-
VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
KURKUMIN DALAM EKSTRAK RIMPANG KUNYIT
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Yosua Agung Santoso
NIM : 168114018
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
i
VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
KURKUMIN DALAM EKSTRAK RIMPANG KUNYIT
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Yosua Agung Santoso
NIM : 168114018
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
ii
Persetujuan Pembimbing
VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
KURKUMIN DALAM EKSTRAK RIMPANG KUNYIT
Skripsi yang diajukan oleh:
Yosua Agung Santoso
NIM : 168114018
Telah disetujui oleh:
Pembimbing Utama
Dr. Christine Patramurti, Apt. tanggal 25 November 2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
iii
Pengesahan Skripsi Berjudul
VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
KURKUMIN DALAM EKSTRAK RIMPANG KUNYIT
Oleh:
Yosua Agung Santoso
NIM : 168114018
Dipertahankan di hadapan Pantia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
pada tanggal: 17 Desember 2019
Mengetahui
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Dekan
Dr. Yustina Sri Hartini, Apt.
Panitia Penguji: Tanda tangan
1. Dr. Christine Patramurti, Apt. ….……................
2. Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. ……………….....
3. Michael Raharja Gani, M.Farm., Apt. ………………….
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya
tulis ini
tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang
telah disebutkan
dalam kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan
sebagaimana
layaknya karya ilmiah.
Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiatisme dalam
naskah
saya, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai
peraturan perundang-
undangan yang berlaku.
Yogyakarta, 25 November 2019
Penulis
Yosua Agung Santoso
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI
KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Saya yang bertanda tangan dibawah ini, mahasiswa Universitas
Sanata Dharma:
Nama : Yosua Agung Santoso
Nomor Mahasiswa : 168114018
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada
Perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:
VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
KURKUMIN DALAM EKSTRAK RIMPANG KUNYIT
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian
saya memberikan
kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk
menyimpan,
mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk
pangkalan
data, medistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di
internet atau
media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin
dari saya
maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan
nama saya
sebagai penulis.
Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : 25 November 2019
Yang menyatakan
(Yosua Agung Santoso)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
vi
ABSTRAK
Dalam proses memenuhi syarat standarisasi bahan baku produk
bahan
alam menjadi produk obat herbal terstandar, diperlukan metode
analisis yang
reliabel dan mampu memenuhi kebutuhan proses standarisasi bahan
baku yang
akan dibuat produk obat herbal terstandar. Proses standarisasi
bahan baku ekstrak
rimpang kunyit memerlukan metode analisis yang optimum dan valid
guna
menetapkan kadar kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit. Kurkumin
di dalam
ekstrak rimpang kunyit yang memiliki tiga bentuk senyawa yaitu
kurkumin,
demetoksikurkumin dan bis-demetoksikurkumin, sehingga diperlukan
metode
analisis dengan selektivitas dan sensitivitas yang cukup tinggi.
Oleh karena itu,
metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit yang
reliabel perlu
ditetapkan.
Metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit
menggunakan
HPLC telah dioptimasi dalam penelitian sebelumnya. Pada
penelitian ini,
dilakukan validasi metode analisis kurkumin dalam ekstrak
rimpang kunyit
menggunakan HPLC fase terbalik dengan fase gerak
asetonitril:metanol:air
(65:5:30 v/v), fase diam oktadesilsilan (C-18), serta laju alir
1,0 mL/menit.
Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi parameter
selektivitas, linearitas,
rentang, akurasi, dan presisi.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode yang diuji
memiliki
koefisien korelasi dan koefisien determinasi 0,999 (≥ 0,99) dan
nilai resolusi
1,533 (≥ 1,5). Selain itu, akurasi intra-day dan inter-day
adalah antara 97,03-
100,08% dan 96,11-99,88% (di dalam 85%-110%) dan presisi
intra-day dan inter-
day adalah antara 0,10-1,65% dan 0,31-2,59% (≤ 4%). Metode yang
diuji realibel
sehingga dapat digunakan untuk menetapkan kadar kurkumin dalam
ekstrak
rimpang kunyit.
Kata Kunci: Ekstrak rimpang kunyit, HPLC, Kurkumin, Validasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
vii
ABSTRACT
In the process of meeting the standardization requirements of
product raw
materials to become standardized herbal medicine, a reliable
analysis method is
needed for standardization process for the raw material that
will be make into a
standardized herbal medicinal products. The process of
standardization of
turmeric rhizome extract raw materials requires an optimal and
valid analytical
method to determine curcumin levels in turmeric rhizome extract.
Curcuminoid in
turmeric rhizome extract which has three forms of compounds
namely curcumin,
demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin, so that analytical
methods with
high selectivity and sensitivity are needed. Therefore, the
method of curcumin
analysis in a reliable turmeric rhizome extract needs to be
established.
Curcumin analysis method in turmeric extract using HPLC has
been
optimized in previous studies. In this study, the method of
analysis of curcumin in
turmeric rhizome extract was validated using reverse phase HPLC
with the mobile
phase of acetonitrile:methanol:water (65:5:30 v/v),
octadesilsilan (C-18)
stationary phase, and flow rate 1,0 mL / minute. This study aims
to validate the
parameters of selectivity, linearity, range, accuracy, and
precision.
The results showed that the method tested had a correlation
coefficient and
determination coefficient of 0.999 (≥ 0.99) and a resolution
value of 1.533 (≥ 1.5).
In addition, intra-day and inter-day accuracy is between
97.03-100.08% and
96.11-99.88% (within 85% -110%) and intra-day and inter-day
precision is
between 0,10-1.65% and 0.31-2.59% (≤ 4%). The tested method is
reliable so it
can be used to determine the level of curcumin in turmeric
rhizome extract.
Keywords: Curcumin, HPLC, Turmeric Rhizome Extract,
Validation
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
viii
HALAMAN PERSEMBAHAN
Successful and unsuccessful people do not vary greatly in their
abilities. They
vary in their desires to reach their potential.
-John Maxwell-
Sujud syukurku kusembahkan kepadaMu ya Allah, Tuhan Yang Maha
Esa
Dengan in saya persembahkan karya ini untuk
Kedua orang tua saya yang telah memberikan kasih sayang
Setiap guru dan dosen, yang dengan sabar mendidik saya selama
ini
Teman-teman yang selalu mendukung, merajut memori setiap
harinya, tawa yang
setiap hari kita miliki, dan solidaritas yang luar biasa
Almamater Universitas Sanata Dharma yang telah menjadi tempat
saya menimba
ilmu selama ini melalui pembelajaran kontekstual dan
aplikatif.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
ix
PRAKATA
Puji dan Syukur pada Tuhan Yang Maha Esa penulis panjatkan
atas
berkat dan penyertaan-Nya dari awal penyusunan sampai tahap
akhir penelitian
sehingga naskah skripsi berjudul Validasi Metode Analisis High
Performance
Liquid Chromatography Fase Terbalik Pada Penetapan Kadar
Kurkumin Dalam
Ekstrak Rimpang Kunyit dapat terselesaikan. Skripsi ini
merupakan bagian dari
penelitian Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. yang berjudul
“Micropaticles to
Potentially Improve Bioavailability of Curcumin and Antidiabetic
Activities in Pre
Clinical Studies: Combining Solid Dispersion Technology and
Metabolism
Suppressors” berdasarkan SK nomor 035b/LPPM USD/IV/2019.
