VANDA LUCIA DOS SANTOS AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA, ANTIDIARRÉICA E ANTIESPASMÓDICA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO E FASE ACETATO DE ETILA OBTIDOS DA ENTRECASCA DO CAULE DE Maytenus rigida Mart. (CELASTRACEAE) EM MODELOS ANIMAIS UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA “PROF. DELBY FERNANDES DE MEDEIROS” PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS João Pessoa - PB 2008
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VANDA LUCIA DOS SANTOS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA,
ANTIDIARRÉICA E ANTIESPASMÓDICA DO EXTRATO
ETANÓLICO BRUTO E FASE ACETATO DE ETILA OBTIDOS DA
ENTRECASCA DO CAULE DE Maytenus rigida Mart.
(CELASTRACEAE) EM MODELOS ANIMAIS
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA
“PROF. DELBY FERNANDES DE MEDEIROS”
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS
E SINTÉTICOS BIOATIVOS
João Pessoa - PB
2008
Livros Grátis
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VANDA LUCIA DOS SANTOS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA,
ANTIDIARRÉICA E ANTIESPASMÓDICA DO EXTRATO
ETANÓLICO BRUTO E FASE ACETATO DE ETILA OBTIDOS DA
ENTRECASCA DO CAULE DE Maytenus rigida Mart.
(CELASTRACEAE) EM MODELOS ANIMAIS
ORIENTADORA: Profa. Dra. Leônia Maria Batista CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Bagnólia Araújo da Silva
João Pessoa – PB 2008
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde, do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica “Prof. Delby Fernandes de Medeiros” da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para a obtenção do título de DOUTOR EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS. Área de concentração: FARMACOLOGIA
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F ICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL – UEPB
S237a Santos, Vanda Lucia dos. Avaliação da atividade antiulcerogênica,
antidiarréica e antiespasmódica do extrato etanólico bruto e fase acetato de etila obtidos da entrecasca do caule de Maytenus rigida Mart. (Celastraceae) em modelos animais / Vanda Lucia dos Santos. – 2008.
118 f. : il. color.
Digitado. Tese (Doutorado) – Universidade Federal da
Paraíba, Centro de Ciências da Saúde, 2008. “Orientação: Profa. Dra. Leônia Maria Batista, Departamento de Ciências Farmacêuticas”. “Co-Orientação: Profa. Dra. Magnólia Araújo da Silva, Departamento de Ciências Farmacêuticas”.
1. Úlcera Gástrica. I. Título.
21. ed. CDD 616.334
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VANDA LUCIA DOS SANTOS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA, ANTIDIARRÉICA E
ANTIESPASMÓDICA DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO E FASE
ACETATO DE ETILA OBTIDOS DA ENTRECASCA DO CAULE DE
Maytenus rigida Mart. (CELASTRACEAE) EM MODELOS ANIMAIS
Aprovada em ______ / ______ /______
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________ Profa. Dra. Leônia Maria Batista
Orientadora
_______________________________________________ Profa. Dra. Bagnólia Araújo da Silva
Co-orientador
_______________________________________________ Profa. Dra. Ana Beatriz A. de Almeida
(Universidade de Campinas) Examinadora Externa
_______________________________________________ Profa. Dra. Terezinha Gonçalves da Silva (Universidade Federal de Pernambuco)
Examinadora Externa
_______________________________________________ Profa. Dra. Márcia Regina Piuvezan (Universidade Federal da Paraíba)
Examinadora Interna
_______________________________________________ Profa. Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz
(Universidade Federal da Paraíba) Examinadora Interna
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Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo,
qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim.
(Chico Xavier)
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Ao meu filho Matheus Albino, a maior razão de lutar por meus ideais; Ao meu esposo Robério, por ser presença constante na minha vida; Aos meus pais José Albino (in memoriam) e Eunice, por terem me ensinado a amar o que faço; Aos meus irmãos e irmãs por não terem medido esforços desde o início de minha vida universitária.
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AGRADECIMENTOS
A DEUS, por sempre ter me guiado, protegido e iluminado meus caminhos na busca de momentos de sabedoria; Ao meu amado filho Matheus Albino por ser o meu presente de Deus e ao meu esposo Robério por ter suportado a distância e dado o apoio necessário; Aos meus pais José Albino (in memoriam) e Eunice por terem acreditado em mim. A minha família, pelo amor, incentivo e por estar presente, mesmo que à distância no decorrer de toda esta caminhada; A minha irmã Goretti e seus filhos Michaelle e Philipe por terem me acolhido e serem presença constante nesta caminhada; A Profa. Leônia Maria Batista pela constante presença como orientadora, pelo exemplo de dedicação à ciência e acima de tudo pela amizade e confiança; A Profa. Bagnólia Araújo da Silva por ter me aceitado como orientanda, acreditando que eu seria capaz e pela amizade; A Profa. Dra. Alba Lígia M. Souza Brito e seus pupilos Anderson e Elisângela pela realização dos experimentos de muco e prostaglandina; A UNICAMP por ter cedido o laboratório e os animais para os experimentos de muco e prostaglandina; Ao Prof. José Maria Barbosa-Filho por ter cedido os resultados da pesquisa no NAPRALERT de Maytenus rigida Mart. e o laboratório para a preparação do extrato; Ao técnico Nonato pela preparação do extrato etanólico de Maytenus rigida Mart.; A Profa. Maria de Fátima Vanderlei de Souza e seus alunos pelo fracionamento do extrato e fornecimento da fase acetato de etila de Maytenus rigida Mart.; A Juliana da Nóbrega Carreiro (IC) e Rosimeire Ferreira dos Santos (Doutoranda) pela realização dos experimentos de investigação da atividade antiespasmódica; A amiga-irmã Dilma Trovão pela amizade, carinho e por ter cedido as fotos da planta; A amizade dos companheiros do Grupo de Úlcera: Heloína, Igara, Juliana, Jaqueline, Sabrina, Kelly e Guilherme pelo interesse e incansável auxílio nos experimentos e padronização dos novos modelos;
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A Elise e Vivian pela grande ajuda, apoio e incentivo no início deste trabalho e pela amizade firmada; A Alessandra, Josimar, Raissa, Thúlio e Rossana pelo companheirismo nas viagens Campina-João Pessoa, João Pessoa-Campina; Aos funcionários do Biotério do LTF em especial ao técnico e amigo Crispim pelo fornecimento dos animais, apoio técnico e competência; Aos docentes do curso de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos pelo respeito, amizade e conhecimentos transmitidos; A todos os colegas do curso de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos pelo respeito e amizade; A Tânia Maria Alves de Araújo, secretária da Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos da UFPB, pela eficiência e amizade incondicional. À Universidade Estadual da Paraíba (UEPB) em especial ao Departamento de Farmácia, pelo incentivo e investimento na qualificação e aperfeiçoamento do seu corpo docente, proporcionando minha liberação para a capacitação docente; Ao Programa de Qualificação Institucional da CAPES através do convênio firmado entre a UFPB/UEPB, que me deu esta oportunidade; A CAPES pelo apoio financeiro e pelo suporte técnico-científico através do Portal Periódicos A todos que direta ou indiretamente participaram da produção deste trabalho;
O meu muito obrigada!
