Valomikroskopian alkeet

Histologisten tekniikoiden alkeet 1

Valomikroskopian alkeetMikael Niku

ELTDK / PELL / Anatomia, 2001


Mikroskopiaa jo 1600-luvulta

Kuvat: Molecular Expression Microscopy Primer (http://micro.magnet.fsu.edu/primer/)


Valomikroskoopin osat

Kurssilla käytettävä Olympus CH2-mikroskooppi


Valonlähde• Yleensä

volframihalogeenilamppu

• Kirkkaus säädettävissä jännitettä muuttamalla– Huomaa, että valon väri

muuttuu samalla! Tämä on muistettava varsinkin valokuvattaessa.

• Lamppuun ei saa koskea paljain sormin!


Kenttähimmennin• Säätelee kondensoriin

pääsevän valopylvään leveyttä

• Vähentää heijastuksia ja sirontaa

• CH2:ssa säädettävä himmennin lisä-varusteena (kiinnitys nuolen osoittamaan kohtaan)


Kondensori• Keskittää valon

tasaisesti näytteeseen

• Säädöt vaikuttavat ratkaisevasti kuvan laatuun: korkeus ja apertuurihimmentimen asento


Kondensorin apertuurihimmentimen vaikutus

Himmen-timen asento

Erotus-kyky

Kontrasti

Fokus-syvyys

Valoisuus

AUKI hyvä huono lyhyt kirkas

KIINNI huono hyvä pitkä tumma


Ristisiirtopöytä• Tähän pannaan

näyte• Liikuttelu tarkasti X-

ja Y-suunnassa• Asteikkojen avulla

voidaan merkitä muistiin kiinnostavan kohteen sijainti


Objektiivit• Valomikroskoopin

tärkein (ja kallein!) osa• Mitä enemmän erilaisten

taittovirheiden korjausta, sitä parempi kuva (ja kalliimpi hinta)

• Akromaattiset halvimpia ja tavallisimpia, apokromaattiset kalleimpia; tasokorjatuissa (plan) kuva kaartuu vähemmän

• Kiinnitys revolveriin kierteellä


Objektiivien merkinnät


Objektiivien merkinnät: numeerinen apertuuri

• Numeerinen apertuuri (N.A.): mitä suurempi, sitä kirkkaamman kuvan objektiivi tuottaa ja sitä pienemmät yksityiskohdat erottuvat – toisaalta syvyysterävyys pienenee

• Ilman immersioaineita käytettävissä objektiiveissa N.A. korkeintaan 0,95; öljyimmersiolla jopa 1,4. Siksi yli 40X suurentavat objektiivit yleensä öljy-immersio-objektiiveja.


Objektiivien merkinnät: tubuspituus

• Kertoo, millaista mikroskoopin tubuspituutta (mitta objektiivin kiinnityskohdasta okulaarin kiinnityskohtaan) varten objektiivi on optimoitu

• Vanhemmissa objektiiveissa yleensä 160 tai 170 mm, uudemmissa ääretön


Öljyimmersio

• Öljyn taitekerroin vastaa peitinlasin taitekerrointa, joten valo ei taitu rajapinnassa objektiivin numeerinen apertuuri saadaan suuremmaksi

• Voidaan käyttää vain erityisillä immersio-objektiiveilla!


Okulaarit• Suurentavat objektiivin kuvaa

vielä lisää • Okulaarin suurennoksen ei

kannata kuitenkaan olla rajattoman suuri: kokonais-suurennos (objektiivin suurennos x okulaarin suurennos) 500-1000 x objektiivin N.A.; yleensä 4-25X

• Mieluummin 40X objektiivi ja 10X okulaari kuin toisin päin, jotta saadaan suurempi N.A. käyttöön

• Kiinnitetään tubuksen helakkeeseen yksinkertaisesti työntämällä


Mikroskoopin käsittely• Ole varovainen, äläkä hosu!• Mikroskopoi tukevalla alustalla poissa

kirkkaasta valosta ja pölystä.• Pidä lasipinnat puhtaina – ole erityisen

huolellinen immersioöljyn kanssa!• Kun lopetat käytön, peitä mikroskooppi

hupulla. Varo, ettei kuuma lamppu-kammio sulata huppua!

• Älä auo mikroskooppia itse äläkä irrottele objektiiveja… ne nimittäin tipahtavat helposti!


Mikroskoopin käyttö1. Sytytä valo.2. Aloita pienimmällä objektiivilla: näyte löytyy

helpommin, ja vältyt kolauttamasta objektiivia näytteeseen!