Dalam proses penyelesaian naskah skripsi, penulis menerima
banyak
dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu,
penulis ingin
mengucapkan banyak terima kasih kepada:
1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas
Farmasi Universitas
Sanata Dharma
2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku Ketua Program
Studi Farmasi
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dan dosen pembimbing
yang
telah berperan seperti orang tua dan senantiasa memberikan
masukan, arahan,
serta pendampingan dengan sabar selama proses penyusunan
skripsi.
3. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku Dosen Pembimbing
Akademik dan
dosen penguji yang selalu memberikan masukan, pendampingan, dan
kritik
yang membangun.
4. Bapak Michael Raharja Gani, M.Farm., Apt., selaku dosen
penguji yang
senantiasa memberikan kritik, masukan, dan saran yang
membangun.
5. Mas Bimo (Laboran Laboratorium Kimia Instrumen Fakultas
Farmasi
Universitas Sanata Dharma), Bapak Bimo (Laboran Laboratorium
Analisis
Pusat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma), dan Bapak
Kayat
(Laboran Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Universitas
Sanata
Dharma) yang telah membantu dan memfasilitasi kegiatan
penelitian di
laboratorium.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
x
6. Rekan penelitian Maria Philomia Christanti Raga, Sinta
Susanti, dan Christin
Nesia Sukma Wijayanti atas dukungan, solidaritas, suka-duka, dan
kerja sama
selama proses penelitian.
7. Pihak lain yang tidak dapat penulis sebutkan satu
persatu.
Selama proses penyusunan skripsi penulis menyadari bahwa
masih
terdapat banyak kekurangan dalam naskah ini. Oleh karena itu,
penulis sangat
terbuka terhadap segala masukan, saran dan kritik yang membangun
agar naskah
skripsi ini dapat menjadi lebih baik dan bermanfaat. Akhir kata,
semoga naskah
skripsi ini dapat bermanfaat dan berguna bagi pembaca.
Yogyakarta, 25 November 2019
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xi
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL……………………………………………..…..
i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING…………………...…
HALAMAN PENGESAHAN………………………………………..
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……………………………...
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI…………………….
ABSTRAK…………………………………………………………...
ABSTRACT…………………………………………………………...
HALAMAN PERSEMBAHAN……………………………………...
PRAKATA…………………………………………………………...
ii
iii
iv
v
vi
vii
vii
ix
DAFTAR ISI………………………………………………………… xi
DAFTAR TABEL.....………………………………………………... xii
DAFTAR GAMBAR………………………………………………… xiii
DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………….... xiv
PENDAHULUAN…………………………………………………… 1
METODE PENELITIAN…………….……………..…….................. 4
HASIL DAN PEMBAHASAN……..…...…………...……………… 9
KESIMPULAN………..….…………...……………………….……. 16
SARAN………………….....…..………………………...................... 16
DAFTAR PUSTAKA………………...…...…………………………. 17
LAMPIRAN…………….…..…………...…………….……………..
BIOGRAFI PENULIS………………………………………………..
19
39
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Data waktu retensi, resolusi dan tailing factor
senyawa
kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit ……….............
10
Tabel II. Data perolehan AUC dari 3 replikasi 7 seri
konsentrasi
baku kurkumin ………………...…..………………........
11
Tabel III. Data rentang………………………………...…………...
Tabel IV. Data intra-day akurasi dan presisi kurkumin
…………...
Tabel V. Data inter-day akurasi dan presisi kurkumin …………...
13
15
15
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xiii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Kromatogram larutan baku kurkumin konsentrasi 0,5
µg/mL …………………………………………………
Gambar 2. Kromatogram ekstrak rimpang kunyit konsentrasi 0,5
µg/mL …………………………………………………
Gambar 3. Stacking kromatogram kurva baku kurkumin replikasi
ketiga……......................................................................
Gambar 4. Kurva baku kurkumin replikasi ketiga ………..……....
Gambar 5. Stacking kromatogram adisi baku kurkumin…………..
9
10
12
12
14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Kromatogram rentang dan kurva baku kurkumin…….
Lampiran 2. Kromatogram perolehan kembali……………………..
Lampiran 3. Kromatogram ekstrak rimpang kunyit konsentrasi
0,5
µg/mL………………………………………………....
Lampiran 4. Data AUC perolehan kembali dan presisi…………….
19
32
36
37
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
1
PENDAHULUAN
Sampai saat ini telah banyak pemanfaatan tanaman obat
tradisional oleh
masyarakat Indonesia untuk menanggulangi beberapa penyakit.
Manfaat
penggunaan obat tradisional tersebut secara luas telah dirasakan
oleh masyarakat.
Hal ini juga tercermin dengan semakin meningkatnya penggunaan
obat
tradisional, sehingga memberi dampak meningkatnya produksi obat
dari industri
obat tradisional. Penggunaan senyawa bahan alam tersebut giat
dilakukan sebagai
alternatif pengobatan di samping obat sintesis (Pulido et al.,
2016).
Badan Pengawasan Obat dan Makanan (BPOM) mendorong
perkembangan obat herbal sampai tingkat obat herbal terstandar
bahkan sampai ke
tingkat fitofarmaka yang bertujuan untuk menjamin keamanan obat
herbal yang
akan digunakan oleh masyarakat. Obat herbal terstandar adalah
sediaan obat
bahan alam yang telah dibuktikan keamanan dan khasiatnya secara
ilmiah dengan
uji praklinik dan bahan bakunya telah di standarisasi (BPOM,
2014). Proses
pengembangan produk bahan alam menjadi produk obat herbal
terstandar
memerlukan proses standarisasi bahan baku yang dilanjutkan
dengan proses uji
praklinik pada hewan untuk membuktikan keamanan dan khasiatnya
secara ilmiah
(BPOM, 2014). Dalam proses memenuhi syarat standarisasi bahan
baku ekstrak
rimpang kunyit menjadi produk obat herbal terstandar, diperlukan
metode analisis
yang reliabel dan mampu memenuhi kebutuhan proses standarisasi
bahan baku
yang akan dibuat produk obat herbal terstandar.
Proses standarisasi bahan baku ekstrak rimpang kunyit
memerlukan
metode analisis yang optimum dan valid guna menetapkan kadar
kurkumin dalam
ekstrak rimpang kunyit. Kurkuminoid di dalam ekstrak rimpang
kunyit memiliki
tiga bentuk senyawa yaitu kurkumin, demetoksikurkumin dan
bis-
demetoksikurkumin, sehingga diperlukan metode analisis dengan
selektivitas dan
sensitivitas yang cukup tinggi. Metode analisis diharapkan
selektif sehingga
mampu memisahkan senyawa kurkumin yang ada di dalam ekstrak
rimpang
kunyit dari bentuk turunan lainnya yaitu demetoksikurkumin dan
bis-
demetoksikurkumin dengan baik. Metode analisis diharapkan mampu
mengukur
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
2
kadar kurkumin dengan sensitivitas yang baik sehingga dapat
lebih baik dalam
penetapan kadar kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit.
