VALİDASYON DERS2017 [Uyumluluk Modu]

26.12.2017

1

VALİDASYON

Prof. Dr. A. Olcay Sağırlı

Yöntemin Geçerliliği (Validasyon)

Geçerlilik, (Validasyon) cihazın, metodun veya ölçüm prosedürünün

belirlenen amaçlara uygunluğunun objektif olarak test edilerek yazılı

delillerle kanıtlanmasıdır.

ALETLİ ANALİZLERDE YAPILMASI GEREKLİ VALİDASYON TÜRLERİ

1. Cihazın kontrolü ve validasyonu, (tüm donanım ve yazılımlar için

geçerlidir)

2. Geliştirilen yöntemin geçerliliğini kanıtlamak için veya geliştirilmiş olan bir yöntemdeki parametre değişikliklerinden sonra yapılan validasyon

3. Sistem Uygunluk Testleri (SUT).

26.12.2017

2

Cihaz validasyonu cihaz sağlayıcı tarafından yapılmak zorundadır.

•İyi laboratuar uygulamaları (GLP),

•İyi imalat teknikleri (GMP) ve/veya

•ISO 9000

vb. standartlara göre valide edilmiş bir ortamda geliştirmek ve

üretmekle sorumludurlar.

Analitik Metot validasyonu, bir metodun performansını belirlemek

için yapılan bir takım değişkenlere göre test ve ölçme işlemleridir.

Çeşitli alanlarda verilen pek çok karar, yapılan ölçümlerin sonucuna

dayanılarak verilir. Doğru karar verebilmek için analitik ölçüm

sonucunun doğru ve tekrarlanabilir olması gerekir.

26.12.2017

3

Metot validasyonu hangi hallerde yapılır:

Standart bir metot bir laboratuvarda ilk defa uygulanacağı zaman

Bir analiz için yeni metot geliştirildiği zaman

Kullanılan metotta değişiklik yapıldığında

Geçerliliği belirlenmiş bir metot başka bir laboratuvarda kullanılacağı

zaman veya farklı bir kişi veya farklı bir cihazla kullanılacağı zaman

Metodun performansında zamanla bir değişme olduğu

anlaşıldığında metot geçerliliği (validasyonu) yapılır.

Uluslar arası kabul edilen çeşitli geçerlilik (validasyon) kriterleri

mevcuttur. ISO/IEC, ICH, US EPA, US FDA, USP, cGMP gibi

kurumlar tarafından belirlenmiş kriterler kullanılmaktadır.

USP ve ICH validasyon parametreleri

USP Bölüm 1225>,

ICH Q2A, Validasyon ve Analitik yöntemlerle ilgili belge (Mart 1995) ve

Q2B Analitik yöntemlerde validasyon (Mayıs 1997)

EMEA, The European Agency for the Evaluotion of Medicinal Products, 1998

USP ye göre; Seçicilik, Doğrusallık ve aralık, Doğruluk, Kesinlik, Gözlenebilme

sınırı, Tayin alt sınırı, Sağlamlık ve Kararlılık

ICH e göre; Seçicilik, Doğrusallık, Aralık, Doğruluk, Kesinlik, Gözlenebilme

sınırı, Tayin alt sınırı, Stabilite

26.12.2017

4

Yöntemin Kalibrasyonu:

Gravimetri ve kulometri hariç bütün Analitik yöntemler için kalibrasyon

gerekir. Yöntemin kalibrasyonu ölçülen analitik sinyal ile analit derişimi

arasındaki ilişkinin belirlenmesidir. En çok kullanılan üç yöntem

a) Kalibrasyon grafiği yöntemi

b) Standart ekleme yöntemi

c) İç standart ekleme yöntemi

Geçerlilik (Validasyon) Parametreleri:

Performans karakteristikleri için öncelikle aşağıdaki temel geçerlilik

(validasyon) parametrelerinin belirlenmesi gerekir. Uygulanamayan

parametreler varsa “uygulanamaz” ifadesi kullanılır. Yönteme spesifik farklı

parametrelerin de değerlendirilmesi gerekiyorsa onlar da eklenir.