Vanda Lucia dos Santos
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RESUMO
O gênero Maytenus (Celastraceae), comumente utilizado no tratamento de úlceras gástricas e dispepsia, é quimicamente caracterizado pela presença de metabólitos fenólicos como taninos, triterpenos e flavonóides. A espécie Maytenus rigida Mart., popularmente conhecida como “bom-nome”, “chapéu de couro” ou “pau-de-colher”, ocupa áreas da caatinga e agreste de Sergipe, Pernambuco e Paraíba, sendo utilizada na medicina tradicional como analgésica, antiinflamatória e para distúrbios gastrintestinais. Este estudo teve como objetivo investigar a atividade antiulcerogênica, antidiarréica e espasmolítica do extrato etanólico (EEOH) e a fase acetato de etila (AcOEt) obtidos da entrecasca do caule de M. rigida. Os testes antiulcerogênicos foram realizados usando os agentes lesivos HCl/etanol, estresse e antiinflamatório não esteroidal (AINE) em camundongos e etanol em ratos. No modelo HCl/etanol o EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) reduziu o índice de lesão ulcerativa (ILU) em 44, 70 e 78 %, respectivamente. O EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) ou a F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg) no modelo de etanol, inibiram o ILU em 52, 87, 95 % e 47, 81, 87 %, respectivamente. Resultados similares foram observados em modelo de úlcera induzida por estresse, em que a inibição do ILU foi 65, 86, 89 % e 60, 80, 87 % para EEOH e F. AcOEt, respectivamente, ou por AINE com inibição de 55, 81, 94 % e 41, 69, 80 % para EEOH e fase respectivamente. Em ratos com ligadura do piloro, o EEOH e a F. AcOEt não alteraram os parâmetros bioquímicos do suco gástrico. No modelo de úlcera induzida por ácido acético 30 %, o tratamento crônico com a fase promoveu cicatrização da úlcera (52 % de cicatrização). Na pespectiva de elucidação do mecanismo de ação envolvido no efeito citoprotetor, os dados mostram que a F. AcOEt induziu aumento da produção de muco gástrico dependente do óxido nítrico (NO); que envolve a participação dos compostos sulfidrilas; porém, o aumento da produção de muco independe da via das prostaglandinas uma vez que M. rigida não elevou os níveis de PGE2. Na avaliação da atividade antidiarréica, o EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) e a fase (125, 250 ou 500 mg/kg) inibiram em 32, 68, 80 e 40, 55, 73 %, respectivamente, a diarréia induzida por óleo de rícino e o trânsito intestinal normal em 24, 35, 37 % e 23, 33, 37 %, respectivamente, e o trânsito induzido por óleo de rícino em 43 e 42 % para EEOH (500 mg/kg) e fase (250 mg/kg), respectivamente. Na avaliação do efeito antiespasmódico, tanto o EEOH quanto a fase relaxaram o íleo de cobaia pré-contraído com KCl com valores de CE50=39,4±12,6 e 22,0±5,3 µg/mL, respectivamente, ou com carbacol com valores de CE50=11,6±2,5 e 16,6±4,4 µg/mL, para EEOH e fase, respectivamente. Estes dados indicam uma ação citoprotetora gástrica de M. rigida dependente da liberação de muco, da via do NO e com participação dos grupamentos sulfidrila, além de atividade antidiarréica e antiespasmódica, dando suporte a utilização desta espécie pela população nos transtornos gastrintestinais. Palavras-chave: Úlcera gástrica, Maytenus rigida, gastroproteção, atividade antidiarréica, atividade antiespasmódica
Avaliação da atividade antiulcerogênica, antidiarréica e antiespasmódica do extrato etanólico bruto e fase acetato de etila obtidos da entrecasca do caule de Maytenus rigida Mart. (Celastraceae) em modelos animais
SANTOS, V.L. Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos,
Tese de Doutorado, LTF/CCS/UFPB (2008)
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ABSTRACT
The genus Maytenus (Celastraceae), commonly used for the treatment of gastric ulcers and dyspepsia, is chemically characterized by the presence of phenolic metabolites as condensed tannins, triterpenes and flavonoids. The species Maytenus rigida Mart., popularly known as “bom-nome, “chapéu de couro” or “pau de colher”, occupies areas of “caatinga” and “agreste” from Sergipe, Pernambuco and Paraíba, are used in traditional medicine as analgesic, gastrointestinal disorders and anti-inflammatory. This study aims to investigate the antiulcerogenic, antidiarrheal and antispasmodic activities from the ethanol extract (EEOH) and the ethyl acetate phase (AcOEt) obtained from the stem bark of M. rigida. The antiulcer assays were performed using the following protocols: HCl/ethanol, stress and nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) in mice, and ethanol in rats. In the HCl/ethanol-induced ulcer model, the EEOH (250, 500 or 750 mg/kg) significantly reduced the ulcerative lesion index (ULI) in 44, 70 and 78 % respectively. The EEOH (250, 500 or 750 mg/kg) or AcOEt phase (125, 250 or 500 mg / kg) in the ethanol-induced ulcer model, inhibited respectively the ULI in 52, 87, 95 % and 47, 81, 87 %. Similar results were observed in the stress-induced ulcer model, where the inhibition of ULI were 65, 86, 89 % and 60, 80, 87 % for EEOH and AcOEt phase respectively, or AINE with inhibition of 55, 81 94 % and 41, 69, 80 % for EEOH and phase respectively. In rats with pylorus ligation, neither the EEOH (500 mg / kg) nor the AcOEt phase (250 mg / kg) (id) changed biochemical parameters of gastric juice. In the model of ulcer induced by 30% acetic