Dalam berbagai penelitian yang pernah ada sebelumnya
menunjukkan
bahwa kadar kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit dapat
ditetapkan dengan
metode Spektrofotometri UV-Vis, KLT-Densitometer dan HPLC fase
terbalik.
Beberapa metode spektrofotometri UV-Vis telah dikembangkan untuk
analisis
kadar kurkumin (Setyaningsih et al., 2016; Jankun et al., 2016).
Pada penelitian
menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis didapat hasil berupa
kadar
kurkuminoid total karena metode tersebut tidak mampu memisahkan
kurkumin
dari bentuk turunan lainnya yaitu demetoksikurkumin dan bis-
demetoksikurkumin. Metode spektrofotometri UV-Vis kurang
selektif dibanding
dengan metode kromatografi lapis tipis dan kromatografi cair
yang mampu
memisahkan kurkumin dari bentuk turunan lainnya.
Beberapa metode kromatografi lapis tipis telah dikembangkan
untuk
menyediakan kebutuhan metode yang lebih selektif dibanding
metode
spektrofotometri UV-Vis yang dapat diandalkan untuk penentuan
kadar kurkumin
dalam ekstrak rimpang kunyit (Phattanawasin et al., 2009;
Gantait et al., 2011;
Setyaningsih et al., 2016). Metode kromatografi lapis tipis
terbukti mampu
memisahkan kurkumin dari bentuk turunan lainnya yaitu
demetoksikurkumin dan
bis-demetoksikurkumin. Pada penelitian menggunakan metode
kromatografi lapis
tipis mampu memberikan pemisahan sempurna puncak kurkumin dari
puncak
senyawa derivat kurkumin dengan Rf 0,50 dan Rs 2,62. Linearitas
metode
ditunjukkan oleh nilai r sebesar 0,996. Metode KLT ini
memberikan presisi dan
akurasi sesuai dengan regulasi yaitu RSD ≤ 3,50 dan perolehan
kembali 94-105%.
Metode kromatografi lapis tipis memiliki sensitifitas yang cukup
tinggi, mampu
mengukur kadar terendah kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit
hingga 1,3
μg/mL. Metode kromatografi lapis tipis kurang sensitif dibanding
dengan metode
kromatografi cair yang mampu mengukur kadar sampel hingga satuan
ng/mL
(ppb).
Beberapa metode Reverse Phase High Performance Liquid
Chromatography (RP-HPLC) telah dikembangkan untuk menyediakan
kebutuhan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
3
metode yang selektif dan sensitif yang dapat diandalkan untuk
penentuan
kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit (Wichitnithad et al.,
2009; Ali et al.,
2014; Monton et al., 2016; Setyaningsih et al., 2016; Fonseca et
al., 2017;
Khismatrao et al., 2018). Pada penelitian menggunakan metode
RP-HPLC mampu
memberikan pemisahan sempurna puncak kurkumin dari puncak
senyawa derivat
kurkumin dengan Tf 0,9-1,2 dan Rs 1,5-2,0. Linearitas metode
ditunjukkan oleh
nilai r sebesar 0,99. Metode RP-HPLC mampu memberikan presisi
dan akurasi
sesuai dengan regulasi yaitu RSD ≤ 4% dan perolehan kembali
92,47-105,70%.
Metode RP-HPLC juga memiliki sensitifitas yang tinggi, mampu
mengukur kadar
terendah kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit hingga 6 ng/mL.
Penelitian
mengenai deteksi kadar kurkumin dilakukan oleh Ali, Haque, dan
Saleem dengan
menggunakan fase diam C-18 dan komposisi fase gerak
asetonitril:metanol:air
dengan perbandingan 40:20:40 v/v (Ali, et al., 2014). Pada
penelitian kali ini,
penulis mengacu pada penelitian Ali, Haque, dan Saleem dengan
menggunakan
modifikasi sistem fase gerak yang sudah dioptimasi pada
penelitian sebelumnya.
Penelitian ini merupakan bagian dari rangkaian penelitian
penetapan
kadar kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit dengan menggunakan
metode
HPLC fase terbalik yang terdiri dari tahap optimasi dan
validasi. Penulis akan
melakukan validasi terhadap metode tersebut. Proses validasi
metode analisis
dilakukan untuk memastikan bahwa parameter kinerja metode
analisis mampu
mengatasi masalah analisis dan menunjukkan bahwa metode analisis
yang
digunakan layak digunakan untuk analisis senyawa kurkumin (ICH,
2005).
Validasi metode dilakukan ketika metode baru diterapkan untuk
mengatasi
permasalahan analisis tertentu, ketika metode yang sudah baku
direvisi, ketika
metode baku diterapkan di laboratorium yang berbeda,
mendemonstrasikan
kesetaraan dua metode, serta apabila adanya perubahan instrumen
dan analit
(Gandjar dan Rohman, 2007). Beberapa parameter validasi yang
digunakan
meliputi selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi
(USP, 2017).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
4
METODE PENELITIAN
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kualitas
pro
analysis, meliputi ekstrak rimpang kunyit dengan kandungan
kurkuminoid 95%
(PT. Phytocemindo Reksa), baku kurkumin tingkat kemurnian 98%
(Nacalai Inc.),
metanol grade for liquid chromatography (E. Merck), asetonitril
grade for liquid
chromatography (E. Merck), dan aquabidestilata. Bahan lainnya
diperoleh dari
Laboratorium Kimia Analisis Instrumen Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penilitian ini meliputi seperangkat
HPLC
merk Shimadzu dengan detektor UV (LC-2010C HT Shimadzu), kolom
C-18
(Knaurer) dengan dimensi 250 x 4,6 mm dan ukuran pori 5 µm;
seperangkat
komputer (Dell B6RDZIS Connexant system RD01-D850 A03-0382 JP
France
S.A.S); printer (HP Deskjet 1000 J110a); ultrasonikator
(RETSCH); neraca
analitis ultramicro (RADWAG®) seri UYA 2.3Y dengan kapasitas
timbang
maksimal 2,1 g, minimal 0,01 mg, dan d = 0,1 µg; neraca analitis
(Scaltec) dengan
kapasitas timbang maksimal 60/210 g, minimal 0,001 g, d = 0,01
mg, dan e = 1
mg; jarum suntik (Terumo); syringe filter 0,45 µm (Ministar®);
pompa vakum;
whatman membrane filter dengan ukuran pori sebesar 0,45 µm dan
diameter
sebesar 47 mm; corong buchner; mikropipet (Socorex); dan
peralatan-peralatan
yang biasa digunakan di dalam laboratorium analisis farmasi.
Tata Cara Penelitian
Pembuatan fase gerak
Fase gerak terbuat dari asetonitril, metanol dan air dengan
perbandingan
65:5:30 v/v. Setiap komponen disaring dengan menggunakan kertas
saring
whatman pada corong buchner, dibantu dengan pompa vakum,
kemudian
diawaudarakan selama 15 menit dengan ultrasonikator. Pencampuran
komponen
fase gerak dilakukan di dalam instrumen HPLC.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
5
Pembuatan Larutan Baku Kurkumin
Pembuatan larutan stok kurkumin 1000 µg/mL
Sebanyak kurang lebih 1,0 mg baku kurkumin yang ditimbang
seksama
dilarutkan dalam mikrotube dengan metanol sampai tanda batas 1
ml sehingga
diperoleh larutan stok kurkumin 1000 µg/mL.