3. Aseta näyte ristisiirtopöydälle.4. Tarkenna pienellä objektiivilla ja karkeasäädöllä.

Säädä ensin sivusta katsoen lähelle näytettä. Katso sitten okulaariin ja tarkenna poispäin näytteestä.

5. Säädä silmäväli ja diopterisäätö.6. Valitse sopiva objektiivi.7. Säädä valon voimakkuus sopivaksi.8. Tarkenna hienosäädöllä.9. Säädä apertuurihimmennin.


Katsele oikein!• Käytä molempia silmiä!• Säädä okulaarit ja tubus itsellesi

sopiviksi.• Tarkenna niin, että silmät saavat

olla leppoisasti lepotilassa. • Tottumattomalle saattaa alkuun

tulla ankarasta mikroskopoinnista huono olo, vaikka säädöt olisivatkin kunnossa…


Tarkennus• Yleensä nostamalla ja

laskemalla ristisiirto-pöytää

• Aloita pienellä objek-tiivilla, jotta et kolauta etulinssiä preparaattiin!

• Ole varovainen erityisesti paljon suurentavien objektiivien kanssa.

• Huomaa CH2:ssa karkeasäädön rajoitinvipu!


Okulaarien ja tubuksen säädöt

• Tubuksen silmävälin säätö:– Tarkenna preparaattiin 10X objektiivilla.– Säädä silmäväli niin, että molempien

silmien näkökentät yhtyvät.

• Näkövirheen korjaus:– Peitä vasen okulaari vaikkapa paperilla.– Tarkenna kuva oikealle silmälle.– Peitä vuorostaan oikea okulaari.– Tarkenna kuva okulaarihelaketta

säätämällä.


Köhleröinti• Valaisujärjestelmän ihanteellinen säätö,

joka tuottaa parhaan mahdollisen kuvan• Valonlähteen kuva fokusoidaan

kondensorin apertuurihimmentimeen valonsäteet kohdistuvat näytteeseen rinnakkain ja tarkentumatta siihen tasainen valaisu

• Säädettävä aina objektiivia vaihdettaessa, tärkeää varsinkin valokuvauksessa!


Köhleröinnin suoritus - 1

• Aseta näyte mikroskooppiin ja tarkenna.

• Sulje kenttä-himmennintä, kunnes sen reunat näkyvät kuvassa (yleensä tässä vaiheessa sumeina – ks. kuva!)



• Tarkenna kenttähimmentimen kuva kondensoria nostamalla tai laskemalla.

• Siirrä kuva keskelle näkökenttää vääntämällä kondensorin keskitys-ruuveja (kuva!).



• Avaa kenttähimmennintä, kunnes n. ¾ näkökentästä näkyy. Tarkenna uudestaan.



• Avaa kenttähimmennintä sen verran, että koko kuva-ala valaistuu juuri ja juuri. Älä avaa yhtään enempää – se vain aiheuttaa heijastuksia ja huonontaa kontrastia.



• Säädä apertuurihimmennin:• Jos kondensorissa on

asteikko, säädä arvoksi 70-80% objektiivin N.A.:sta.

• Jos ei ole, poista toinen okulaari helakkeesta ja kurkista sisään. Sulje himmennintä, kunnes näet valoisana 70-80% näkökentästä.


Öljyimmersion käyttö1. Etsi näytteestä haluttu kohta ja tarkenna 10X

tai 40X objektiivilla.2. Käännä immersio-objektiivi siten, että saat

tipan öljyä sen etulinssiin.3. Laita tippa myös preparaatin päälle.4. Käännä objektiivi kohdalleen. Öljyn pitäisi

täyttää etulinssin ja peitinlasin väli. Varo, ettei linssi kolahda näytteeseen!

5. Tarkenna hienosäädöllä.6. Jos öljyyn jää ilmakuplia, kääntele

objektiivirevolveria varovasti.

Öljyn kanssa on oltava tarkkana! Älä sotke muita objektiiveja siihen. Poista öljy huolellisesti käytön jälkeen – sitä ei ikinä saa jättää kuivumaan mikroskooppiin!


Mikroskoopin hoito• Pidä kaikki lasipinnat puhtaina.• Puhdistus:

– Puhalla puhaltimella irtoroskat pois– Pyyhi optiikka puhdistusnesteeseen

kostutetulla vanupuikolla pyöritellen– Kuivaa heti vanupuikolla tai linssipaperilla

• Missä lika on?– Kökön sijainti selviää yleensä

liikuttelemalla okulaaria, objektiiveja, kondensoria…


Lisää tietoa• Valtavan hieno pläjäys

mikroskopiasta verkossa (mm. havainnollisia Java-interaktioita):http://micro.magnet.fsu.edu/primer/

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/

Valomikroskopian alkeet

Documents