Validación de Métodos Analíticos

INTRODUCCIÓN A LA METROLOGÍA QUÍMICA

QUÍMICO LANDER PÉREZ

ESQUEMA DE UN ANÁLISIS COMPLETO

• Actualmente los laboratorios analíticos independientemente de que se dediquen a la investigación o estén vinculados a la industria se enfrentan diariamente a problemáticas mucho más complejas que hace varias décadas.

• El surgimiento de nuevos materiales implica la consideración de nuevas matrices y nuevos analitos. Si se enfoca esta realidad desde el punto de vista químico, encontramos una gran cantidad de materiales de diversa naturaleza y estado físico, que pueden estar compuestos por un número elevado de sustancias químicas, dentro de las cuales nos puede interesar uno, varios o todos los componentes, los cuales pueden estar presentes a su vez en diferentes concentraciones.


Lo ideal sería contar con un método analítico que requiera del mínimo número de operaciones, con el mínimo de muestra, en el cual el resultado pueda ser obtenido de forma rápida y a bajo costo y que cuente con adecuados criterios de calidad.


• En la práctica nos enfrentamos a múltiples dificultades entre las que podemos citar la complejidad de la matriz.

• Otra dificultad muy común es no contar con una metodología apropiada que se ajuste perfectamente a nuestra situación( nos obliga a adoptar procedimientos ya reportados en la literatura científica, o a cambiar algunos de los pasos fundamentales.)

• Por otra parte cada vez aumentan más las exigencias de calidad para la aceptación de un método analítico, lo que exige esfuerzo y un riguroso tratamiento estadístico que permita considerar el resultado como confiable.

• Factores tan importantes como son el tiempo y el costo del análisis. En ocasiones se nos exigen resultados rápidos, por lo que al diseñar la metodología del análisis debe contemplarse este aspecto. El costo es también esencialmente importante, sobre todo en nuestras condiciones.


• El camino que conduce al conocimiento de la composición total o parcial de una matriz requiere indiscutiblemente de esfuerzo intelectual, aptitud, experiencia, intuición y sobre todo de un adecuado criterio químico analítico. Este criterio tiene muchas veces más peso que la disponibilidad de grandes y costosos instrumentos.

• La solución es llegar a una metodología analítica que permita transformar el material en una muestra medible y que a su vez obtengamos resultados que puedan considerarse confiables.

ERRORES EN EL ANÁLISIS CUANTITATIVO

• Por más minuciosamente que se efectúa una determinación cuantitativa, el resultado obtenido, como regla, siempre difiere algo del contenido verdadero de la sustancia estudiada, es decir, está afectado por un cierto error.


CLASIFICACIÓN:

1. Errores determinados o sistemáticos

2. Errores indeterminados o accidentales.


Errores determinados o sistemáticos :

Son los errores del mismo signo debidos a causas definidas que influyen en el resultado, aumentando o disminuyéndolo. Estos errores generalmente se puede prever y eliminar o efectuar correcciones correspondientes.

• Errores del método (particularidades del método)

• Errores debido a los instrumentos y a los reactivos empleados

• Errores de operación (operaciones analíticas)

• Errores personales


2. Errores indeterminados o accidentales.

Estos errores se manifiestan en las pequeñas diferencias de los resultados en las determinaciones repetidas de cierto elemento en la muestra dada, efectuadas por un mismo método.

No se pueden tener en cuenta ni eliminar, introduciendo ciertas correcciones.

Es posible disminuirlos apreciablemente, aumentando el número de determinaciones paralelas.

La tarea del análisis es encontrar el valor más probable de la magnitud que se determina y evaluar la precisión del resultado obtenido (desviación estándar).

ENFOQUE ANALÍTICO

A la cadena de operaciones que se construye a partir del cuestionamiento de aspectos esenciales para la realización del análisis, es la base del denominado “Enfoque Analítico”.

ENFOQUE ANALÍTICO

• ¿Qué especie (o especies) quiero medir y en que matriz se encuentran?