Pembuatan larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL
Sebanyak 100 µL larutan stok baku kurkumin 1000 µg/mL
diambil
kemudian dilarutkan dengan menggunakan metanol sampai tanda
batas 1 ml
sehingga diperoleh larutan intermediet baku kurkumin 100
µg/mL.
Pembuatan larutan intermediet baku kurkumin 10 µg/mL
Sebanyak 100 µL larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL
diambil
kemudian dilarutkan dengan menggunakan metanol sampai tanda
batas 1 ml
sehingga diperoleh larutan intermediet baku kurkumin 10
µg/mL.
Pembuatan seri larutan baku kurkumin
Pembuatan seri larutan baku kurkumin (konsentrasi 40; 35; 30;
25; 20; 15;
dan 10 µg/mL)
Sebanyak 400 µL; 350 µL; 300 µL; 250 µL; 200 µL; 150 µL; 100
µL
larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL masing-masing
dimasukkan dalam
mikrotube, kemudian diencerkan dengan metanol sampai tanda batas
1 ml
sehingga diperoleh seri larutan baku kurkumin dengan konsentrasi
40 µg/mL; 35
µg/mL; 30 µg/mL; 25 µg/mL; 20 µg/mL; 15 µg/mL; dan 10 µg/mL.
Pembuatan seri larutan baku kurkumin (konsentrasi 5,0; 2,5; 1,0;
0,5; 0,1;
dan 0,05 µg/mL)
Sebanyak 500 µL; 250 µL; 100 µL; 50 µL; 10 µL; 5 µL larutan
intermediet baku kurkumin 10 µg/mL masing-masing dimasukkan
dalam
mikrotube, kemudian diencerkan dengan metanol sampai tanda batas
1 ml
sehingga diperoleh seri larutan baku kurkumin dengan konsentrasi
5,0 µg/mL; 2,5
µg/mL; 1,0 µg/mL; 0,5 µg/mL; 0,1 µg/mL; dan 0,05 µg/mL.
Preparasi larutan ekstrak rimpang kunyit
Ditimbang kurang lebih 10 mg ekstrak rimpang kunyit dengan
seksama,
kemudian dilarutkan dalam labu takar 10,0 mL dengan metanol
hingga tanda
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
6
batas sehingga diperoleh larutan ekstrak rimpang kunyit dengan
konsentrasi 1000
µg/mL (larutan A). Sebanyak 1,0 mL larutan A diambil kemudian
dilarutkan
dengan menggunakan metanol dalam labu takar 10,0 mL sampai tanda
batas
sehingga diperoleh larutan ekstrak rimpang kunyit dengan
konsentrasi 100 µg/mL
(larutan B). Sebanyak 100 µL larutan B diambil kemudian
dilarutkan dengan
menggunakan metanol pada mikrotube sampai tanda batas 1 ml
sehingga
diperoleh larutan ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 10
µg/mL (larutan
C). Sebanyak 50 µL larutan C diambil kemudian dilarutkan dengan
menggunakan
metanol pada mikrotube sampai tanda batas 1 ml sehingga
diperoleh larutan
ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 0,5 µg/mL (larutan
D).
Validasi Metode Analisis
Selektivitas
Larutan baku kurkumin konsentrasi 0,5 µg/mL diinjeksikan ke
dalam
HPLC fase terbalik dengan fase gerak asetonitril:metanol:air
(65:5:30 v/v) serta
fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju fase gerak 1,0
mL/menit, kemudian
larutan ekstrak kurkumin dengan konsentrasi 0,5 µg/mL
diinjeksikan ke dalam
HPLC fase terbalik dengan fase gerak asetonitril:metanol:air
(65:5:30 v/v) serta
fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju fase gerak 1,0
mL/menit. Replikasi
dilakukan sebanyak 3 kali, sehingga diperoleh waktu retensi
senyawa kurkumin
dan nilai daya resolusi.
Kurva Baku Kurkumin
Larutan seri baku kurkumin dengan konsentrasi 25 µg/mL; 20
µg/mL; 15
µg/mL; 10 µg/mL; 5,0 µg/mL; 2,5 µg/mL; 1,0 µg/mL yang telah
dibuat disaring
dengan syringe filter lalu diawaudarakan selama 5 menit. Setiap
larutan
diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan fase gerak
asetonitril:metanol:air (65:5:30 v/v) serta fase diam
oktadesilsilan (C-18) dan laju
fase gerak 1,0 mL/menit. Luas area kurkumin akan ditunjukkan
oleh
kromatogram. Kurva baku diperoleh dengan memplotkan luas area
kurkumin
dengan kadar baku kurkumin.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
7
Linearitas dan Rentang
Larutan seri baku kurkumin dengan konsentrasi 40 µg/mL; 35
µg/mL; 30
µg/mL; 25 µg/mL; 20 µg/mL; 15 µg/mL; 10 µg/mL; 5,0 µg/mL; 2,5
µg/mL; 1,0
µg/mL; 0,5 µg/mL; 0,1 µg/mL; dan 0,05 µg/mL yang telah dibuat
disaring dengan
syringe filter lalu diawaudarakan selama 5 menit. Setiap larutan
diinjeksikan ke
dalam HPLC fase terbalik dengan fase gerak
asetonitril:metanol:air (65:5:30 v/v)
serta fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju fase gerak 1,0
mL/menit.
Pembacaan seri baku kurkumin dilakukan sebanyak 3 kali
replikasi.
Akurasi dan Presisi
Intra-day dan inter-day presisi dan akurasi dilakukan dengan
menggunakan sampel ekstrak rimpang kunyit kosentrasi 0,5 µg/mL
yang
ditambahkan tiga tingkatan konsentrasi baku kurkumin yang
berbeda, dilakukan
replikasi 3 kali untuk masing-masing konsentrasi dan mengulangi
penelitian
selama tiga hari berturut-turut pada. Baku kurkumin yang
ditambahkan memiliki
tingkat konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi yaitu 1 µg/mL, 10
µg/mL, 20
µg/mL secara berurutan. Sebanyak 50 µL larutan ekstrak rimpang
kunyit dengan
konsentrasi 10 µg/mL diambil kemudian ditambahkan 100 µL larutan
intermediet
baku kurkumin 10 µg/mL, dilarutkan dengan menggunakan metanol
pada
mikrotube sampai tanda batas 1 ml (Larutan Adisi 1). Sebanyak 50
µL larutan
ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 10 µg/mL diambil
kemudian
ditambahkan 100 µL larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL,
dilarutkan
dengan menggunakan metanol pada mikrotube sampai tanda batas 1
ml (Larutan
Adisi 2). Sebanyak 50 µL larutan ekstrak rimpang kunyit dengan
konsentrasi 10
µg/mL diambil kemudian ditambahkan 200 µL larutan intermediet
baku kurkumin
100 µg/mL, dilarutkan dengan menggunakan metanol pada mikrotube
sampai
tanda batas 1 ml (Larutan Adisi 3). Setiap larutan disaring
dengan syringe filter
dan diawaudarakan selama 5 menit, kemudian diinjeksikan ke dalam
HPLC fase
terbalik dengan fase gerak asetonitril:metanol:air (65:5:30 v/v)
serta fase diam
oktadesilsilan (C-18) dan laju fase gerak 1,0 mL/menit. Semua
percobaan
dilakukan dalam 3 replikasi untuk setiap tingkatan konsentrasi,
kemudian nilai
recovery dan koefisien variasi dapat dihitung.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
8
Analisis Hasil
Selektivitas
Parameter ini ditentukan dengan nilai resolusi puncak dari
senyawa
kurkumin yang didapat. Perbandingan waktu retensi yang sama
antara baku
kurkumin dan senyawa kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit
membuktikan
bahwa puncak tersebut adalah benar merupakan puncak dari senyawa
kurkumin.
