VALIDASI METODE BIOANALITIK 8.1 Perkenalan 8.1.1 Definisi Validasi Metode Bioanalitik merupakan prosedur kerja untuk mendemonstrasi bahwa metode analisis yang digunakan untuk analisis kuantitatif dari analit pada matriks biologi dapat dipercaya dan reproducible sehingga dapat mencapai tujuan; kuantitas dari analit dengan derajat akurasi dan presisi yang tinggi. Metode kuantitatif yang digunakan termasuk metode kurva standar dari standar internal. Konsentrasi analit dapat dilihat dari respon sampel yang disebut standar kalibrasi. Blangko digunakan untuk mengetahui ada tidaknya interferen dalam matriks. Akurasi dan presisi dari metode dapat dikalkulasi dengan mengkalkulasikan sampel yang telah diketahui konsentrasinya atau disebut Quality Control samples (QCs). Hal – hal tersebut di atas penting untuk jaminan kepercayaan dari selektifitas dan sensitifitas metode bioanalitik sebelum digunakan untuk evaluasi kuantitatif dari obat dan metabolismenya. Data yang dihasilkan dari metode ini harus reproducible dan terpercaya karena digunakan untuk evaluasi dan interpretasi dari bioavailibilitas, bioequivalen, farmakokinetik dan pre-clinical findings. Validasi yang dapat digunakan untuk metode bioanalitik dapat menggunakan teknik analisis seperti: GC (Gas Chromatography); HPLC (High-Pressure Liquid Chromatography);
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
VALIDASI METODE BIOANALITIK
8.1 Perkenalan
8.1.1 Definisi
Validasi Metode Bioanalitik merupakan prosedur kerja untuk mendemonstrasi bahwa
metode analisis yang digunakan untuk analisis kuantitatif dari analit pada matriks biologi dapat
dipercaya dan reproducible sehingga dapat mencapai tujuan; kuantitas dari analit dengan derajat
akurasi dan presisi yang tinggi. Metode kuantitatif yang digunakan termasuk metode kurva
standar dari standar internal. Konsentrasi analit dapat dilihat dari respon sampel yang disebut
standar kalibrasi. Blangko digunakan untuk mengetahui ada tidaknya interferen dalam matriks.
Akurasi dan presisi dari metode dapat dikalkulasi dengan mengkalkulasikan sampel yang telah
diketahui konsentrasinya atau disebut Quality Control samples (QCs).
Hal – hal tersebut di atas penting untuk jaminan kepercayaan dari selektifitas dan
sensitifitas metode bioanalitik sebelum digunakan untuk evaluasi kuantitatif dari obat dan
metabolismenya. Data yang dihasilkan dari metode ini harus reproducible dan terpercaya karena
digunakan untuk evaluasi dan interpretasi dari bioavailibilitas, bioequivalen, farmakokinetik dan
pre-clinical findings. Validasi yang dapat digunakan untuk metode bioanalitik dapat
menggunakan teknik analisis seperti: GC (Gas Chromatography); HPLC (High-Pressure Liquid
Chromatography); teknik mass spectrometric seperti: LC-MS, LC-MS/MS, GC-MS dan GC-
MS/MS; atau immunological dan prosedur mikrobiologi seperti radioimmunoassay (RIA) dan
enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) untuk pemisahan kuantitatif obat dan/atau
metabolit dalam matriks biologi seperti sampel darah, serum, plasma, urin, feses, saliva, septum
(dahak), CSF (cerebrospinal fluid), jaringan-jaringan dan kulit.
Meskipun terdapat banyak prosedur dalam validasi bioanalitik, proses pengujian yang
spesifik dikembangkan, divalidasi, dan digunakan dalam analisis sampel rutin dapat dibagi
dalam 4 tahap utama:
- Preparasi standar referensi (larutan stok, pelarut, spiked calibrators, dan QCs.
- Pengembangan metode bioanalitik dimana prosedur pengujian ditetapkan.
- Validasi metode bioanalitik dan definisi kriteria penerimaan untuk analisis.
- Aplikasi metode validasi untuk sampel rutin.