• ¿En qué rango de concentraciones están presentes?

• ¿Qué operaciones o procesos químicos, físicos o biológicos pueden afectar la concentración o la estabilidad de las especies objeto de estudio?

• ¿Qué técnica analítica es la adecuada para el estudio de dichas especies?

• ¿Qué componentes propios de la matriz pueden constituir interferencias en el análisis?

• ¿Qué nivel de precisión y exactitud requiere el método analítico para cumplimentar el objetivo propuesto?

• ¿Qué materiales y equipos se necesitan para ejecutar el proyecto?


Se define como una serie de etapas y operaciones comunes a cualquier método analítico, que es necesario considerar a la hora de realizar el análisis:

ETAPAS

• Definición de los objetivos

• Selección del método analítico

• Muestreo

• Preparación de la muestra

• Determinación

• Cálculos, reporte e interpretación de los resultados.

DEFINICIÓN DE LOS OBJETIVOS.

• La definición de los objetivos es la etapa que permite trazar la estrategia de análisis sobre la base de las respuestas a las primeras interrogantes que habíamos planteado:

• ¿Qué especies se van a determinar, o lo qué es lo mismo, quién o quienes son los analitos?

• ¿En qué matriz se encuentran?

• ¿Qué tipo de análisis necesito realizar? En este caso nos estamos refiriendo a definir si es necesario realizar una cuantificación o si la simple detección cualitativa es suficiente.

• Para analistas experimentados esta etapa pudiera parecer trivial, sin embargo en el caso de los estudiantes, o de analistas de poca experiencia es necesario dejar clara la diferencia entre objetivo analítico y el problema a resolver.

SELECCIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO.

La selección del método analítico ha sido considerada siempre como una de las etapas de mayor importancia en el esquema de un análisis completo. Para la correcta selección del método adecuado para la realización de un análisis es necesario considerar diferentes aspectos tales como:

• Características del analito

• Características de la matriz

• Validación del método analítico

• Características del analito:

En este sentido debemos considerar la naturaleza química y las propiedades físico químicas del componente que se desea cuantificar. No existe ningún método analítico universal, es decir que sea aplicable a la determinación de toda clase de analitos.

• Características de la matriz:

Obviamente dentro de las características importantes a considerar está el estado de agregación y la complejidad de la matriz. No es lo mismo realizar un análisis sobre un producto líquido que sobre uno sólido, puesto que la matriz ha de sufrir diferentes tratamientos en función de su estado de agregación. Así mismo, estos tratamientos serán más engorrosos en la medida que la matriz sea más compleja, es decir, posea un mayor número de componentes, puesto que entonces el método seleccionado ha de ser más específico a fin de determinar solo aquella sustancia que interesa (analito) en presencia de un gran número de otras sustancias que coexisten en la matriz.

Validación del método analítico:

El término validación está directamente relacionado con la palabra calidad. En términos generales validación es el programa mediante el cual se establecen los requisitos óptimos para cumplimentar el objetivo propuesto. De hecho pueden ser validados los métodos analíticos, los instrumentos, el personal etc. y en este sentido aumentan cada día más las exigencias a nivel internacional.

VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO• La validación del método analítico es el proceso que permite establecer qué

características del funcionamiento del método analítico son adecuadas para la aplicación que se pretende.

• El objetivo principal de la validación analítica es el de asegurar que un procedimiento analítico dará resultados reproducibles y confiables que sean adecuados para el propósito previsto.

VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO• Hay importantes razones para validar los métodos de análisis.

1. En primer lugar la validación es una parte integral del desarrollo de un método analítico,

2. Las Buenas Prácticas de Elaboración así lo exigen.

3. Desde el punto de vista comercial los métodos validados permiten obtener datos fiables por lo que se facilitan las transacciones comerciales basadas en la aceptación mutua de los resultados.

VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO

Los requisitos o criterios de validación que debe cumplir un método analítico y que deben ser determinados en el procedimiento de validación, según lo estipulado por diferentes organizaciones internacionales son los siguientes.• Exactitud (Precisión y Veracidad o Justeza)• Selectividad• Linealidad• Sensibilidad de calibrado• Límite de detección y límite de cuantificación• Robustez

1. EXACTITUD

La Exactitud indica la capacidad del método analítico para dar resultados lo más próximo posible a un valor verdadero.

Se define según la norma ISO 5725-1 (1994) como la proximidad de concordancia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia aceptado.(concepto cualitativo)

PRECISIÓN

• Es el grado de correlación o cercanía entre los resultados analíticos individuales que se obtienen al aplicar repetidamente el método a varias muestras, de una homogénea común.(errores aleatorios)

PRECISIÓNLa necesidad de considerar este parámetro surge debido a que las determinaciones analíticas que presumiblemente se realizan con idénticos materiales e idénticas condiciones de trabajo, en general, no arrojan idénticos resultados. Esto se atribuye a los inevitables errores aleatorios inherentes a cada proceso de determinación dado que los factores que influyen sobre el resultado de una determinación no pueden ser controlados completamente.

Diferentes factores pueden contribuir a la variabilidad de los resultados de un método de determinación. Estos incluyen:

• El analista

• El equipamiento utilizado

• La calibración del mismo

• El medio ambiente (temperatura, humedad, contaminación del aire, etc.)

• El tiempo que separa la realización de las mediciones

PRECISIÓN

La precisión puede expresarse en dos niveles:

• Repetibilidad:

Es la precisión entre determinaciones independientes realizadas en las mismas. Se lleva a cabo sobre la base de un número suficiente de determinaciones de una mezcla homogénea del producto. Los ensayos en este contexto, son los análisis independientes de muestras que han pasado por todo el procedimiento analítico, desde la preparación de la muestra hasta los resultados de las pruebas finales. La repetibilidad describe la variabilidad mínima del proceso analítico.

• Reproducibilidad:

Es la precisión entre determinaciones independientes realizadas bajo diferentes condiciones. La reproducibilidad describe la máxima variabilidad de un procedimiento analítico ya que incluye el estudio en diferentes condiciones.

PRECISIÓN

Para llevar a cabo los estudios de Repetibilidad y Reproducibilidad generalmente esta reconocida la realización de al menos 7 determinaciones para cada uno (IUPAC, 2002); aunque se conoce que la estimación de la precisión puede mejorarse incrementando en numero de determinaciones en la muestra. También pueden realizarse estudios de Reproducibilidad Interlaboratorios, los cuales reflejan la medida de competencia técnica que presentan los centros de donde se obtendrán los resultados.

PRECISIÓN

• Los valores de coeficiente de variación reportados para que un método analítico sea considerado preciso, se mueven en rangos mas o menos amplios en la literatura científica que aborda esta temática.

Tipo de método CV permisible

Cromatográficos < 2 %

Químicos y espectrofotométricos < 3 %

Microbiológicos < 5 %

VERACIDAD O JUSTEZA

• Indica la capacidad del método analítico para dar resultados lo más próximo posible al verdadero valor. Si la diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero es pequeña, la exactitud es buena. Una diferencia grande significa que la exactitud es inadecuada y revela la existencia de errores determinados que deberían corregirse (expresado como %R).

VERACIDAD O JUSTEZA

• La determinación del %R se puede llevar a cabo a través de tres procedimientos:

• A.) análisis repetido de una muestra de concentración única conocida,

• B.) método de adición de patrón y

• C.) comparación con otro método analítico ya validado.

VERACIDAD O JUSTEZA

• A.) análisis repetido de una muestra de concentración única conocida,

La muestra generalmente será una solución de concentración conocida formada por adición de una cantidad única de patrón de analito.

Esta solución se analiza varias veces (n = 6 ó 10) por el método que se evalúa y se calcula el % de recuperación.

VERACIDAD O JUSTEZA

• A.) análisis repetido de una muestra de concentración única conocida,(9.09)

Este procedimiento posee el inconveniente de realizar el análisis en una solución patrón del analito y no sobre la matriz, por lo que no considera la influencia de posibles sustancias interferentes que pudieran existir en la matriz.