acid, chronic treatment with the phase promoted healing of the ulcer (healing of 52%). In the elucidation of the mechanisms of action involved in the cytoprotectant effect, the data show that the AcOEt phase (250 mg/kg) induced increased production of gastric mucus depending on the nitric oxide (NO); involving the participation of the sulphydryl compound; but the increased production of mucus independent of the via of prostaglandins since M. rigida was unable to raise the levels of PGE2. In assessing the antidiarrheal activity, the EEOH (250, 500 or 750 mg/kg) or phase (125, 250 or 500 mg/kg) inhibited in 32, 68, 80 and 40, 55, 73% respectively, the castor oil-induced diarrhea and normal intestinal transit in 24, 35, 37% and 23, 33 and 37% respectively, and castor oil-induced transit in 43 and 42% for EEOH (500 mg/kg) and phase (250 mg / kg) respectively. In assessing the antispasmodic activity, both the EEOH (0.1 - 500 µ g/ml) and AcOEt phase (0.1 - 500 µg/ml) concentration-dependently and significantly relaxed the guinea pig ileum pre-contracted with KCl 40 mM with values of EC50 = 39,4 ± 12,6 µg/mL and EC50 = 22,0 ± 5,3 µg/mL, for EEOH and phase respectively, or with carbachol 10-6 M with values of EC50 = 11,6 ± 2,5 µg/mL and EC50 = 16,6 ± 4,4 µg/ml, for EEOH and phase respectively. These data collectively suggest a cytoprotectant gastric action of M. rigida dependent on the release of mucus, on the NO path and with participation of non-protein sulphydryl groups, besides they indicate antidiarrheal and antispasmodic activities, supporting the use of this species by the population for gastrointestinal disorders. Key-words: gastric ulcer, Maytenus rigida, gastroprotetion, antidiarrheal activity, antispasmodic activity.
Evaluation of the antiulcerogenic, antidiarrheal and antispasmodic activities of crude extract ethanol and ethyl acetate phase obtained from the stem bark of Maytenus rigida Mart. (Celastraceae) in animals models
SANTOS, V.L. Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos,
Tese de Doutorado, LTF/CCS/UFPB (2008)
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1-
Tabela 2-
Tabela 3-
Tabela 4-
Tabela 5-
Tabela 6-
Tabela 7-
Tabela 8-
Tabela 9-
Tabela 10-
Composição da solução de Krebs modificado.........................
Efeito da administração oral do EEOH de M. rigida ou
lansoprazol nas lesões gástricas induzidas por HCl/etanol
em camundongos ...................................................................
Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida ou lansoprazol nas lesões gástricas induzidas por
etanol em ratos........................................................................
Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida ou cimetidina nas lesões gástricas induzidas por
estresse em camundongos......................................................
Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida ou cimetidina nas lesões gástricas induzidas por
piroxicam em camundongos ...................................................
Efeito da administração intraduodenal do EEOH e F. AcOEt
de M. rigida ou cimetidina sobre os parâmetros bioquímicos
do suco gástrico no modelo de ligadura do piloro em ratos ...
Efeito da administração oral da F. AcOEt de M. rigida ou
cimetidina por 14 dias consecutivos sobre o peso corporal e
dos órgão de ratos com úlcera induzida por ácido acético......
Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida ou loperamida na diarréia induzida por óleo de rícino
em camundongos ...................................................................
Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida ou atropina no trânsito intestinal de ratos .....................
Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida ou atropina no trânsito intestinal induzido por óleo de
rícino em ratos ........................................................................
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65
66
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1-
Figura 2-
Figura 3-
Figura 4-
Figura 5-
Figura 6-
Figura 7-
Figura 8-
Figura 9-
Figura 10-
Figura 11-
Úlcera péptica: (A) úlcera esofágica, (B) úlcera gástrica e (C)
AcOEt, e F. AcOEt + indometacina. Nos animais dos grupos 2 e 3 foi
administrado v.o. solução salina 0,9 % e nos animais dos grupos 4 e 5
receberam F. AcOEt. Após trinta minutos a indometacina (inibidor da síntese de
PGs) na dose de 20 mg/kg subcutânea foi administrada aos grupos 3 e 5. Uma
hora após o tratamento inicial os ratos foram eutanasiados, os estômagos
retirados e abertos, a mucosa raspada até sua total remoção. O conteúdo foi
pesado, picotado e logo suspenso em uma solução de 1 mL de tampão sódio
fosfato (10mM, pH 7,4); a solução assim obtida foi incubada a 37 °, por um
período de 20 min. A PG presente no tampão foi determinada por “kit”
imunoenzimático (RPN 222-Amersham) em espectrofotômero a 450 nm.
3.10.3 Avaliação da participação do óxido nítrico (SIKIRIC et al., 1997 com
modificações)
Ratos Wistar machos em jejum de 24 horas (com acesso a água ad
libitum) foram divididos em 8 grupos (n = 8) de acordo com os respectivos pré-
tratamentos. Os quatro grupos controle receberam injeção intraperitonial de
solução salina 0,9 % (10 mL/kg) e nos outros quatro grupos foi administrado N-
47
nitro-L-arginina-metil-ester (L-NAME) (10 mg/kg), um inibidor da NO-sintase.