Parameter dasar dalam validasi bioanalitik termasuk akurasi, presisi, selektifitas, sensitifitas,
reproducible, stabilitas obat dalam matriks pada kondisi penyimpanan, range, recovery dan
fungsi respon. Bagaimanapun, pengujian memiliki karakteristik unik yang harus
dipertimbangkan dalam validasi metode seperti selektifitas dan hasil kuantifikasi.
8.1.2 Pedoman Peraturan Mengenai Validasi Metode Bioanalitik
Sejak tahun 1990 dalam Washington Conference dalam validasi metode analisis seperti:
bioavailabilitas, bioequivalen, studi farmakokinetik, merupakan parameter yang harus digunakan
untuk menggambarkan validasi metode. Hasil akhir dari konferensi ini adalah pertimbangan
dokumen yang paling komferhensif dalam validasi pada metode bioanalitik. Banyak perusahaan
farmasi yang berkontribusi didalamnya.
Bagaimanpun, pada akhir decade sudah ada kemajuan dalam teknik yang digunakan
untuk preparasi sampel dan analisis. Contohnya, medan massa spektrometri, alat penghubung
baru, ionisasi, dan teknik deteksi telah berkembang.
Sesuai dengan pedoman FDA, dapat dianggap sebagai persyaratan minimum untuk
menguji kinerja dari metode bioanalytical. Karena proses validasi harus mensimulasikan analisis
sampel, dimana pada tes akhir metode yang sudah 'divalidasi' akan selalu menjadi analisis
sampel itu sendiri. Ada kemungkinan bahkan jika semua kriteria validasi terpenuhi, metode
bioanalytical mungkin tidak dapat dipercaya untuk analisis sampel yang sebenarnya. situasi yang
tidak diinginkan ini bisa terjadi ketika sampel yang sebenarnya (sampel in vivo) mengandung
interferen baru tidak hadir dalam sampel (sampel in vitro) karena proses metabolisme dan/atau
biotransformations lainnya. Untuk alasan ini, laboratorium bioanalytical bisa memutuskan untuk
menggunakan kriteria dan prosedur yang lebih ketat dan/atau menggunakan sampel yang
sebenarnya selama pengembangan metode untuk lebih menjamin validitas metode divalidasi.
Maka kami merangkum rekomendasi umum saat praktek validasi metode bioanalitis
sesuai dengan pedoman FDA, dengan pendekatan alternatif lain yang akan dibahas kemudian.
8.2 PRAKTEK VALIDASI YANG BERLAKU
Prosedur validasi untuk metode bioanalitik dalam evolusi yang berkelanjutan sejak
metode bioanalitik terus mengalami perubahan perbaikan, dan dalam banyak kasus teknologi
canggih.
8.2.1 Definisi
Sebagai langkah awal, penting untuk memiliki jelas dalam definisi pikiran istilah analisis
yang digunakan antara lain :
Akurasi : tingkat keeratan nilai terdekat untuk nilai sebenarnya nominal atau dikenal
dengan kondisi yang ditentukan. Ini kadang-kadang disebut trueness.
Analit : suatu bagian kimia tertentu yang diukur, yang bisa menjadi obat utuh,
biomolekul, atau turunannya, metabolit, dan / atau produk degradasi dalam matriks
biologi.
Analitik (atau batch) : satu set lengkap sampel analitis dan studi dengan jumlah yang
sesuai standar dan QCs untuk validasi mereka. Beberapa berjalan (atau batch) dapat
diselesaikan dalam satu hari, atau satu run (atau batch) dapat memakan waktu beberapa
hari untuk menyelesaikan.
Matriks biologi : bahan diskrit asal biologis yang dapat dicicipi dan diproses dengan cara
yang direproduksi. Contohnya adalah darah, serum, plasma, urin, feses, air liur, dahak,
dan berbagai jaringan diskrit.
Larutan stok : Larutan yang disiapkan langsung oleh berat standar referensi analit dan
melarutkannya dalam pelarut yang sesuai. Biasanya, larutan stok yang disiapkan pada
konsentrasi 1 mg / mL dalam metanol dan terus didinginkan di -20◦C jika tidak ada
masalah stabilitas atau kelarutan.