Doğruluk (Accuracy)

Kesinlik (Precision)

Özgünlük (Specifity)

Doğrusallık (Linearity)

Gözlenebilme sınırı (LOD; Limit of Detection)

Tayin sınırı (LOQ; Limit of Quantification)

Çalışma Aralığı (Range)

Tutarlılık (Ruggedness)

Sağlamlık ya da Kararlılık (Robustness)

Stabilite

26.12.2017

5

Özgünlük (Specifity)

veya Seçicilik

(Selectivity) Doğrusallk

(Linearity)

Çalışma Aralığı

(Range)

Doğruluk (Accuracy)

ve Geri kazanım

(Recovery)

Kesinlik (Precision) ya da

Tekrarlanabilirlik(Repeatibility) ve

Uyarlık (Reproducibility)Gözlenebilme

sınırı (LOD; Limit of

Detection)

Tayin sınırı (LOQ; Limit of Quantification

)

Tutarlılık (Ruggednes)

Sağlamlık ya da Kararlılık

(Robustness)

Stabilite

Validasyon Parametreleri:

Özgünlük (Specificity):

Beklenen fiziksel/kimyasal girişimler/engelleyiciler (interferences)

varlığında analitik yöntemin sadece amaçlanan bileşen veya bileşenleri

doğru şekilde ölçülebilme yeteneğidir.

Girişime neden olabilecek ve matrikste bulunan maddeler standart üzerine

eklenerek girişime neden olup olmadığı kontrol edilir. Referans madde

geçerliliği belirlenen metotla analiz edilerek bulunan sonuçlar sertifika

değeri ile karşılaştırılır.

Girişime neden olabilecek ve matrikste bulunan maddeler elimizde yoksa

Diyod Sıralı Dedektör veya Kütle Dedektörü gibi özel donanımlarla

girişimler incelenebilir.

26.12.2017

6

Kromatografik Analizlerde Özgünlüğün Saptanması:

1) Tayini yapılan bileşik ile girişim yapması olasılığı bulunan maddelerin

“Ayırım gücü” (Rs) değerlerine bakılır. Bu değer (Rs)≥2.0 olmalıdır.

2) Spesifik bir dedektör seçilebilir. İncelenecek bileşiğe cevap verme

yeteneğine sahip olan dedektörler Elektrokimyasal veya Radyoaktivite

dedektörleridir. Bu dedektörler belirli maddelere karşı duyarlıdır.

3) LC-MS gibi duyarlı ve hassas tekniklerle, DAD dedektörü ile değişik

dalga boyunda deney anında taramalar yaparak herhangi ilave bir pik olup

olmadığı kontrol edilir.

Doğruluk (Accuracy) :

Ölçülen değerin doğru ya da doğru kabul edilen değere yakınlığını gösterir.

Mutlak hata ya da bağıl hata ile verilir. Uluslar arası bağımsız

laboratuvarlar tarafından tayin edilmiş değerleri doğru değer olarak kabul

edilen Standart Referans Maddelerin tayininden elde dilen sonuç ile aynı

maddenin kullanılan yöntemle elde edilen sonuçları karşılaştırılır.

Bir yöntem için doğruluk, geri kazanım çalışmaları ile belirlenir:

a) Referans standart bir yöntemle karşılaştırmak,

b) Boş matriks ortamına analizi yapılan maddeyi ilave etmek,

c) Analizi yapılan maddeye bulunduğu ortamda standart ekleme yöntemi ile saf madde ilavesidir.

% Gerikazanım = (Cu / Cs) x 100

Cu= Çalışma sonucunda bulunan konsantrasyon

Cs= Bilinen ya da standart çalışma sonucunda elde edilen konsantrasyon

26.12.2017

7

a) Referans Standart İle Karşılaştırmak:

Üç farklı konsantrayonda hazırlanan çözeltilerden üçer ölçüm alınır,

hesaplanan konsantrasyon değerlerinden % geri kazanım değerleri bulunur,

sonra bu değerlerin ortalamaları alınır.