Resultados obtenidos para 8 repeticiones. (mg vitaminaC/100 mL)

Valor real (mg/100mL)

9,05 9,16 9,21 8,91 9,11 8,95 9,09 9,25 10

VERACIDAD O JUSTEZA

B) Método de adición de patrón.

En este caso se trabaja con el extracto del analito obtenido de la matriz original por un procedimiento adecuado. De esta solución se toman como mínimo dos alícuotas, a una de ellas se le añade una cantidad conocida de un patrón de referencia del analito, y ambas se analizan en paralelo.

Los resultados obtenidos de ambas determinaciones se procesan y la diferencia indica la cantidad cuantificada del patrón añadido por el método en cuestión.

VERACIDAD O JUSTEZA

Un patrón de referencia es una sustancia de elevada pureza y estructura y composición idénticas al analito que se determina. Así por ejemplo, un patrón de referencia de la vitamina C consiste en ácido ascórbico altamente puro. Hoy en día se comercializan patrones de referencia para casi todas las sustancias conocidas y usualmente se adquieren a altos precios.

VERACIDAD O JUSTEZA

C) Comparación con otro método analítico ya validado.

• Otra posibilidad para conocer la exactitud de un método analítico es la comparación de los resultados obtenidos por este, con los resultados obtenidos a través de otro método ya validado.

• En este procedimiento se parte de una muestra homogénea que se analiza repetidamente (n > 6) por el método analítico nuevo y por el método de referencia.

2. SELECTIVIDAD

• La selectividad o especificidad se define como la capacidad de un método analítico para medir exacta y específicamente el analito, sin interferencia de impurezas u otros componentes que puedan estar presentes en la muestra.

• La selectividad es una condición esencial para conseguir una buena exactitud, por lo que constituye un criterio clave en la validación de un método analítico.

• La selectividad depende de las características del propio método analítico y de las características de la muestra (matriz) que se analiza.

3. LINEALIDAD

• Se entiende por Linealidad la capacidad de un método analítico de obtener resultados proporcionales a la concentración de analito en la muestra dentro de un intervalo determinado.

• El ensayo de Linealidad puede efectuarse tanto sobre soluciones de concentraciones crecientes del analito que se determina o sobre muestras problemas a las que se han adicionado cantidades crecientes de un patrón del analito. En ambos casos el procedimiento se conoce como “curva de calibración” o “curva de calibrado”.

CURVAS DE CALIBRACIÓN EN LOS MÉTODOS ANALÍTICOS

• Una curva de calibración es la representación gráfica de una señal que se mide en función de la concentración de un analito. La calibración incluye la selección de un modelo para estimar los parámetros que permitan determinar la linealidad de esa curva. y, en consecuencia, la capacidad de un método analítico para obtener resultados que sean directamente proporcionales a la concentración de un compuesto en una muestra, dentro de un determinado intervalo de trabajo.


• En el procedimiento se compara una propiedad del analito con la de estándares de concentración conocida del mismo. Para realizar la comparación se requiere utilizar métodos y equipos apropiados para la resolución del problema de acuerdo al analito que se desee determinar.


• La etapa de calibración analítica se realiza mediante un modelo de línea recta que consiste en encontrar la recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de “n” puntos experimentales, donde cada punto se encuentra definido por una variable “x” (variable independiente, generalmente concentración del analito de interés) y una variable “y” (variable dependiente, generalmente respuesta instrumental).

y = mx + b .


• A partir de la curva de calibración y a fin de asegurar que la recta encontrada con los puntos experimentales se ajuste correctamente al modelo matemático de la ecuación se calculan los valores de la ordenada al origen, la pendiente y el coeficiente de determinación (r2).


• Por tener una buena exactitud y confiabilidad estadística, el método más empleado para encontrar los parámetros de la curva de calibrado es el método de los mínimos cuadrados Este método busca la recta del calibrado que haga que la suma de los cuadrados de las distancias verticales entre cada punto experimental y la recta de calibrado sea mínima o tienda a cero. A la distancia vertical entre cada punto experimental y la recta de calibrado se le conoce como residual.