Standar kalibrasi : matriks biologis yang jumlah dikenal analit telah ditambahkan atau
berduri. Standar kalibrasi yang digunakan untuk membangun kurva kalibrasi dari mana
konsentrasi analit dalam QCs dan dalam sampel penelitian diketahui ditentukan.
Standar internal : Uji senyawa (s) (misalnya, struktural analog yang sama, senyawa
berlabel stabil) ditambahkan ke kedua standar kalibrasi dan sampel pada konsentrasi yang
diketahui dan konstan untuk memfasilitasi kuantifikasi analit target (s).
Batas deteksi (LOD) : konsentrasi terendah suatu analit bahwa prosedur bioanalitis
dipercaya bisa membedakan dari latar belakang noise.
Batas bawah kuantifikasi (LLOQ) : jumlah terendah dari analit sampel yang dapat
ditentukan secara kuantitatif dengan presisi dan akurasi cocok.
Efek Matrix : perubahan langsung atau tidak langsung atau gangguan dalam menanggapi
karena adanya analit yang tidak diinginkan (untuk analisis) atau zat mengganggu lainnya
dalam sampel.
Metode : deskripsi komprehensif dari semua prosedur yang digunakan dalam analisis
sampel.
Presisi : kedekatan perjanjian (derajat scatter) antara serangkaian pengukuran yang
diperoleh dari beberapa sampel dari sampel homogen yang sama di bawah kondisi yang
ditentukan.
Olahan sampel : ekstrak akhir (sebelum analisis instrumental) dari sampel yang telah
mengalami berbagai manipulasi (misalnya, ekstraksi, pengenceran, konsentrasi).
Kisaran Kuantifikasi : kisaran konsentrasi, termasuk ULOQ dan LLOQ, yang dapat
diukur dengan andal dan reprodusibel dengan akurasi dan presisi melalui penggunaan
hubungan konsentrasi-respon.
Recovery : efisiensi ekstraksi dari proses analisis, dilaporkan sebagai persentase dari
jumlah dikenal dari suatu analit dilakukan melalui langkah-langkah ekstraksi sampel dan
pengolahan metode.
Reprodusibel : ketepatan antara dua laboratorium. Ini juga merupakan ketepatan metode
di bawah kondisi operasi yang sama selama periode waktu yang singkat.
Sampel : istilah umum meliputi kontrol, kosong, tidak diketahui, dan sampel diproses,
seperti yang dijelaskan di bawah ini:
o Kosong : sampel matriks biologi yang ada analit telah ditambahkan yang digunakan
untuk menilai spesifisitas metode bioanalisis.
o Sampel kontrol kualitas (QC) : Contoh yang digunakan untuk memantau kinerja
metode bioanalitis dan untuk menilai integritas dan validitas hasil sampel yang tidak
diketahui dianalisis dalam batch individu.
o Diketahui : sampel biologis yang merupakan subjek dari analisis.
Selektivitas : kemampuan metode bioanalitis untuk mengukur dan membedakan analit
dengan adanya komponen yang dapat diharapkan untuk ada. Ini dapat mencakup
metabolit, kotoran, degradants, atau komponen matriks.
Stabilitas : stabilitas kimia dari suatu analit dalam matriks yang diberikan dalam kondisi
tertentu untuk interval waktu tertentu.
Kurva standar : hubungan antara nilai respon eksperimental dan konsentrasi analitis (juga
disebut kurva kalibrasi).
Kesesuaian sistem : penentuan kinerja instrumen (misalnya, sensitivitas dan retensi
kromatografi) dengan analisis dari standar acuan sebelum menjalankan batch analitis.
Batas atas kuantifikasi (ULOQ) : jumlah tertinggi analit dalam sampel yang dapat
ditentukan secara kuantitatif dengan presisi dan akurasi.
Validasi
o Validasi penuh : pembentukan semua parameter validasi untuk menerapkan analisis
sampel untuk metode bioanalisis untuk setiap analit.
o Validasi parsial : modifikasi divalidasi metode bioanalitik yang belum tentu panggilan
untuk revalidasi penuh.
o Cross-validasi : perbandingan parameter validasi dari dua metode bioanalitik.
o Larutan bekerja : Larutan disiapkan dari larutan stok melalui pengenceran dalam
pelarut yang sesuai pada konsentrasi diminta untuk spiking matriks biologi.