Sonuçlar referans olarak seçilen başka bir yöntemden elde edilen

sonuçlarla istatistiksel olarak karşılaştırılır (Student t, Fisher testleri gibi).

Ortalamalar yönünden Student t testi

Varyans yönünden Fisher testi

b) Boş matriks ortamına analizi yapılan maddeyi ilave etmek:

Farmasötik dozaj formları gibi matriks etkisi olan numunelerle

çalışıldığı zaman kullanılan bir yöntemdir.

Analizi yapılacak madde boş matrikse değişik derişimlerde eklenir.

Bu matriks ilaç dozaj formları için (etken maddesiz) yardımcı maddelerden

oluşan karışımdır (Plasebo).

Genellikle ilaç etken maddesinin % 50, 75, 100, 125 ve 150

oranında madde ilavesi yapılır ve her seviyede en az üçer ölçüm yapılır.

Sonuçlar % geri kazanım olarak ifade edilir.

26.12.2017

8

c) Standart ekleme yöntemi ile saf madde ilavesi:

Analizi yapılacak maddenin bilinen ve değişik miktarları matriks

içerisinde yer alan ve miktarı aynı maddenin üzerine ilave edilir. Orijinal

numunedeki etken madde derişimi deney verilerinden matematiksel olarak

hesaplanır.

Genellikle % 25, 50, 100 ilave etmek iyi bir yaklaşımdır. Madde

ilave edilmiş ve ilave edilmemiş bütün numuneler en az üçer defa analiz

edilir.

Sonuçlar ilave edilen ve ölçülen madde miktarları verilerek ifade

edilir. Bu yöntem, matriksin numune sinyaline girişim yaptığı durumlarda,

katkı maddelerinin ve yardımcı maddelerin bilinmediği durumlarda tercih

edilir.

26.12.2017

9

Kesinlik

Ölçüm sonuçlarının birbirlerine yakınlığını (tekrarlanabilirliği) gösterir.

Standart sapma, Bağıl standart sapma, Varyans veya varyasyon katsayısı

ile verilir.

Kesinlik 3 gruba ayrılarak incelenmektedir

a) Tekrarlanabilirlik (Gün içi tekrarlanabilirlik),

b) Orta-Kesinlik (Günler arası tekrarlanabilirlik)

c) Tekrar Üretilebilirlik (Reproducibility)

26.12.2017

10

a) Tekrarlanabilirlik:

Aynı gün, aynı laboratuar, aynı araştırmacı, aynı cihaz ile 5-6 paralel tayin

2-3 farklı derişimle yapılır. Sonuçların RSD değerleri kıyaslanır.

*Enjeksiyonun tekrarlanabilirliği,

Analizi yapılacak maddenin çalışma ortamındaki çözeltisi hazırlanır ve bu

çözeltiden en az 10 enjeksiyon yapılır. Sonuçta, kesinlik elde edilen

değerlerin % RSD’si verilerek ifade edilir ve % RSD ≤ 1.0 olmalıdır.

b) Orta-Kesinlik:

Farklı günlerde, aynı laboratuar, aynı araştırmacı, aynı cihaz ile 5-6 paralel

tayin 2-3 farklı derişimle yapılır. Sonuçların RSD değerleri kıyaslanır.

c) Tekrar Üretilebilirlik (Reproducibility):

Çok ortaklı çalışmalarda laboratuarlar arası kesinliğin tayini için istenen bir

parametredir.

26.12.2017

11

26.12.2017

12

Gözlenebilme sınırı (LOD; Limit of Detection):

Analizi yapılan örneğin belirdiği fakat kantitatif sınırlar içerisine girmeyen en düşük derişimdir.

Doğrudan yapılan deneylerden veya hesapla bulunabilir. Doğrudan yapılan deneylerden gözlenerek hesaplamada HPLC’de Sinyal/Gürültü oranı 3 olarak kullanılır.