Após 30 min, os grupos receberam por via oral os respectivos tratamentos,
solução salina 0,9 %, EEOH (500 mg/kg), a F. AcOEt (250 mg/kg) ou
carbenoxolona (100 mg/kg). Após 50 min, os animais foram tratados oralmente
com etanol absoluto. Os animais foram eutanasiados após 1 hora e os
estômagos removidos e abertos na grande curvatura. As lesões foram
avaliadas e o índice de lesão ulcerativa foi calculado.
3.10.4 Avaliação da participação dos grupamentos sulfidrila (MATSUDA et
al., 1999)
Ratos em jejum prévio de 24 horas (com acesso a água ad libitum)
foram divididos em oito grupos (n = 8) de acordo com os respectivos pré-
tratamentos. Os quatro grupos controle receberam injeção subcutânea de
solução salina 0,9 % (10 mL/kg) e os outros quatro grupos receberam por esta
mesma via N-etilmaleimida (NEM) 10 mg/kg, um bloqueador de grupamentos
sulfidrila. Após 30 min, os grupos receberam por v.o. os respectivos
tratamentos, solução salina 0,9 %, EEOH (500 mg/kg), a F. AcOEt (250 mg/kg)
ou carbenoxolona (100 mg/kg). Após 50 min, os animais foram tratados
oralmente com 1 mL de etanol absoluto. Os animais foram eutanasiados após
1 hora e os estômagos removidos e abertos na grande curvatura. As lesões
foram avaliadas e o índice de lesão ulcerativa foi calculado.
3.11 Avaliação da atividade antidiarréica e antimotilidade intestinal de
Maytenus rigida
3.11.1 Diarréia induzida por óleo de rícino (AWOUTERS et al, 1978)
Camundongos, em jejum de 12 horas (com acesso a água ad libitum),
foram divididos em grupos (n = 6) e tratados com solução salina 10 mL/kg
(controle negativo), loperamida (10 mg/kg), EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) ou
F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg). Após 1 hora dos tratamentos, foi
administrado 0,7 mL de óleo de rícino por animal por via oral. Os animais
foram colocados em caixas individuais forradas com papel branco. Após a
48
% de inibição =
administração do agente indutor da diarréia, foi realizada a contagem do
número de bolos fecais e observado a consistência dos bolos fecais por até 4
horas, classificando-os de acordo com a consistência em líquidos ou sólidos.
Foi então determinado o número de episódios líquidos e o número total de
bolos fecais.
3.11.2 Trânsito intestinal normal (STICKNEY; NORTHUP, 1959)
Ratos, em jejum de 12 horas (com acesso a água ad libitum), foram
divididos em grupos (n = 6) e tratados com solução salina 0,9 % (10 mL/kg),
atropina (2 mg/kg), EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) ou F. AcOEt (125, 250 ou
500 mg/kg). Após 30 minutos, foi administrado 0,5 mL por animal de uma
solução de carvão ativado (5 %) em goma arábica (5 %) e os animais
eutanasiados por deslocamento cervical, 30 minutos após a administração do
carvão ativado. A cavidade abdominal foi aberta e o intestino delgado
removido. Com auxílio de uma régua, foi determinado o comprimento total do
intestino delgado de cada animal (distância entre o piloro até a válvula
ileocecal), e a distância percorrida pelo marcador. Foi calculada a porcentagem
do percurso do carvão em função do comprimento total do intestino.
Os resultados foram expressos em porcentagem de inibição da distância
percorrida pelo marcador em relação ao comprimento total do intestino delgado
do grupo experimental em relação ao grupo, controle de acordo com a
equação:
(Distância do grupo controle – Distância grupo experimental)
Distância do grupo controle
3.11.3 Trânsito intestinal induzido por óleo de rícino (STICKNEY;
NORTHUP, 1959)
Ratos, em jejum de 12 horas (com acesso a água ad libitum), foram
separados em grupos (n = 6) e tratados com solução salina 0,9 % (10 mL/kg),
atropina (2 mg/kg), EEOH (500 mg/kg) ou F. AcOEt (250 mg/kg), após 30
minutos foi administrado 0,7 mL de óleo de rícino por animal e após 30 minutos
X 100 % de inibição =
49
foi administrado 0,5 mL de solução de carvão ativado (5 %) em goma arábica
(5 %). Após 30 minutos os animais foram eutanasiados por deslocamento
cervical, a cavidade abdominal aberta e o intestino delgado removido. Com
auxílio de uma régua, foi determinado o comprimento total do intestino delgado
de cada animal (distância entre o piloro até a válvula ileocecal), e a distância
percorrida pelo marcador. Os resultados foram expressos em porcentagem da
distância percorrida pelo marcador em relação ao comprimento total do
intestino delgado.
3.12 Avaliação da atividade antiespasmódica de Maytenus rigida
3.12.1 Efeito do EEOH e da F. AcOEt sobre as contrações tônicas
induzidas por KCl ou por carbacol em íleo isolado de cobaia (DANIEL;
KWANC; JANSSEN, 2001)
As cobaias foram mantidas em jejum por um período de 18 a 24 horas,
com acesso à água ad libitum antes do início dos experimentos. Após este
período foram eutanasiadas por deslocamento cervical seguida de secção dos
vasos cervicais. O abdômen foi aberto e um segmento do íleo de
aproximadamente 15 cm de comprimento foi retirado e colocado em uma placa
de Petri contendo solução nutritiva de Krebs modificado a 37 °C sob aeração
com carbogênio. Após cuidadosa dissecação, o segmento do íleo foi
seccionado em fragmentos de 2 a 3 cm de comprimento, suspensos
individualmente em cubas de vidro e deixados em repouso por 30 minutos,
tempo necessário para perfeita estabilização da preparação, durante este
período a solução nutritiva foi trocada a cada 15 minutos.
Após o período de estabilização, duas contrações submáximas similares
foram obtidas com KCl (40 mM) ou carbacol (10-6 M). Durante a fase tônica
sustentada da segunda resposta, tanto o EEOH como a F. AcOEt foram
aplicados de maneira cumulativa.
O relaxamento foi expresso como a percentagem reversa da contração
induzida por KCl ou carbacol. Os valores de concentração do EEOH ou da F.
AcOEt que produz 50 % de seu efeito máximo (CE50) foram obtidos por regressão
não-linear a partir das curvas concentrações-resposta obtidas
50
3.13 Análise estatística
Para os modelos que investigam a atividade antiulcerogênica,
antidiarréica e motilidade intestinal, os resultados estão expressos como a
média ± desvio padrão (d.p.) e foram submetidos à análise de variância de uma
via (ANOVA), seguido do pós-teste de Dunnett (para comparação dos grupos
tratados com o grupo controle negativo) ou teste de Tukey-Kramer (para
comparação entre os grupos tratados e escolha da melhor dose do EEOH e F.
AcOEt). O nível de significância considerado foi 95 % (P< 0,05). O programa
estatístico utilizado foi o GraphPad Prism versão 3,02 (GraphPad Software Inc.,
San Diego CA, U.S.A.).
Os resultados obtidos na avaliação da atividade antiespasmódica estão
expressos como a média ± e.p.m e foram analisados estatisticamente
empregando-se o teste “t” de Student ou análise de variância (ANOVA) “one-
way” seguido do teste de Bonferroni, em que os valores de p < 0,05 foram
considerados significantes. Os valores de CE50 (NEUBIG et al., 2003) foram
calculados por regressão não-linear e foram analisados pelo programa
GraphPad Prism versão 3,02 (GraphPad Software Inc., San Diego CA, U.S.A.).
51
4 RESULTADOS
4.1 Avaliação da atividade toxicológica de Maytenus rigida
4.1.1 Triagem farmacológica comportamental e determinação da DL50
Observando os parâmetros citados por Almeida e colaboradores (1999),
os animais não apresentaram alterações de comportamento após a
administração do EEOH obtido da entrecasca do caule de M. rigida, nas doses
utilizadas até 5000 v.o. e até 2000 mg/kg i.p., durante o tempo de observação
preconizado. Esses resultados indicam que o EEOH apresentou baixa
toxicidade nas condições avaliadas.
Foi observado que não houve mortes de animais durante as 72 horas
após a administração do EEOH, não sendo possível a determinação da DL50.
4.2 Avaliação da atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida
Souza Brito (1994) preconiza que estudos farmacológicos envolvendo
extrato vegetal ou seus derivados deverá ser avaliado até a dose máxima de
1000 mg/kg. Diante disso, as doses do EEOH (250, 500 e 750 mg/kg) e F.
AcOEt (125, 250 e 500 mg/kg) obtido de M. rigida foram definidas em função
de sua capacidade de inibirem as lesões gástricas.
4.2.1 Lesões gástricas induzidas por HCl/etanol
No modelo de indução por HCl/etanol por via oral em camundongos os
tratamentos com EEOH nas doses 250, 500 ou 750 mg/kg ou lansoprazol (30
mg/kg) v.o. inibiram significantemente as lesões ulcerativas em 44, 70, 78, 74,
% respectivamente, quando comparado ao controle negativo (Tabela 2).
52
Tabela 2- Efeito da administração oral do EEOH obtido de M. rigida ou
lansoprazol nas lesões gástricas induzidas por HCl/etanol em camundongos
Tratamento Dose
(mg/kg)
ILU
(Média ± d.p)
Inibição
(%)
Solução salina 0,9 % - 27 ± 2,4 -
Lansoprazol 30 7 ± 1,2** 74
EEOH 125 24± 1,9 11
250 15 ± 2,9** 44
500 8 ± 1,5** 70
750 6 ± 1,4** 78
ILU= Índice de Lesão Ulcerativa ANOVA F(5,30) = 120; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, **P<0,01.
4.2.2- Lesões gástricas induzidas por etanol
Os resultados obtidos para a espécie M. rigida nesse modelo de indução
pela administração de etanol (v.o) em ratos demonstraram que o EEOH (250,
500 ou 750 mg/kg) ou o lansoprazol (30 mg/kg) inibiu significantemente as
lesões ulcerativas em 52, 87, 95 e 65 % respectivamente, quando comparado
ao controle negativo (Tabela 3a).
Os resultados obtidos no modelo de indução de úlcera induzida por
etanol, para avaliar a F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg) ou o lansoprazol (30
mg/kg), demonstraram que ocorreu uma inibição significativa das lesões
ulcerativas em 47, 81, 87 e 58 % respectivamente, quando comparado ao
controle negativo (Tabela 3b).
53
Tabela 3- Efeito da administração oral do EEOH, F. AcOEt de M. rigida ou
lansoprazol nas lesões gástricas induzidas por etanol em ratos
Tratamentos Dose (mg/kg)
ILU (Média ± d.p)
Inibição (%)
(a) Solução salina 0,9 % - 130 ± 7,9 -
Lansoprazol 30 45 ± 7,3** 65
EEOH
125
250
500
750
119 ± 11,3
63 ± 5,9**
17 ± 2,7**
7 ± 2,6**
8
52
87
95
(b) Solução salina 0,9 %
Lansoprazol
F. AcOEt
-
30
125
137 ± 6,9
57 ± 7,1**
73 ± 8,3**
-
58
47
250
500
26 ± 4,0**
18 ± 2,7**
81
87
ILU= Índice de Lesão Ulcerativa ANOVA F(5,30) = 387 para o EEOH e F(4,25) = 354 para a F. AcOEt; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo *P<0,05 e **P<0,01.
Portanto, o EEOH e a F. AcOEt obtidos de M. rigida apresentaram
significativa atividade antiulcerogênica frente aos danos da mucosa gástrica
provocados por HCl/etanol e etanol em camundongos e ratos respectivamente.
4.2.3 Lesões gástricas induzidas por estresse (imobilização e frio)
No modelo de indução de úlcera gástrica por estresse (imobilização e
frio) em camundongos, os resultados da administração oral do EEOH (250, 500
ou 750 mg/kg) ou cimetidina (100 mg/kg) mostram que houve inibição de 65,
54
86, 89 e 69 %, respectivamente, quando comparado ao controle negativo
(Tabela 4a).
