VALUTAZIONE DELLA PERMEABILITA INTESTINALE MEDIANTE TEST DEL DOPPIO ZUCCHERO VALUTATO SU SIERO CON METODICA HPLC Dott.ssa Katouzian Forough 26 Novembre.

VALUTAZIONE DELLA VALUTAZIONE DELLA PERMEABILITA’ INTESTINALE PERMEABILITA’ INTESTINALE MEDIANTE TEST DEL DOPPIO MEDIANTE TEST DEL DOPPIO

ZUCCHERO VALUTATO SU ZUCCHERO VALUTATO SU SIERO CON METODICA HPLCSIERO CON METODICA HPLC

Dott.ssa Katouzian ForoughDott.ssa Katouzian Forough

26 Novembre 200426 Novembre 2004

ATTIVITA’ SVOLTAATTIVITA’ SVOLTA Determinazione della minima dose

efficace, sulla permeabilità epiteliale di nuovi modulatori della via paracellulare

Studio della cinetica d’azione sulla permeabilità intestinale, di molecole (es. delta-G, esapeptide) in grado di modulare la via paracellulare

Verificare la cinetica del transito di macromolecole attraverso la mucosa intestinale resa permeabile dalle molecole sopra descritte.

IntroduzioneIntroduzione La permeabilità intestinale viene solitamente La permeabilità intestinale viene solitamente

studiata usando il test di assorbimento di 2 studiata usando il test di assorbimento di 2 zuccheri lattulosio/mannitolo o zuccheri lattulosio/mannitolo o lattulosio/ramnosio. Le urine (raccolta di 5 ore) lattulosio/ramnosio. Le urine (raccolta di 5 ore) sono il liquido biologico su cui dosare gli sono il liquido biologico su cui dosare gli zuccheri.zuccheri.

Sono zuccheri di origine sintetica, non sono Sono zuccheri di origine sintetica, non sono presenti nella dieta e non sono metabolizzati presenti nella dieta e non sono metabolizzati dall’organismo.dall’organismo.

Il lattulosio è un disaccaride di PM 342.3 viene Il lattulosio è un disaccaride di PM 342.3 viene assorbito per via paracellulare mentre il assorbito per via paracellulare mentre il ramnosio è un monosaccaride di PM 182.17 e ramnosio è un monosaccaride di PM 182.17 e viene assorbito per via transcellulareviene assorbito per via transcellulare

Epitelio intestinale in condizione normale è Epitelio intestinale in condizione normale è impermeabile al lattulosio per la sua impermeabile al lattulosio per la sua dimensione mentre è permeabile al dimensione mentre è permeabile al ramnosioramnosio

Assorbimento dei due zuccheri risulta Assorbimento dei due zuccheri risulta alterato se intervengono infezioni alterato se intervengono infezioni batteriche o virali ed in particolari batteriche o virali ed in particolari situazioni patologiche (malattia celiaca, situazioni patologiche (malattia celiaca, morbo di crohn)morbo di crohn)

Il test si basa sulla somministrazione per Il test si basa sulla somministrazione per via orale dei due zuccheri e sul successivo via orale dei due zuccheri e sul successivo loro dosaggio sulle urine mediante HPLCloro dosaggio sulle urine mediante HPLC

SCOPO DELLA RICERCASCOPO DELLA RICERCA Semplificare lo studio della permeabilità Semplificare lo studio della permeabilità

intestinale mediante test sierologico su goccia intestinale mediante test sierologico su goccia di sangue del rapporto lattulosio/ramnosio.di sangue del rapporto lattulosio/ramnosio.

Valutare l’azione di sostanze capaci di Valutare l’azione di sostanze capaci di modulare in maniera reversibile la modulare in maniera reversibile la permeabilità della via paracellulare con permeabilità della via paracellulare con conseguente variazione nell’assorbimento dei conseguente variazione nell’assorbimento dei due zuccheri.due zuccheri.

Dosare questi zuccheri, dopo Dosare questi zuccheri, dopo somministrazione per via orale, su micro somministrazione per via orale, su micro campioni di siero (50campioni di siero (50µl)µl) e confronto con la e confronto con la metodica basata sulla raccolta urine.metodica basata sulla raccolta urine.

Per il dosaggio utilizzeremo sempre la Per il dosaggio utilizzeremo sempre la metodica HPLC.metodica HPLC.

Caratteristiche strutturali della molecola delta-G utilizzata nel nostro modello sperimentale di permeabilità epiteliale

Determinazione della Determinazione della minima dose efficace di minima dose efficace di ΔΔGG

Preparazione della soluzione dei zuccheri con Preparazione della soluzione dei zuccheri con diverse concentrazioni di diverse concentrazioni di ΔΔGG

120mg lact + 40mg Rh + 250n120mg lact + 40mg Rh + 250ng g ΔΔGG in 200µl in 200µl H2OH2O

120mg lact + 40mg Rh + 500120mg lact + 40mg Rh + 500µg µg ΔΔGG in 200µl in 200µl H2OH2O