Hesaplama yolu ile Teşhis Sınırı saptanmasında;

LOD= 3.3 x SD/ m eşitliği kullanılır.

SD= Boş çözeltinin; çok az derişimdeki madde çözeltisinin veya kesişimdeğerinin standart sapması,

m= Kullanılan kalibrasyon eşitliğinin eğim değeridir.

Tayin sınırı (LOQ; Limit of Quantification):

Analizi yapılan örneğin kabul edilebilir düzeyde kesin ve doğru olarak miktarının tayin edilebileceği doğrusallık sınırları içerisine girmeyen veya doğrusallığın en alt derişimini oluşturan düzeyidir. Doğrudan yapılan deneylerden veya hesapla bulunabilir.

Doğrudan yapılan deneylerden gözlenerek LOQ tespiti için Sinyal/Gürültüoranı 10 olarak alınır.

Hesaplama yolu ile TAS saptanmasında

LOQ= 10 x SD/ m eşitliği kullanılır.

SD ve m değerleri LOD eşitliği ile aynıdır.

26.12.2017

13

Doğrusallık (Linearity):

Analit derişime karşı dedektör cevabın doğru orantılı olarak artması ve çizilen grafikte noktaların doğru üzerinde veya yakın olarak yer almasıdır.

Eğim, kesişim ve korrelasyon katsayısı (R2) doğrusallığı veren parametrelerdir. R2 = 0.999 ve üzerinde olmalı ve değerler çizilen doğrunun üzerinde yer almalıdır.

y = 0,4678x + 0,0022

R2 = 0,9999

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Derişim

Sin

yal

26.12.2017

14

Çalışma Aralığı (Range):

Kalibrasyon eğrisinde tayin edilebilen en düşük derişimden, doğrusallıktansapma gösterdiği derişime kadar olan derişim aralığını kapsar.

Hedef miktarın % 50, 75, 100, 125 ve 150 olacak şekilde aralıkdüzenlenebilir.

LOD: Limit of Detection; Gözlenebilmesınırı

LOQ: Limit of Quantification; Tayin altsınırı

LOL: Limit of Linearity; Doğrusallık Limiti

Sağlamlık ya da Kararlılık (Robustness):

Yöntemin, parametrelerdeki ufak değişimlerden etkilenmeden kalabilmekapasitesidir.

Bu parametreler organik çözücü yüzdesi, pH, iyonik güç, sıcaklık gibietkenlerdir.

Kararlılık yöntem geliştirilirken değerlendirilmesi gereken bir aşamadır.

Örneğin pH 3 de ± 0.1 kadar bir değişim gösteren bir madde pH 4.5 dadeğişmeden aynı sonucu veriyorsa pH 4.5 ortam olarak seçilmelidir.

26.12.2017

15

Tutarlılık (Ruggedness):

Yöntemin gerçek kullanım koşulları altında tekrar edilebilirliğininsaptanmasıdır. Bunun için çalışmanın:

a) Aynı laboratuvarda farklı analizciler tarafından,

b) Aynı laboratuvarda farklı cihazlar tarafından,

c) Farklı laboratuvarlarda gerçekleştirilmesi,

d) Reaktif ve çözücülerin markalarının değiştirilmesi,

e) Aynı marka ve modele sahip yeni bir kolon kullanaraktekrarlanması gereklidir.

Tutarlılık; Orta kesinlikle de benzeşmektedir. % RSD ile ifade edilir. ICH(Uluslar arası uyum konferansı) bunu yapılması kesin olarak zorunluişlemler grubuna dahil etmemiştir.

26.12.2017

16

Stabilite:

Zorunlu bir validasyon parametresi olmamakla beraber yapılması tavsiye

edilir.

Tekrar edilebilir ve güvenilir sonuçlar elde edebilmek için numunelerin,

standart maddelerin ve kullanılan çözücülerin uygun bir süre (örneğin 1

gün, 1 hafta, 1 ay veya ne kadar süreye ihtiyaç duyuluyorsa o kadar süre)

stabilitesini koruması gereklidir.