Os resultados obtidos na avaliação da F. AcOEt (125, 250 ou 500 mg/kg)
ou cimetidina (100 mg/kg), no modelo de úlcera induzida por estresse,
demonstraram que ocorreu uma inibição significativa das lesões ulcerativas em
60, 80, 87 e 62 % respectivamente, quando comparado ao controle negativo
(Tabela 4b).
De acordo com estes dados, o EEOH e a F. AcOEt obtidos de M. rigida
apresentaram significativa atividade antiulcerogênica frente aos danos
gástricos agudos provocados pelo estresse por imobilização e frio em
camundongos.
Tabela 4- Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M. rigida ou
cimetidina nas lesões gástricas induzidas por estresse em camundongos
Tratamento Dose
(mg/kg)
ILU
(Média ± d.p)
Inibição
(%)
(a) Solução salina 0,9 % - 161 ± 10,6 -
Cimetidina 100 50 ± 5,4** 69
EEOH 250 57 ± 5,0** 65
500 22 ± 2,9** 86
750 18 ± 2,8** 89
(b) Solução salina 0,9 %
Cimetidina
F. AcOEt
-
100
125
60 ± 2,7
23 ± 2,9**
24 ± 3,3**
-
62
60
250
500
12 ± 2,8**
8 ± 2,8**
80
87
ILU= Índice de Lesão Ulcerativa ANOVA F(4,25) = 552 para o EEOH e F(4,25) = 298 para a F. AcOEt; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, **P<0,01.
55
4.2.4 Lesões gástricas induzidas por antiinflamatório não esteroidal
(piroxicam)
No modelo de indução de úlcera gástrica por antiinflamatório não
esteroidal (piroxicam) em camundongos, os resultados da administração oral
do EEOH (250, 500 ou 750 mg/kg) ou de cimetidina (100 mg/kg) mostram que
houve inibição de 55, 81, 94 e 60 %, respectivamente, quando comparado ao
grupo controle negativo (Tabela 5a).
Semelhante experimento foi utlilizado para avaliar os efeitos da
administração da F. AcOEt (125, 250 e 500 mg/kg) ou de cimetidina (100
mg/kg) em camundongos submetidos aos danos gástricos provocados pelo
piroxicam. Os resultados obtidos demonstraram que ocorreu uma inibição
significativa das lesões ulcerativas em 41, 69, 80 e 64 % respectivamente,
quando comparado ao controle negativo (Tabela 5b).
Estes resultados mostram que o EEOH e F. AcOEt obtidos de M. rigida
apresentaram significante atividade antiulcerogênica, frente a formação aguda
das lesões na mucosa gástrica induzidas pelo antiinflamatório não esteroidal
piroxicam.
56
Tabela 5- Efeito da administração oral do EEOH e F. AcOEt de M. rigida ou
cimetidina nas lesões gástricas induzidas por piroxicam em camundongos
Tratamento Dose
(mg/kg)
ILU
(Média ± d.p)
Inibição
(%)
(a) Solução salina 0,9 % - 47 ± 4,7 -
Cimetidina 100 19 ± 2,4** 60
EEOH 125 21 ± 2,9** 55
250 9 ± 2,3** 81
500 3 ± 1,2** 94
(b) Solução salina 0,9 %
Lansoprazol
F. AcOEt
-
125
125
39 ± 1,9
14 ± 2,2**
23 ± 2,9**
-
64
41
250
500
12 ± 1,7**
8 ± 2,1**
69
80
ILU= Índice de Lesão Ulcerativa ANOVA F(4,25) = 199 para o EEOH e F(4,25) =180 para a F. AcOEt; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, **P<0,01.
4.2.5 Avaliação dos parâmetros bioquímicos do suco gástrico no modelo
de ligadura do piloro
No modelo de ligadura do piloro, foram avaliados parâmetros
bioquímicos do conteúdo estomacal como volume gástrico, pH e acidez total,
após a administração intraduodenal da solução salina 0,9 %, cimetidina (100
mg/kg), EEOH (500 mg/kg) ou F. AcOEt (250 mg/kg) em ratos.
Os dados obtidos mostraram que o EEOH e a F. AcOEt não
promoveram alterações nos parâmetros bioquímicos observados, diferente da
57
cimetidina que elevou o pH, o volume gástrico e diminuiu a concentração ácida
total (Tabela 6).
Tabela 6- Efeito da administração intraduodenal do EEOH e F. AcOEt de M.
rigida ou cimetidina sobre os parâmetros bioquímicos do suco gástrico no
ANOVA: F(3,20) = 71 para pH; F (3,20) = 192 para concentração de H+; F(3,20) = 39 para volume gástrico (P<0,05), seguido do teste de Dunnett comparado ao controle negativo **P<0,01.
4.2.6 Lesão gástrica induzida por ácido acético 30 %
No modelo de indução de úlcera gástrica por ácido acético 30 %, em
ratos foi realizado o tratamento durante 14 dias consecutivos com solução
salina 0,9 %, cimetidina (100 mg/kg) ou F. AcOEt obtida da M. rigida (250
mg/kg). Os resultados demonstraram que nos animais tratados com a F. AcOEt
(250 mg/kg) ou cimetidina (100 mg/kg) ocorreu uma redução na área da lesão
gástrica em 52 % e 50 %, respectivamente, quando comparado ao grupo
controle negativo (Gráfico 1). O grupo Sham, com animais em que não foram
induzido a úlcera, como esperado apresentou 0 % de lesão, sendo considerado
como controle normal.
58
0
25
50
75
Sham
Cimetidina 100 mg/kg
Fase AcOEt 250 mg/kg
Solução salina 0,9 %
50 % **
52 % **
**
Tratamentos
Áre
a de
Les
ão U
lcer
ativ
a
(AL
U)
mm
2
Gráfico 1- Efeito da administração oral da F. AcOEt de M. rigida ou cimetidina,
durante 14 dias, no modelo de indução de úlcera gástrica por ácido acético 30
% em ratos.
ANOVA F(3,20) = 26; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle, **P<0,01.