8.2.2 Selektivitas
Untuk selektivitas, analisis sampel kosong dari matriks yang sesuai biologis (plasma,
urin, atau matriks lainnya) harus diperoleh dari sedikitnya enam sumber.
Potensi zat campur dalam matriks biologi mencakup komponen matriks endogen,
metabolit, produk dekomposisi, dan dalam studi yang sebenarnya, obat bersamaan. Metode
selektivitas harus dievaluasi selama pengembangan metode dan metode validasi serta dapat terus
selama analisis sampel penelitian yang sebenarnya.
Berikut rekomendasi untuk menangani dua isu selektivitas harus dipertimbangkan:
1. Gangguan spesifik dari sifat fisika-kimia zat yang mirip dengan analit:
a. Reaktivitas silang metabolit, obat bersamaan, atau senyawa endogen harus dievaluasi
secara individu dan dalam kombinasi dengan analit kepentingan.
b. Bila mungkin, immunoassay harus dibandingkan dengan metode referensi divalidasi
(seperti LC-MS) menggunakan sampel dikeluarkan dan kriteria yang telah ditentukan
untuk persetujuan akurasi immunoassay dan metode referensi.
c. The linearitas pengenceran dengan standar referensi harus dinilai dengan menggunakan
studi (dikeluarkan) sampel.
d. Selektivitas dapat ditingkatkan untuk beberapa analit dengan penggabungan langkah
pemisahan sebelum immunoassay.
2. Nonspesifik efek matriks:
a. Kurva standar dalam cairan biologis harus dibandingkan dengan standar dalam buffer
untuk mendeteksi efek matriks.
b. Paralelisme sampel penelitian diencerkan harus dievaluasi dengan standar diencerkan
untuk mendeteksi efek matriks.
c. Spesifik mengikat harus ditentukan.
8.2.3 Standar Referensi
Kemurnian standar referensi yang digunakan untuk menyiapkan sampel yang di spike dapat
memengaruhi data studi. Untuk alasan ini, sebuah standar referensi analitis harus diketahui
identitas dan kemurniannya untuk dapat digunakan dalam penyiapan larutan yang sudah
diketahui konsentrasinya. Ada 3 tipe standar referensi umum yang digunakan :
1. Standar referensi tersertifikasi ( USP compendial standards)
2. Standar referensi yang tersedia secara komersial yang diperoleh dari sumber komersial
bereputasi
3. Bahan lainnya dengan kemurnian yang terdokumentasi,disintesis oleh laboratorium
analitis atau buatan nonkomersial lainnya.
Tiap standar referensi harus dilengkapi dengan sumber dan jumlah, tanggal kadaluarsa, sertfikat
analisis, dan/atau bukti identitas dan kemurnian.
8.2.4 Kurva Standar
Kurva kalibrasi harus dihasilkan dari tiap analit dalam sampel. Jumlah standar yang digunakan
harus cukup menegaskan hubungan antara konsentrasi dan respon. Kurva kalibrasi harus
disiapkan dalam matriks biologis yang sama seperti sampel dalam studi dengan mengadisi
(spike) matriks dengan analit yang konsentrasinya sudah diketahui. Jumlah standar akan menjadi
fungsi range yang diantisipasi pada nilai analitis dan hubungan analit-respon (sensitivitas
detektor dan range linier detektor). Konsentrasi standar dipilih berdasarkan range konsentrasi
yang diharapkan pada studi tertentu. Kurva kalibrasi harus mengandung sampel blanko (matriks
sampel di proses tanpa standar internal), zero matriks sampel yang diproses dengan standar
internal, dan enam sampai delapan nonzero sampel dengan range yang diharapkan, termasuk
LLOQ.
Lower Limit of Quantification. Standar terendah pada kurva kalibrasi yang diterima sebagai
batas kuantifikasi jika ditemui kondisi berikut :
1. Respon analit pada LLOQ harus setidaknya lima kali respon blanko.
2. Puncak analit (respon) haris dapat diidentifikasi, memiliki ciri khas, dan reprodusibel, dengan
presisi CV kurang dari 20% dan akurasi 80-120%.
