástases 0- Ausentes; 1- Presentes
550
551
Data da metástase DD/MM/AAAA
551
552
Local da metástase - Pulmão 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
552
553
Local da metástase - Ossos 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
553
554
Local da metástase - Medula Óssea 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
554
555
Local da metástase - SNC 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
555
556
Local da metástase – Outro local 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
556
557
Cirurgia de tórax 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
557
558
Data da cirurgia de tórax DD/MM/AAAA
558
559
DHL
559
660
Data da última informação / óbito DD/MM/AAAA
660
661
Status 1- Vivo sem doença; 2- Vivo com doença; 3- Óbito por câncer; 4-
Óbito por outra doença
661
662
Perdeu seguimento (tempo do retorno x 2) 0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
662
OBS.:
81
Anexo B – Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Câncer de Barretos e do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/Universidade de São Paulo.