Partindo do mesmo modelo de indução de úlcera pelo ácido acético, foi
avaliado também o efeito da F. AcOEt obtida de M. rigida sobre o peso corporal
e sobre os órgãos vitais como coração, fígado, baço e rins dos ratos. Os dados
obtidos mostraram que não houve alteração significativa no peso dos órgãos e
no peso corpóreo (Tabela 7).
59
Tabela 7- Efeito da administração oral da F. AcOEt de M. rigida ou cimetidina
por 14 dias consecutivos sobre o peso corporal e dos orgãos de ratos com
úlcera induzida por ácido acético
Tratamentos
Solução salina
0,9 % Sham
Cimetidina
(100 mg/kg)
F. AcOEt
(250 mg/kg)
Peso corporal
coração
fígado
baço
rins
239,7 ± 14,28
0,45 ± 0,08
3,73 ± 0,26
0,25 ± 0,04
0,79 ± 0,01
278,4 ± 10,41**
0,45 ± 0,02
3,79 ± 0,26
0,24 ± 0,02
0,77 ± 0,01
225,7 ± 18,05
0,45 ± 0,02
3,87 ± 0,25
0,24 ± 0,03
0,77 ± 0,06
224,7 ± 20,60
0,43 ± 0,03
3,69 ± 0,19
0,28 ± 0,05
0,82 ± 0,08
ANOVA F(3,20)= 17 para peso corporal, F(3,20) = 0,78 para coração, F(3,20) = 0,71 para fígado, F(3,20) = 3 para baço e F(3,20) = 1 para rins, **P<0,01, seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle (solução salina 0,9 %).
4.3 Avaliação dos mecanismos de ação citoprotetores envolvidos na
atividade antiulcerogênica de Maytenus rigida
4.3.1 Determinação do muco aderido à parede gástrica
Para verificar o envolvimento do muco na citoproteção produzida por
carbenoxolona 200 mg/kg e a F. AcOEt 250 mg/kg foi determinado o muco
aderido à mucosa gástrica, pela determinação da concentração de acian blue
em ratos após ligadura do piloro. Os resultados demonstram que a
carbenoxolona 200 mg/kg e a F. AcOEt 250 mg/kg, administrados oralmente
aumentaram a produção de muco de forma significativa, quando comparados
com o grupo controle negativo (solução salina 0,9 %) (Gráfico 2).
60
0
10
20
30
40
50
60solução salina 0,9 %
carbenoxolona 100 mg/kg
Fase AcOEt 250 mg/kg
**
*
Tratamentos
Qu
anti
dad
e d
e al
cian
blu
e ad
erid
o a
par
ede
gás
tica
[mg
/pes
o d
a p
orç
ão g
lan
du
lar
(g)]
Gráfico 2- Efeito do tratamento agudo com F. AcOEt de M. rigida ou
carbenoxolona no conteúdo de muco aderido à mucosa gástrica em ratos.
ANOVA F(2, 20)= 14; (P<0,05), seguido do teste de Dunnett, comparado ao controle negativo, *P<0,05 e **P<0,01.
4.3.2 Determinação de prostaglandina E2 (PGE2)
Com a finalidade de avaliar o envolvimento da PGE2 na citoproteção
promovida pela F. AcOEt, foi verificado se a amostra vegetal era capaz de
modular a produção desta prostaglandina. Os dados mostram que a F. AcOEt
(250 mg/kg) manteve os níveis de PGE2 semelhante ao do grupo controle
negativo (solução salina 0,9 %). No entanto, quando a fase foi administrada no
grupo pré-tratado com indometacina (30 mg/kg) (um inibidor não seletivo da
síntese de prostaglandina), ocorreu uma redução significativa na produção de
PGE2 quando comparado ao grupo Sham, semelhante ao grupo solução salina
0,9 % pré-tratado com indometacina (Gráfico 3).
Estes dados indicam a não participação da PGE2 na citoproteção
promovida por M. rigida.
61
0
1
2
3Solução salina 0,9 %
Solução salina 0,9 % + Indometacina
Fase 250 mg/kg
Fase 250 mg/kg + Indometacina
Sham
+ ++
*****
Tratamentos
[PG
E2]
ng
/mg
pro
tein
a
Gráfico 3: Efeito do tratamento com a F. AcOEt de M. rigida nos níveis de
PGE2 em ratos.
ANOVA, F(4,16)= 10, (P<0,05), seguido do teste de Tuckey, comparado ao Sham, **P<0,01, ***P<0,001, comparado ao seu controle, +P<0,05, ++P<0,01.
4.3.3 – Avaliação da participação do óxido nítrico (NO)
Na avaliação do envolvimento do NO no efeito gastroprotetor do extrato e
da F. AcOEt, os ratos foram pré-tratados com L-NAME, um inibidor da sintase
do óxido nítrico. Como esperado, foi observado um aumento nas lesões
ulcerativas induzidas pelo etanol nos ratos pré-tratados com L-NAME (Figura
8).
Os dados obtidos no modelo que investiga a participação de NO na
proteção induzida por EEOH 500 mg/kg e F. AcOEt 250 mg/kg, mostram que
nos ratos dos grupos previamente tratados com solução salina 0,9 % e depois
tratados com EEOH, F. AcOEt ou carbenoxolona, ocorreu uma inibição
significativa do ILU em 48, 49 e 58 % respectivamente. Entretanto, quando
foram avaliados os grupos pré-tratados com o L-NAME (bloqueador da sintase
de oxido nítrico) e posteriormente tratados com EEOH, F. AcOEt ou
carbenoxolona foi observado uma exacerbação do ILU com inibição de apenas
33, 35 e 40 % respectivamente, quando comparados ao seu controle negativo.
(Gráfico 4).
62
Figura 8- Estômagos de ratos tratados com solução salina 0,9 %/solução
Com objetivo de investigar se o EEOH e a sua F. AcOEt estariam
exercendo efeito antiespasmódico, avaliou-se seus efeitos sobre o íleo de
cobaia pré-contraido com KCl ou com carbacol. A evidência de que tanto o
extrato como a F. AcOEt induziram relaxamento do íleo pré-contraído
comprovam esta hipótese. O fato de não haver diferença significante entre a
potência relaxante do EEOH e da F. AcOEt frente aos agentes contráteis
testados sugere que esses podem estar agindo por um mecanismo de ação
comum à via de sinalização dos agentes contráteis testados, e não em nível de
receptor na membrana plasmática.