Hubungan Konsentrasi-Respon
Kondisi berikut dapat ditemui dalam mengembangkan kurva kalibrasi :
1. Deviasi LLOQ kurang dari 20% dari nominal konsentrasi.
2. Deviasi 15% dari standar selain LLOQ dari nominal konsentrasi.
Setidaknya pada 4-6 nonzero standar harus ditemukan kriteria di atas, termasuk LLOQ dan
standar kalibrasi pada konsentrasi tertinggi. Dalam penambahan, kecuali standar yang tidak
ditemukan kriteria di atas tidak boleh mengubah model respon konsentrasi yang digunakan.
Microbiological and Immunoassay. Kurva standar microbiologi dan immunoassay nonlinear,
dan umumnya, lebih banyak titik konsentrasi mungkin di rekomendasikan untuk menetapkan
range kurva standar daripada pengujian kadar senyawa kimia. Terkait karakteristik nonlinear,
hubungan respon-kesalahan untuk kurva standar immunoassay merupakan fungsi varibel dari
respon (heteroscedisticity).
Untuk alasan ini, sebuah jumlah paling kecil dari 6 nonzero konsentrasi kalibrator di
rekomendasikan untuk diduplikasi. Penggunaan titik penjangkaran yang sejajar dengan
konsentrasi tinggi dan rendah yang mengakhiri kurva standar dapat memberikan peningkatan
pada kurva secara keseluruhan. Umumnya, titik penjangkaran ini akan ada pada konsentrasi
dibawah LLOQ dan di atas ULOQ. Sampel replikasi harus diukur selama validasi untuk
meningkatkan akurasi, prosedur sama harus diikuti untuk sampel yang tidak diketahui.
8.2.5 Precision and Accuracy
Akurasi ditetapkan mereplikasi analisis sampel yang mengandung jumlah analit yang diketahui.
Akurasi diukur menggunakan minimal lima kali penetapan per konsentrasi. Nilai rata-rata harus
kurang dari 15% dari nilai sebenarnya kecuali pada LLOQ, dimana itu tidak boleh menyimpang
lebih dari 20%. Deviasi pada rata-rata dari nilai sebenarnya dijadikan sebagai akurasi.
Presisi harus diukur menggunakan minimal lima kali penetapan per konsentrasi. Presisi
ditetapkan pada tiap level konsentrasi tidak melebihi 15% dari CV kecuali untuk LLOQ, dimana
itu tidak melebihi 20% dari CV
Presisi dibagi menjadi :
Presisi intrabatch atau repeatability, dimana menilai presisi selama analisis tunggal
berlangsung
Presisi interbatch atau presisi intermediate, dimana penilaian presisi dengan waktu dan
melibatkan analisis, peralatan, reagen, dan laboratorium yang berbeda
Pada nilai terendah, tiga konsentrasi yang mewakili keseluruhan range dari kurva standar harus
dipelajari : satu dalam tiga kali LLOQ (sampel QC rendah), satu dekat pusat (pertengahan QC)
dan satu dekat batas teratas dari kurva standar (QC tinggi). Perhitungan akurasi dan presisi, tidak
termasuk nilai-nilai yang secara statistik ditetapkan sebagai penyimpangan, dapat juga di
laporkan pada data validasi metode.
8.2.6 Pengenceran
Kemampuan untuk mengencerkan sampel asli di atas batas tertinggi pada kurva standar harus di
demonstrasikan dengan parameter akurasi dan presisi pada validasi.
8.2.7 Recovery
Recovery dari analit tidak perlu 100%, tapi tingkat recovery analit dan dari standar internal harus
konsisten, presisi, dan reprodusibel. Recovery percobaan harus dilakukan dengan
membandingkan hasil analisis untuk sampel yang diekstraksi pada 3 konsentrasi (rendah, sedang,
tinggi) dengan standar yang tidak diekstraksi mewakili recovery 100%.
Untuk Microbiological dan immunoassay, jika pemisahan dilakukan sampai pengujian kadar
dalam studi sampel tapi tidak untuk standar, penting untuk menetapkan recovery dan
menggunakannya dalam menentukan hasil. Pendekatan yang dapat dilakukan untuk menilai
efisiensi dan reprodusibilitas dari recovery :
Penggunaan trace analit (jumlah terlalu sedikit untuk berpengaruh pada pengujian kadar)
Peningkatan dalam penentuan recovery yang reprodusibel
Penggunaan standar internal yang tidak dikenali oleh antibodi tapi dapat ditentukan
dengan teknik lainnya
8.2.8 Stabilitas
Stabilitas dari analit yang ada dalam matrix dan sistem tidak boleh diektrapolasi ke dalam
matrix dan sistem lainnya. Prosedur untuk menentukan stabilitas harus dapat mengevaluasi
stabilitas dari analit selama pengumpulan sampel dan handling sampel setelah mengalami
beberapa perlakuan.
Kondisi yang digunakan adalah kondisi yang menggambarkan keadaan yang sama seperti
keadaan sampel yang sebenarnya di dalam proses handling dan analisis. Prosedur uji stabilitas
harus dilakukan juga untuk evaluasi dari stabilitas larutan stok dan sampel yang digunakan
disiapkan dari larutan stok yang dibuat.
Ada beberapa macam uji stabilitas, yaitu :
a. Freeze and Thaw Stability
Stabilitas analit dapat diketahui jika sudah dilakukan siklus 3 kali. Setiap bagian dengan
konsentrasi berbeda disimpan di suhu penyimpanan selama 24 jam dan dilelehkan di
temperatur ruangan, setelah leleh dibekukan kembali 12 sampai 24 jam dalam kondisi
yang sama dan diulangi sampai 3 siklus
b. Short-Term Temperature Stability
3 bagian dengan berbagai konsentrasi rendah dan tinggi dilelehkan dalam suhu ruangan
dan suhu dijaga selama 4 sampai 24 jam kemudian dilakukan analisis.
c. Long term stability
waktu penyimpanan untuk evaluasi stabilitas jangka panjang harus melewati waktu antara
tanggal pertama kali pengumpulan sampel dan tanggal terakhir kali sampel dianalisis.
Stabilitas jangka panjang dapat ditentukan dengan menyimpan setidaknya tiga bagian
dari setiap konsentrasi rendah dan tinggi pada kondisi yang sama dan dilihat
konsentrasinya dari awal pengujian hingga hari terakhir.
d. Stock Solution Stability
Stabilitas larutan stok dari suatu obat atau standar internal harus dievaluasi pada suhu
ruangan sedikitnya 6 jam. Kalau stok pernah dibekukan maka stabilitas harus dicatat dan
setelah waktu penyimpanan, stabilitasnya harus dites dengan membandingkan dengan
larutan yang baru
e. Postpreparative Stability
Stabilitas sampel harus dideterminasi dan reprodusibilitas dari penginjekan ulang harus
dievaluasi sehingga jika terjadi kesalahan dalam instrumen dapat dianalisis ulang.
8.2.9 Verifikasi tambahan
Ada berbagai macam verifikasi tambahan:
a. Full Validation
Hal ini penting dilakukan ketika mengembangkan dan menerapkan metode baru maupun
menggunakan zat uji yang baru.
b. Partial Validation.
Partial Validation ini dapat menjangkau penentuan nilai akurasi dan presisi yang kecil dan
dilakukan untuk modifikasi dari metode yang sudah divalidasi. Partial validation dapat
meliputi:
Metode bioanalytical transfer antara laboratorium atau analis
Perubahan metode analisis
Perubahan matriks pada spesies yang sama
Perubahan spesies dengan matriks yang sama
Perubahan pada prosedur pengolahan sampel
Perubahan instrument
Keterbatasan volume sampel
Selektivitas untuk memisahkan analit dengan adanya senyawa lain secara bersamaan
Selektivitas untuk memisahkan analit dengan adanya metabolit yang spesifik
c. Cross-Validation
Merupakan perbandingan ketika dua atau lebih metode bioanalytical digunakan untuk
mengolah data dengan studi yang sama atau antar studi yang berbeda. Contohnya metode
yang sudah divalidasi dijadikan referensi dan metode lain dijadikan pembandingnya.
8.2.10 Dokumentasi
Detail dari metode bioanalytical harus ditulis. Tulisan ini bisa dijadikan lembar protokol,