Metode analisis yang diuji dikatakan selektif apabila memiliki
nilai resolusi ≥ 1,5
(AOAC, 2019).
Linearitas dan Rentang
Nilai koefisien korelasi (r) merupakan nilai yang menentukan
linearitas
suatu metode. Koefisien korelasi diperoleh dari plot
perbandingan AUC baku
kurkumin terhadap konsentrasi baku kurkumin. Metode analisis
dikatakan linear
apabila memiliki nilai koefisien korelasi lebih besar dari 0,99
(AOAC, 2019).
Rentang diperoleh dengan melakukan penambahan 3 konsentrasi di
atas titik
tertinggi kurva baku dan 3 konsentrasi dibawah titik terendah
kurva baku. Nilai
koefisien determinasi (R2) didapat dari pengkuadratan koefisien
korelasi rentang
baku kurkumin dengan konsentrasi 0,05 µg/mL-40 µg/mL. Rentang
yang baik
memiliki nilai koefisien determinasi lebih besar dari 0,99
menunjukkan metode
analisis mampu memastikan kadar kurkumin dalam analit tidak
mengalami
ekstrapolasi (AOAC, 2019).
Akurasi dan Presisi
Akurasi suatu metode ditunjukkan dengan nilai perolehan kembali.
Nilai
tersebut dapat diperoleh dengan membandingkan konsentrasi sampel
yang
didapat dengan konsentrasi analit sebenarnya melalui rumus
perolehan kembali.
Syarat nilai perolehan kembali yang dapat diterima sesuai dengan
konsentrasi
baku kurkumin yang ditambahkan adalah 85-110% (AOAC, 2019).
Presisi suatu
metode ditunjukkan dengan nilai koefisien variasi. Syarat nilai
koefisien variasi
yang dapat diterima sesuai dengan konsentrasi baku kurkumin yang
ditambahkan
adalah ≤ 4% (AOAC, 2019).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
9
HASIL DAN PEMBAHASAN
Validasi metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang
kunyit
dilakukan dengan menggunakan kolom C18; perbandingan fase
gerak
asetonitril:metanol:air sebesar 65:5:30; laju alir 1,0 mL/menit;
pembacaan pada
panjang gelombang 420 nm; volume injeksi 20 µL; dan waktu
pembacaan selama
7 menit. Seluruh prosedur tersebut telah dioptimasi dalam
penelitian sebelumnya
dengan nilai tailing factor sebesar 1,180; resolusi pada
konsentrasi 45 µg/mL
sebesar 1,739; dan waktu retensi sebesar 5,289. Parameter yang
divalidasi dalam
penelitian ini meliputi selektivitas, linearitas, rentang,
akurasi, dan presisi.
Penentuan Selektivitas
Selektivitas adalah parameter yang menunjukkan kemampuan
metode
analisis dalam membedakan dan menghitung analit dari senyawa
lain dalam
sampel. Selektivitas merupakan informasi yang menunjukkan bahwa
substansi
yang diukur adalah substansi yang dikehendaki untuk dianalisis
(FDA, 2018).
Gambar 1. Kromatogram larutan baku kurkumin konsentrasi 0,5
µg/mL; “A” merupakan
puncak senyawa kurkumin.
Pada Gambar 1 di atas, tampak bahwa setelah menit ketiga, tidak
ada puncak dan
tidak ada gangguan yang ditemukan sehingga tidak akan menganggu
hasil analisis
puncak senyawa kurkumin. Pada Gambar 1 dan Gambar 2, tampak
bahwa
perbandingan waktu retensi yang sama antara baku kurkumin dan
senyawa
kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit yang sama yaitu pada 5,3
menit
membuktikan bahwa puncak tersebut adalah benar merupakan puncak
dari
senyawa kurkumin.
A
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
10
Gambar 2. Kromatogram ekstrak rimpang kunyit konsentrasi 0,5
µg/mL; “A”, “B”, dan “C”
merupakan puncak kurkumin, demetoksikurkumin, dan
bis-demetoksikurkumin secara berurutan.
Selektivitas metode dapat dilihat dari nilai resolusi peak
senyawa yang
hendak dianalisis. Daya resolusi bernilai paling tidak 1,5 di
antara dua puncak
akan mengkonfirmasi bahwa senyawa dalam sampel sepenuhnya
terpisah
sehingga jumlah masing-masing senyawa dapat diukur secara akurat
(AOAC,
2019). Keterpisahan senyawa kurkumin dalam ekstrak rimpang
kunyit konsentrasi
0,5 µg/mL dengan peak yang berada disebelahnya dapat dilihat
pada
kromatogram Gambar 2. Data resolusi senyawa kurkumin dalam
ekstrak rimpang
kunyit konsentrasi 0,5 µg/mL disajikan dalam Tabel I. Daya
resolusi rata-rata
senyawa kurkumin dalam ekstrak kurkumin konsentrasi 0,5 µg/mL
bernilai
sebesar 1,533. Metode memiliki nilai resolusi lebih dari 1,5
sehingga metode yang
diuji memenuhi parameter selektivitas.
Tabel I. Data waktu retensi, resolusi dan tailing factor senyawa
kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit
Konsentrasi
(µg/mL)
Rata-rata
Waktu
Retensi
RSD
(%)
Rata-rata
Resolusi
RSD
(%)
Rata-rata
Tailing
factor
RSD
(%)
0,5 µg/mL 5,326 ± 0,01 0,21 1,533 ± 0,01 0,57 1,289 ± 0,01
0,85
15 µg/mL 5,345 ± 0,02 0,42 1,801 ± 0,01 0,82 1,256 ± 0,01
1,00
30 µg/mL 5,333 ± 0,01 0,25 1,778 ± 0,03 1,61 1,255 ± 0,01
0,76
45 µg/mL 5,304 ± 0,02 0,28 1,696 ± 0,04 2,45 1,208 ± 0,01
1,07
A
B
C
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
11
Penentuan Kurva Baku
Kurva baku diperoleh dari hubungan respon instrumen yang berupa
nilai
Area Under Curve (AUC) terhadap konsentrasi baku kurkumin. Seri
konsentrasi
baku yang terdapat dalam kurva baku harus mampu menjangkau kadar
sampel
analit. Pembuatan kurva baku pada penelitian ini menggunakan
seri konsentrasi
baku kurkumin 1 µg/mL; 2,5 µg/mL; 5 µg/mL; 10 µg/mL; 15 µg/mL;
20 µg/mL;
dan 25 µg/mL.