• En la práctica para construir la curva de calibración se utilizan disoluciones que contienen concentraciones conocidas de analito, llamadas disoluciones patrón o estándar. Los estándares o disoluciones patrón para construir la recta de calibrado deben ser preparadas en forma independiente, a partir de una o varias soluciones madre; el número de puntos a escoger dependerá del uso que se dé a la recta de calibrado.


• La verificación del comportamiento de un analito mediante una curva de calibración requiere un mínimo de cinco puntos para un intervalo de confianza del 95 % y de ocho puntos para uno del 99 %.


• BLANCO. Definido por IUPAC como la lectura resultante originada por la matriz, los reactivos o cualquier otra medida residual debida al instrumento a al proceso de medición, que contribuye al valor obtenido en el proceso analítico para el mensurando.

• Los blancos miden la respuesta del procedimiento analítico a las impurezas o especies interferentes que existan en los reactivos o, simplemente, a las especiales características del instrumento de medida.


Independientemente de la técnica instrumental responsable de la señal analítica los parámetros que se determinan a partir de las curvas de calibración obtenidas con cualquiera de ellas son:

• linealidad

• la sensibilidad

• límite de detección

• límite de cuantificación

• intervalo analítico


• Linealidad del sistema de medición

La linealidad de la curva de calibración es un requerimiento fundamental en la práctica del análisis químico cuando se realizan curvas de calibración. En general la linealidad no se cuantifica pero se observa por simple inspección o mediante pruebas significativas de no linealidad. (r2>0,98)


• Sensibilidad.

La sensibilidad de método mide su capacidad para discriminar entre pequeñas diferencias en la concentración del analito. Dos factores limitan la sensibilidad. la pendiente de la curva de calibración y la precisión del sistema de medida.

Para dos métodos que tengan igual precisión, el que tenga la mayor pendiente será el más sensible


• Límite de detección (LD).

En general este término se define como la mínima concentración del analito detectable por el método. Su determinación es importante pero los problemas asociados con ella son diversos; estos problemas han sido estadísticamente estudiados y varios criterios de decisión han sido propuestos. Aunque ninguno es universal uno de los más aceptables es el de la concentración que correspondería a la medida del “promedio del blanco+ 3s”.


• Límite de cuantificación (LC)

Llamado también límite de determinación, se define como la más pequeña concentración del analito que puede ser determinada con un nivel de exactitud y precisión aceptables. Dependiendo del convenio utilizado se considera como la concentración de analito que corresponde al valor del promedio del blanco mas 5, 6 o 10 veces la desviación estándar del mismo.


• Intervalo analítico.

Está definido como el intervalo de concentración en que el analito puede ser determinado mediante la utilización de la curva de calibración; se considera que es el comprendido entre el límite de cuantificación hasta la concentración en la cual se pierde la linealidad de la curva


Albúmina sérica.Se conoce que el promedio de 10 mediciones del blanco fue 0.015 con una desviación estándar de 0.002 En esta curva se observa linealidad hasta valores de absorbancia iguales a 0.4; este valor corresponde a una concentración igual a 0,0207 mol//L El coeficiente de correlación de la curva considerando únicamente estos cuatro puntos es igual a 0,9987 mientras que si se consideraran todos ellos el coeficiente de correlación sería igual a 0,9382.

• Robustez

El estudio de robustez investiga la influencia de pequeños cambios en las condiciones analíticas sobre la fiabilidad del método analítico, localizando los factores que originan fluctuaciones menores y los que necesitan una atención especial por cuanto originan variaciones significativas.

Esto se realiza cuando se precisa un estudio completo de reproducibilidad, como es caso de un estudio interlaboratorios, por lo que el laboratorio que ha desarrollado el método analítico debe efectuar previamente el estudio de robustez.

Validación de Métodos Analíticos

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