120mg lact + 40mg Rh + 1120mg lact + 40mg Rh + 1µg µg ΔΔGG in 200µl H2O in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 5120mg lact + 40mg Rh + 5µg µg ΔΔGG in 200µl H2O in 200µl H2O 120mg lact + 40mg Rh + 10120mg lact + 40mg Rh + 10µg µg ΔΔGG in 200µl in 200µl

H2OH2O

Prova su topiProva su topi Prelievo di sangue (circa 100Prelievo di sangue (circa 100µl)µl) a tempo 0 a tempo 0 Somministrazione della soluzione di zuccheri Somministrazione della soluzione di zuccheri

senza e con + senza e con + ΔΔGG Prelievo successivo dopo 1h, Prelievo successivo dopo 1h, Sierare il campione di sangueSierare il campione di sangue Deproteinizzare il sieroDeproteinizzare il siero Marcare il siero con FMOC-IdrazinaMarcare il siero con FMOC-Idrazina Dosare gli zuccheri con HPLCDosare gli zuccheri con HPLC

Confronto goccia di sangue Confronto goccia di sangue con raccolta urine.con raccolta urine.

raccolta urine a tempo zeroraccolta urine a tempo zero somministrazione di soluzione degli somministrazione di soluzione degli

zuccheri con Delta-Gzuccheri con Delta-G raccolta a 5h delle urine (utilizzando raccolta a 5h delle urine (utilizzando

gabbia metabolica)gabbia metabolica) filtrare il campione filtrare il campione analisi con HPLCanalisi con HPLC

Condizioni per il dosaggio degli Condizioni per il dosaggio degli zuccheri con HPLCzuccheri con HPLC

Eluenti : A) ACN 25% - HEluenti : A) ACN 25% - H22O 75%O 75%

B) ACN 80% - HB) ACN 80% - H22O 20%O 20%

Colonna : C18, lungh.10cm, Ø3µm,Colonna : C18, lungh.10cm, Ø3µm,Vol. camp : 5µlVol. camp : 5µlflusso : 1ml/minflusso : 1ml/minTemp : ambienteTemp : ambienteRilevatore : spettrofotometro (Rilevatore : spettrofotometro (λλ 270 nm) 270 nm)

Cromatogramma di Cromatogramma di campione di siero in campione di siero in

assenza di assenza di ΔΔGG

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

lac

rh

Cromatogramma di Cromatogramma di campione di siero in campione di siero in

presenza di presenza di ΔΔGG

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

lac

rh

Concentrazione di lattulosio Concentrazione di lattulosio e ramnosio nel siero dopo e ramnosio nel siero dopo somministrazione degli somministrazione degli zuccheri senza Delta-Gzuccheri senza Delta-G

animalianimali lattulosio lattulosio ramnosio ramnosio L/R L/R

topi 0.018topi 0.018 0.33 0.33 0.0520.052

conigli siero 0.0033conigli siero 0.0033 0.137 0.137 0.0260.026

conigli urine 0.0067 0.284 conigli urine 0.0067 0.284 0.0230.023

Concentrazione di lattulosio Concentrazione di lattulosio e ramnosio nel siero dopo e ramnosio nel siero dopo somministrazione degli somministrazione degli

zuccheri con Delta-Gzuccheri con Delta-Ganimalianimali lattulosio lattulosio ramnosio ramnosio L/R L/R

topitopi 0.19 0.19 0.36 0.36 0.53 0.53

conigli sieroconigli siero 0.033 0.033 0.157 0.157 0.220.22

conigli urine 0.074 0.296 conigli urine 0.074 0.296 0.250.25

STUDIO DELLA CINETICASTUDIO DELLA CINETICA

Prelievo di sangue a tempo zeroPrelievo di sangue a tempo zero Somnistrazione della soluzione dei Somnistrazione della soluzione dei

zuccheri contenente 10zuccheri contenente 10µg di µg di ΔΔGG Prelievo successivo dopo 1h, 6hPrelievo successivo dopo 1h, 6h Somnistrazione della soluzione dei Somnistrazione della soluzione dei

zuccheri senza zuccheri senza ΔΔGG Prelivo successivo dopo 7h, 9h, 11hPrelivo successivo dopo 7h, 9h, 11h

DIAGRAMMA DELLA DIAGRAMMA DELLA CINETICACINETICA

cinetica di Delta G

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 30 60 120 180 240 360 420 540 660

tempo

con

c.L

act

siero senza ΔG

siero con ΔG

RISULTATIRISULTATI

Aumento della concentrazione di Aumento della concentrazione di lattulosio in presenza di lattulosio in presenza di ΔΔGG quindi: quindi:

Evidente attività biologica da parte Evidente attività biologica da parte di di ΔΔGG sulle giunzioni serrate sulle giunzioni serrate

La sua attività biologica La sua attività biologica permane permane 6h 6h dalla sua somministrazione per osdalla sua somministrazione per os

OBIETTIVI FUTURIOBIETTIVI FUTURI

Continuare lo studio della cinetica Continuare lo studio della cinetica per un tempo prolungato (almeno per un tempo prolungato (almeno fino 24 ore)fino 24 ore)

Utilizzare queste molecole per Utilizzare queste molecole per permettere l’assorbimento di farmaci permettere l’assorbimento di farmaci e peptidi attraverso la via e peptidi attraverso la via paracellulareparacellulare