Tabel II. Data perolehan AUC dari 3 replikasi 7 seri konsentrasi
baku kurkumin
Konsentrasi
(µg/mL)
AUC
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
1 196744 208490 208132
2,5 513113 481414 517977
5 981099 954252 1036290
10 1980578 2095571 2018970
15 2903036 3009783 2988214
20 4037150 4041326 4270044
25 4765075 4714627 5259697
a 25754,061 45726,009 -35472,449
b 193586,198 193444,343 210797,849
Koefisien korelasi 0,9991 0,9990 0,9992
Dari data tiga replikasi seri konsentrasi baku kurkumin yang
disajikan
pada Tabel II, seri konsentrasi kurva baku yang digunakan adalah
seri kurva baku
dengan nilai koefisien korelasi paling mendekati 1,0, yaitu seri
konsentrasi kurva
baku replikasi ketiga dengan nilai a sebesar -35472,449; nilai b
sebesar
210797,849; dan koefisien korelasi 0,9992. Kurva baku dapat
dikatakan linear
ketika memiliki nilai koefisien korelasi lebih besar dari 0,99
(AOAC, 2019).
Kurva baku yang digunakan memiliki nilai koefisien korelasi
lebih dari 0,99 yaitu
sebesar 0,9992 sehingga kurva baku bersifat linear.
Persamaan kurva baku diperoleh dari plot perbandingan AUC
baku
kurkumin terhadap konsentrasi baku kurkumin. Hubungan antara
konsentrasi
baku kurkumin dengan nilai AUC kurkumin dapat dilihat pada
Gambar 2.
Semakin tinggi konsentrasi baku kurkumin, maka respon instrumen
berupa nilai
AUC akan meningkat. Hubungan tersebut dapat dilihat secara
visual pada Gambar
3 dan Gambar 4. Persamaan berupa y=bx+a didapat dari kurva baku
(b adalah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
12
slope; a adalah intercept; y adalah AUC; dan x adalah kadar
kurkumin).
Persamaan yang didapatkan dari seri konsentrasi baku kurkumin
replikasi ketiga
adalah y = 210797,849 x – 35472,450. Kadar kurkumin (x) didapat
dengan
memasukkan nilai AUC ke dalam y pada persamaan.
Gambar 3. Stacking kromatogram kurva baku kurkumin replikasi
ketiga
Gambar 4. Kurva baku kurkumin replikasi ketiga
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
uV
y = 210797,849x - 35472,450
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
0 5 10 15 20 25 30
AU
C
Konsentrasi (µg/mL)
Kurva Baku Kurkumin
25 µg/mL
20 µg/mL
15 µg/mL
10 µg/mL
5 µg/mL
2,5 µg/mL
1 µg/mL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
13
Linearitas dan Rentang
Rentang kurva baku diperoleh dengan menambahkan tiga seri
konsentrasi
di atas titik tertinggi kurva baku dan tiga konsentrasi di bawah
titik terendah dari
seri konsentrasi baku yang telah ditetapkan. Tujuan dari
dibuatnya rentang kurva
baku adalah untuk memastikan respon instrumen terhadap analit
yang berada di
luar kurva tetap berada dalam rentang yang ditetapkan dan kadar
kurkumin dalam
analit tidak mengalami ekstrapolasi. Pada penelitian ini, seri
konsentrasi baku 0,05
µg/mL; 0,1 ng/mL; 0,5 µg/mL; 1 µg/mL; 2,5 µg/mL; 5 µg/mL; 10
µg/mL; 15
µg/mL; 20 µg/mL; 25 µg/mL; 30 µg/mL; 35 µg/mL; dan 40 µg/mL
digunakan
sebagai rentang. Data ketiga replikasi rentang dapat dilihat
pada Tabel III.
Tabel III. Data rentang
Konsentrasi
(µg/mL)
AUC
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
0,05 10751 9783 11199
0,1 17310 19974 18748
0,5 107333 107388 112155
1 196744 208490 208132
2,5 513113 481414 517977
5 981099 954252 1036290
10 1980578 2095571 2018970
15 2903036 3009783 2988214
20 4037150 4041326 4270044
25 4765075 4714627 5259697
30 6113689 6046586 6077211
35 6910579 6979475 6956811
40 7959603 7984655 7977384
Koefisien
korelasi
(r)
0,9996
0,9995
0,9994
Koefisien
determinasi
(R2)
0.9992
0,9990
0,9988
Dari data tiga replikasi rentang yang disajikan pada Tabel III,
digunakan
rentang replikasi pertama dengan nilai koefisien korelasi paling
mendekati 1,0.
Dari data rentang replikasi pertama diperoleh nilai koefisien
korelasi (r) sebesar
0,9996 dan koefisien determinasi (R2) sebesar 0,9992. Data hasil
penelitian
menunjukkan metode memiliki koefisien korelasi ≥ 0,99 (0,9996)
dan koefisien
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
14
determinasi ≥ 0,99 yaitu sebesar 0,9992 yang berarti peningkatan
konsentrasi
kurkumin mempengaruhi peningkatan AUC kurkumin sebesar 99,92%.
Kurva
kalibrasi standar baku kurkumin menunjukkan linearitas yang
sangat baik dan
koefisien korelasi yang tinggi selama rentang 0,05-40 µg/mL.
Dengan demikian,
dapat disimpulkan bahwa metode analisis kurkumin yang diuji
bersifat linear serta
peningkatan konsentrasi kurkumin memiliki pengaruh yang
signifikan terhadap
peningkatan AUC kurkumin.
Akurasi dan Presisi
Akurasi suatu metode ditunjukkan dengan nilai perolehan
kembali,
sedangkan presisi suatu metode ditunjukkan dengan nilai
koefisien variasi dari
tiga tingkatan konsentrasi yang berbeda. Nilai perolehan kembali
didapat dengan
menggunakan larutan ekstrak rimpang kunyit dan larutan ekstrak
rimpang kunyit
yang diadisi baku kurkumin. Nilai perolehan kembali ditetapkan
dengan paling
sedikit tiga konsentrasi (rendah, sedang, dan tinggi) dan paling
sedikit tiga kali
pengukuran tiap konsentrasi dengan penambahan baku kurkumin.
Pada penelitian
ini, dilakukan penentuan akurasi dan presisi intra-day dan
inter-day untuk
kuantifikasi kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit. Penambahan
baku kurkumin
dilakukan dengan tiga tingkatan konsentrasi, yaitu 1 µg/mL
(rendah), 10 µg/mL
(sedang), dan 20 µg/mL (tinggi). Penambahan baku kurkumin
dilakukan sebanyak
tiga replikasi untuk setiap tingkatan konsentrasi dan dilakukan
selama tiga hari
berturut-turut.