Uma vez que o íleo é um órgão totalmente dependente de variação do
potencial de membrana (NOUAILHETAS et al., 1985) e como o componente
tônico da contração induzida por agonistas de acoplamento misto (fármaco e
eletromecânico) como carbacol (UNNO; KOMORI; OHASHI, 1995; BOLTON et
al., 1981) ou por um agente despolarizante (KCl) (acoplamento eletromecânico)
é mantido quase que exclusivamente por influxo de Ca2+ através dos canais de
Ca2+ dependentes de voltagem (CaV) (BOLTON, 1979; REMBOLD, 1996;
BOLTON; 2006), sugere-se que o EEOH e a F. AcOEt podem estar agindo por
bloqueio do influxo de Ca2+ através dos CaV.
Os resultados apresentados nesse trabalho ora desenvolvido indicam
uma ação citoprotetora do EEOH e da F. AcOEt obtidos de M. rigida
dependente da liberação de muco sem participação efetiva das PGs, porém
dependente da via do NO, além da participação de grupamentos sulfidrílicos
não-protéicos, e também atividade antidiarréica e antimotilidade que podem
ajudar na ação antiulcerogênica. Provavelmente essas atividades, estão
relacionadas, ao menos em parte, à presença dos flavonóides presentes no
EEOH e na F. AcOEt.
Neste contexto, os resultados obtidos neste estudo nos fornecem base
farmacológica para utilização de M. rigida, validando seu uso popular e
indicando seu potencial terapêutico como antiulcerogênico, antidiarréico e
antiespasmódico.
92
6 CONCLUSÕES
� O extrato etanólico (EEOH) obtido da entrecasca do caule de
Maytenus rigida Mart. (Celastracea) apresentou baixa toxicidade (in
vivo) nas condições avaliadas por não alterar o comportamento e não
causar morte nos animais;
� O extrato EEOH e a fase acetato de etila (AcOEt) obtidos da M.
rigida, nas doses utilizadas apresentaram atividade antiulcerogênica
frente aos agentes indutores: etanol, antiinflamatório não-esteroidal
(piroxicam) e estresse (imobilização e frio);
� A atividade antiulcerogênica está relacionada com aumento na
produção de muco gástrico, com participação de NO e grupamentos
sulfidrila;
� O EEOH e a F. AcOEt não alteraram os parâmetros bioquímicos do
suco gástrico: volume gástrico, pH e concentração de H+, sugerindo
a não absorção sistêmica;
� A F. AcOEt induziu o processo de cicatrização da úlcera gástrica por
ácido acético após tratamento crônico;
� O EEOH e a F. AcOEt apresentaram atividade antidiarréica em
camundongos;
� O EEOH e a F. AcOEt inibiram a motilidade intestinal normal e
induzido por óleo de rícino em rato;
� O EEOH e a F. AcOEt apresentaram efeito antiespasmódico em íleo
isolado de cobaia.
93
7 PERSPECTIVAS
De acordo com os resultados obtidos da investigação da atividade
antiulcerogênica e antidiarréica do EEOH e da F. AcOEt obtidos da entrecasca
do caule de Maytenus rigida Mart., propõem-se as seguintes perspectivas para
complementar esse estudo:
� Determinar os níveis séricos de somatostatina e gastrina;
� Determinar os parâmetros bioquímicos do suco gástrico quando avaliada
a via oral de administração;
� Avaliar os fatores envolvidos no processo de cicatrização de lesões
ulcerativas no modelo crônico de úlcera gástrica;
� Avaliar os mecanismos de ação antioxidante de M. rigida;
� Determinar o envolvimento da bomba H+, K+ no mecanismo de ação de
M. rigida;
� Avaliar as via envolvidas na alteração na motilidade gastrointestinal
promovida pelo extrato e pela F. AcOEt;
� Avaliar a participação de canais iônicos no efeito antiespasmódico de M.
rigida.
� Identificar os princípios ativos presentes nas frações ativas.
94
REFERÊNCIAS
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110
APÊNDICES
Apêndice 1
111
112
113
114
115
116
117
Apêndice 2
Carta de submissão do artigo "Evaluation of the antiulcerogenic activity obtained from the extract ethanolic of Maytenus rigida Mart. in rodents" Dear Dr.Batista, Your submission entitled "Evaluation of the antiulcerogenic activity obtained from the extract ethanolic of Maytenus rigida Mart. in rodents" has been received by journal Journal of Ethnopharmacology You will be able to check on the progress of your paper by logging on to Elsevier Editorial as an author. The URL is http://ees.elsevier.com/jep/. Your manuscript will be given a reference number once an Editor has been assigned. Thank you for submitting your work to this journal. Kind regards, Journal of Ethnopharmacology
118
ANEXOS
Anexo 1- Protocolo experimental para triagem comportamental Planta selecionada Doses Data Via de administração Animais Responsável técnico Grupos
Quantificação dos efeitos (0) sem efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito presente,
(++) efeito intenso
Atividade farmacológica
Até 30’ 1 h 2 h 3 h 4 h 1 – SNC A- Estimulantes Hiperatividade Irritabilidade Agressividade Tremores Convulsões Piloereção Movimento intenso das vibrissas Outros B- Depressora Hipnose Ptose Sedação Anestesia Reflexo do endireitamento Catatonia Analgesia Resposta ao toque diminuído Perda do reflexo corneal Perda do reflexo auricular C- Outros comportamentos Ambulação Groming Rearing Escalar Vocalizar Sacudir a cabeça Contorções abdominais Abdução das patas do trem posterior Estereotipia 2 – SN AUTÔNOMO Diarréia Constipação Defecação aumentada Respiração forçada Lacrimejamento Micção Salivação Cianose Tono muscular Força para agarrar 3 – MORTE
Fonte: ALMEIDA et al., 1999.
119
Anexo 2- Certidão de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal do
LTF/UFPB
120
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