Gambar 5. Stacking kromatogram adisi baku kurkumin
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
17500
20000
22500
uV
Adisi baku kurkumin
Non adisi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
15
Tabel IV. Data intra-day akurasi dan presisi kurkumin
Senyawa
Intra-day
Konsentrasi
baku yang
ditambahkan
(µg/ml)
Konsentrasi
yang didapat
kembali
(µg/ml)
Perolehan
Kembali
(%)
RSD
(%)
Kurkumin
1,00 0,97 ± 0,016 97,03 1,65
10,00 9,78 ± 0,010 97,75 0,10
20,00 20,02 ± 0,045 100,08 0,22
Tabel V. Data inter-day akurasi dan presisi kurkumin
Senyawa
Inter-day
Konsentrasi
baku yang
ditambahkan
(µg/ml)
Konsentrasi
yang didapat
kembali
(µg/ml)
Perolehan
Kembali
(%)
RSD
(%)
Kurkumin
1,00 0,96 ± 0,025 96,11 2,59
10,00 9,78 ± 0,031 97,76 0,31
20,00 19,98 ± 0,409 99,88 2,00
Berdasarkan data perolehan kembali kurkumin yang disajikan pada
Tabel
IV dan Tabel V, nilai persen perolehan kembali intra-day dan
inter-day untuk
kurkumin adalah antara 97,03-100,08% dan 96,11-99,88% secara
berurutan.
Berdasarkan nilai-nilai tersebut, dapat disimpulkan bahwa metode
analisis
kurkumin yang diuji memenuhi parameter akurasi.
Berdasarkan AOAC 2019, suatu metode analisis yang duji
dikatakan
memenuhi parameter presisi ditunjukkan dari nilai persen
koefisien variasi atau
persen relative standard deviation. Berdasarkan data yang
disajikan pada Tabel
IV dan Tabel V, nilai persen koefisien variasi atau persen
relative standard
deviation intra-day dan inter-day untuk kurkumin adalah antara
0,10-1,65% dan
0,31-2,59% secara berurutan. Dengan demikian, dapat disimpulkan
bahwa metode
analisis kurkumin yang diuji memenuhi parameter presisi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
16
KESIMPULAN
Metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit
menggunakan
HPLC fase terbalik dengan kolom C18; fase gerak
asetonitril:metanol:air (65:5:30
v/v); laju alir 1,0 mL/menit yang telah dioptimasi dan
divalidasi pada penelitian
ini memiliki waktu retensi senyawa kurkumin yang lebih cepat
dengan
keterpisahan senyawa kurkumin dalam sampel ekstrak rimpang
kunyit yang
sepenuhnya terpisah sehingga jumlah senyawa kurkumin dapat
diukur secara
akurat, memiliki waktu kerja dan pemakaian fase gerak yang lebih
efisien
dibandingkan dengan metode yang pernah ada pada
penelitian-penelitian
sebelumnya serta memiliki linearitas, akurasi dan presisi yang
baik.
Metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit
menggunakan
HPLC fase terbalik dengan kolom C18; fase gerak
asetonitril:metanol:air (65:5:30
v/v); laju alir 1,0 mL/menit memenuhi parameter validitas
linearitas (r=0,9996
dan R2=0,9992), selektivitas (nilai resolusi pada ekstrak
rimpang kunyit
konsentrasi 0,5 µg/mL sebesar 1,531), akurasi intra-day dan
inter-day (persen
perolehan kembali adalah 97,03-100,08% dan 96,11-99,88% secara
berurutan)
serta presisi (persen relative standard deviation antara
0,10-1,65% dan 0,31-
2,59% untuk intra-day dan inter-day precision secara berurutan)
sehingga metode
analisis kurkumin yang diuji dapat digunakan untuk penetapan
kadar kurkumin
dalam ekstrak rimpang kunyit.
SARAN
Penelitian terkait penetapan kadar kurkumin dalam sampel
ekstrak
rimpang kunyit dapat menggunakan metode yang telah divalidasi
ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
17
DAFTAR PUSTAKA
Aggarwal, B.B., Bhatt, I.D., Ichikawa, H., Ahn, K.S., Sethi, G.,
Sundaram, C.,
Seeram, N., Shisodia, S., 2006. Curcumin-Biological and
Medicinal
Properties. Turmeric: The Genus Curcuma, 1(6), 297-368.
Ali, I., Haque, A., Saleem, K., 2014. Separation and
Identification of
Curcuminoids in Turmeric Powder by HPLC Using Phenyl Column.
Analytical Methods, 6(8), 2526-2536.
AOAC, 2019. AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of
Chemical
Methods for Dietary Supplements and Botanicals. 1-27.
BPOM, 2014. Pedoman Uji Klinik Obat Herbal. Badan Pengawas Obat
dan
Makanan Republik Indonesia.
Fonseca, B., Gremião, M.P.D., Chorilli, M., 2017. A Simple
Reversed Phase High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method for
Determination of
In Situ Gelling Curcumin-loaded Liquid Crystals in In Vitro
Performance
Tests. Arabian Journal of Chemistry, 10(7), 1029-1037.
Gandjar, I.G., Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi: Analisis.
Pustaka Pelajar,
Yogyakarta.
Gantait, A., Barman, T., Mukherjee, P.K., 2011. Validated Method
for Estimation
of Curcumin in Turmeric Powder. Indian Journal of Traditional
Knowledge,
10(2), 247–250.
Günzler, H., Williams, A., 2008. Handbook of Analytical
Techniques. Wiley-
VCH, Germany.
International Conference on Harmonization, 2005. Harmonized
Tripartite
Guideline Validation of Analytical Procedures: Text and
Methodology.
International Conference on Harmonization, Genova.
Jankun, J., Wyganowska, M., Dettlaff, K., JelinSka, A.,
Surdacka, A., Watróbska,
D., Jankun, E., 2016. Determining Whether Curcumin Degradation
is
Actually Bioactivation. International Journal of Molecular
Medicine, 37(5),
1151–1158.
Jayaprakasha, G.K., Jagan Mohan Rao, L., Sakariah, K.K., 2002.
Improved HPLC
Method for the Determination of Curcumin, Demethoxycurcumin,
and
Bisdemethoxycurcumin. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 50,
3668-3682.
Kazakevich, Y., LoBrutto, R., 2007. HPLC for Pharmaceutical
Scientists. Wiley-
Interscience, Hoboken.
Khismatrao, A., Bhairy, S., Hirlekar, R., 2018. Development and
Validation of
RP-HPLC Method for Simultaneous Estimation of Curcumin and
Piperine.
International Journal of Applied Pharmaceutics, 10(5), 43.
Meyer, V., 2010. Practical High-Performance Liquid
Chromatography, 5th
ed.
John Wiley and Sons Ltd, Switzerland.
Monton, C., Charoenchai, L., Suksaeree, J., Sueree, L., 2016.
Quantitation of
Curcuminoid Contents, Dissolution Profile, and Volatile Oil
Content of
Turmeric Capsules Produced at Some Secondary Government
Hospitals.
Journal of Food and Drug Analysis, 24(3), 493-499.
Murti, Y.B., Hartini, Y.S., Hinrichs, W.L.J., Frijlink, H.W.,
Setyaningsih, D.,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
18
2019. UV-Vis Spectroscopy to Enable Determination of the
Dissolution
Behavior of Solid Dispersions Containing Curcumin and Piperine.
Journal of
Young Pharmacists, 11(1), 26–30.
Narayani, S.S., Aravanan, S., Bharathiaraja, S. Mahendran, S.,
2016. Extraction,
Partially Purification and Study on Antioxidant Property of
Fucoxanthin
from Sargassum cinereum. Journal of Chemical and
Pharmaceutical
Research, 8(3), 610-616.
Phattanawasin, P., Sotanaphun, U., Sriphong, L., 2009. Validated
TLC-Image
Analysis Method for Simultaneous Quantification of Curcuminoids
in
Curcuma longa. Chromatographia, 69(3), 397–400.
Pulido, M., Moreno, J., Ramirez, C., Ramirez, M.C., 2016.
Curcumin and Health.
Molecules, 21(3), 1-22.
Setyaningsih, D., Murti, Y.B., Fudholi, A., Wouter, L.J.,
Mudjahid, R., Martono,
S., Hertiani, T., 2016. Validated TLC Method for Determination
of
Curcumin Concentrations in Dissolution Samples Containing
Curcuma longa
Extract. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 14(2), 147–157.
Setyaningsih, D., Murti, Y.B., Martono, S., Hinrichs, W.L.J.,
Hertiani, T.,
Fudholi, A., 2016. A Novel Reversed Phase High Performance
Liquid
Chromatography Method To Accurately Determine Low Concentrations
Of
Curcumin In Rat Plasma. International Journal of Pharmaceutical
and
Clinical Research, 8(5), 377–386.
Unites States Pharmacopeial Convention, 2017. The United States
Pharmacopeia
40 National Formulary 35 (USP40-NF35). Unites States
Pharmacopeial
Convention Inc, USA.
Wichitnithad, W., Jongaroonngamsang, N., Pummangura, S.,
Rojsittthisak, P.,
2009. A Simple Isocratic HPLC Method for the Simultaneous
Determination
of Curcuminoids in Commercial Turmeric Extracts. Phytochem.
Anal., 20(3),
314-319.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
19
Lampiran 1. Kromatogram rentang dan kurva baku kurkumin
1. Konsentrasi 0,05 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
20
2. Konsentrasi 0,1 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
21
3. Konsentrasi 0,5 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
22
4. Konsentrasi 1 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
23
5. Konsentrasi 2,5 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
24
6. Konsentrasi 5 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
25
7. Konsentrasi 10 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
26
8. Konsentrasi 15 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
27
9. Konsentrasi 20 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
28
10. Konsentrasi 25 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
29
11. Konsentrasi 30 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
30
12. Konsentrasi 35 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
31
13. Konsentrasi 40 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
32
Lampiran 2. Kromatogram perolehan kembali
1. Non Adisi replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
33
2. Adisi 1 (rendah) replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
34
3. Adisi 2 (sedang) replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
35
4. Adisi 3 (tinggi) replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
36
Lampiran 3. Kromatogram ekstrak rimpang kunyit konsentrasi 0,5
µg/mL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
37
Lampiran 4. Data AUC perolehan kembali dan presisi
Hari ke-1
Konsentrasi
(µg/mL)
AUC
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
Non Adisi 61.140 55.207 59.584
Adisi 1 255.555 270.817 266.107
Adisi 2 2.128.933 2.121.389 2.112.352
Adisi 3 4.314.040 4.284.998 4.297.718
Hari ke-2
Konsentrasi
(µg/mL)
AUC
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
Non Adisi 66.312 67.427 62.451
Adisi 1 264.025 267.789 269.075
Adisi 2 2.125.597 2.124.012 2.117.891
Adisi 3 4.271.521 4.290.006 4.282.694
Hari ke-3
Konsentrasi
(µg/mL)
AUC
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
Non Adisi 57.397 60.079 68.172
Adisi 1 257.957 268.193 261.569
Adisi 2 2.127.297 2.115.848 2.130.882
Adisi 3 4.193.744 4.102.837 4.419.138
Senyawa
Hari ke-1
Konsentrasi
baku yang
ditambahkan
(µg/ml)
Konsentrasi
yang didapat
kembali
(µg/ml)
Perolehan
Kembali
(%)
RSD
(%)
Kurkumin
1,00 0,96 ± 0,037 95,92 3,87
10,00 9,77± 0,039 97,67 0,40
20,00 20,10 ± 0,069 100,50 0,34
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
38
Senyawa
Hari ke-2
Konsentrasi
baku yang
ditambahkan
(µg/ml)
Konsentrasi
yang didapat
kembali
(µg/ml)
Perolehan
Kembali
(%)
RSD
(%)
Kurkumin
1,00 0,97 ± 0,012 97,25 1,28
10,00 9,77 ± 0,019 97,75 0,20
20,00 20,02 ± 0,044 100,08 0,22
Senyawa
Hari ke-3
Konsentrasi
baku yang
ditambahkan
(µg/ml)
Konsentrasi
yang didapat
kembali
(µg/ml)
Perolehan
Kembali
(%)
RSD
(%)
Kurkumin
1,00 0,95 ± 0,025 95,17 2,59
10,00 9,79 ± 0,037 97,85 0,38
20,00 19,81 ± 0,773 99,07 3,90
Contoh perhitungan perolehan kembali pada adisi 1 replikasi
pertama:
Persen perolehan kembali = (Cf – Cu) x 100/Cu
= (1,421 – 0,467) x 100/1
= 95,36%
Contoh perhitungan koefisien variasi pada adisi 1:
Koefisien variasi (CV) = SD/rata-rata x 100%
= 0,016/0,97 x 100%
= 1,65%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
39
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi yang berjudul Validasi Metode Analisis
High Performance Liquid Chromatography Fase
Terbalik Pada Penetapan Kadar Kurkumin Dalam
Ekstrak Rimpang Kunyit ini bernama lengkap Yosua
Agung Santoso. Penulis dilahirkan di Magelang pada
tanggal 11 Oktober 1997 sebagai anak pertama dari dua
bersaudara, dari pasangan Lewi Santoso Wibowo dan
Melasari Lestyodewi. Pendidikan formal yang telah
dienyam penulis yakni pendidikan tingkat Sekolah Dasar
di SD Kristen Indonesia Magelang (2003- 2009),
pendidikan tingkat Sekolah Menengah Pertama di SMP
Negeri 1 Magelang (2009-2012), dan pendidikan tingkat
Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 1 Magelang
(2012-2015). Penulis kemudian melanjutkan studi Strata-1 di
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2016. Selama
menempuh
pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Santa Dharma penulis
aktif dalam
berbagai kegiatan dan organisasi. Di bidang akademik, penulis
pernah menjadi
Asisten Dosen Praktikum Kimia Dasar 2017/2018, Asisten Dosen
Praktikum
Biokimia 2018/2019, dan Asisten Dosen Praktikum Kimia Analisis
2018/2019.
Selain itu pada tahun 2018, penulis pernah mengikuti lomba
Olimpiade Nasional
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam bagi Mahasiswa Perguruan
Tinggi (ON
MIPA-PT) Bidang Kimia Tahun 2018.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI